顺铂、维拉帕米和环孢菌素诱导卵巢癌细胞凋亡的研究

目的 探讨顺铂（ＤＤＰ）,维拉帕米（ＶＰ）及３′－酮基－去甲基苏氨酸１－缬氨酸２－环孢菌素（ＰＳＣ８３３）诱导卵巢癌细胞凋亡的作用机理。方法 以人卵巢癌亲代细胞株ＣＯＣ１及其耐ＤＤＰ亚细胞株ＣＯＣ１／ＤＤＰ为材料,根据所加药物的不同分为ＤＤＰ组,ＶＰ组,ＰＳＣ８３３组,ＤＤＰ联合ＶＰ组,ＤＤＰ联合ＰＳＣ８３３组和对照组,计算各组细胞生长抑制率,细胞凋亡率同时进行细胞周期分析。结果 ＤＤＰ联合ＶＰ组     

顺铂诱导人卵巢癌AO10／17细胞凋亡的实验研究

目的 探讨顺铂是否通过诱导肿瘤细胞凋亡而抑制肿瘤生长，以及细胞凋亡和细胞周期、细胞内外钙离子浓度的关系。方法 应用顺铂处理ＡＯ１０／１７细胞，ＨＥ染色观察细胞形态学改变；琼脂糖凝胶电泳观察ＤＮＡ降解，以及应用流式细胞仪观察细胞凋亡过程中细胞周期的改变及细胞内钙离子的变化。结果 在顺铂作用下，ＡＯ１０／１７细胞呈凋亡改变，ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳呈典型的凋亡特征。细胞凋亡的同时细胞周期发生特定的改变，细     

顺铂诱导卵巢癌COC1细胞凋亡的观察

目的了解化疗药物诱导细胞凋亡的规律,阐明细胞凋亡在肿瘤化疗中的作用和地位。方法顺铂体外作用于卵巢癌细胞系ＣＯＣ１,通过组织细胞化学染色、荧光染色结合电镜、ＤＮＡ电泳和流式细胞术等方法,观察ＣＯＣ１细胞凋亡的发生规律。结果经顺铂处理的ＣＯＣ１细胞出现典型的细胞凋亡形态学特征,在顺铂处理的３０小时内,凋亡持续存在并逐渐增强。凋亡率在一定的剂量范围内呈依赖性增强。在顺铂处理的１２小时时间点上,虽然坏死率仅为１２．４％,但凋亡率已达３０．８％。结论化疗药物诱导凋亡是化疗的重要治疗机理     

外源性FHIT基因表达对顺铂诱导宫颈癌SiHa细胞凋亡的影响

目的:探讨外源性脆性组氨酸三联体(fragile histidine triad,FHIT)基因表达与顺铂(cisplatin,DDP)是否可协同促进宫颈癌SiHa细胞的凋亡。方法:重组质粒PRcC-MV-FHIT(A组)及空质粒PRcCMV(B组)分别转染无内源性FHIT蛋白表达的SiHa细胞(未转染SiHa细胞为C组),Western Blot检测外源性FHIT蛋白的表达,使用不同浓度的顺铂分别处理各组细胞,通过AO-EB染色、流式细胞术检测顺铂处理后各组细胞的凋亡。结果:顺铂处理48h后进行流式细胞仪检测,重组质粒+DDP2.0μg/ml、未转染细胞+DDP2.0μg/ml及未用顺铂处理的重组质粒组凋亡率分别为51.03%、20.58%、22.07%,重组质粒+DDP组细胞凋亡更明显(重组质粒+DDP2.0μg/ml组与未转染细胞+DDP2.0μg/ml及未用顺铂处理的重组质粒组相比P<0.01),AO-EB染色亦见顺铂处理的重组质粒组凋亡细胞明显增多。结论:外源性FHIT基因表达与顺铂协同促进SiHa细胞凋亡,为基因治疗与化疗联合治疗宫颈癌提供理论基础。     

小剂量顺铂增强放疗诱导HeLa细胞凋亡的实验研究

目的 :实验研究小剂量顺铂增强放疗诱导HeLa细胞凋亡的作用。方法 :将细胞分为单纯放疗组、单纯化疗组、放疗加化疗组和空白对照组 4组 ,采用TUNEL法分别检测各组细胞的凋亡率。结果 :单纯放疗、化疗都可诱导HeLa细胞凋亡 ,顺铂 (化疗 )可以明显增强放疗诱导的细胞凋亡。结论 :小剂量顺铂可明显增加放疗诱导的HeLa细胞凋亡 ,为临床应用小剂量顺铂使放疗增效提供了理论依据     

顺铂诱导卵巢癌SKOV3细胞自噬和凋亡的研究

目的:研究顺铂诱导卵巢癌SKOV3细胞自噬和凋亡的发生情况,并探讨可能的发生机制。方法:顺铂干预卵巢癌SKOV3细胞后,用MDC染色荧光显微镜观察自噬囊泡及流式细胞仪检测自噬率;AnnexinV-FITC/PI双染色流式细胞仪检测凋亡率及TUNEL法检测凋亡指数;Western blot检测自噬蛋白Beclin1,LC3-Ⅱ和凋亡蛋白caspase9,caspase3的表达。结果:顺铂干预SKOV3细胞后,MDC阳性细胞数明显增多;自噬率提高(P<0.05);凋亡率提高(P<0.05);凋亡指数提高(P<0.05);自噬蛋白Beclin1,LC3-Ⅱ和凋亡蛋白caspase9,caspase3表达均增强(P<0.05)。结论:顺铂不仅可诱导卵巢癌SK-OV3细胞凋亡,而且可诱导卵巢癌SKOV3细胞自噬性死亡。     

甲磺酸伊马替尼对顺铂耐药卵巢癌细胞COC1增殖与诱导凋亡的作用

目的:探讨甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)对顺铂(DDP)耐药卵巢癌细胞COC1增殖的抑制作用和对细胞诱导的凋亡作用。方法:采用MTT法检测甲磺酸伊马替尼对细胞增殖的影响。采用HE染色法电子显微镜观察细胞的凋亡。采用双染色流式细胞术检测甲磺酸伊马替尼作用于COC1/DDP发生的细胞凋亡。结果:甲磺酸伊马替尼对COC1细胞增殖表现出浓度依赖性的抑制作用,并显著提高其对DDP的敏感性(P<0.05);甲磺酸伊马替尼和DDP联合用药对COC1细胞均表现为明显的诱导凋亡特征,与单独应用DDP,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:甲磺酸伊马替尼能够抑制DDP耐药卵巢癌细胞COC1的增殖与凋亡,并显著增强其对DDP的敏感性。     

siRNA LSINCT5联合顺铂对卵巢癌SKOV3细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨沉默LSINCT5联合顺铂对人卵巢癌SKOV3细胞增殖及凋亡的影响。方法:选取SKOV3细胞株,采用小干扰技术将LSINCT5基因片段转入卵巢癌SKOV3细胞中,同时联合顺铂作用于卵巢癌细胞。按不同处理因素将SKOV3细胞分为5组:对照组、NC-siRNA组、顺铂组、LSINCT5-siRNA+顺铂组和LSINCT5-siRNA组。CCK-8检测转染后SKOV3细胞对顺铂的敏感性。显微镜下观察细胞的生长状况及形态变化。Western blot和RT-PCR法分别检测与凋亡相关的Caspase 3蛋白和基因表达水平。结果:CCK-8显示,3μg/ml顺铂作用于卵巢癌细胞的抑制率较为适中,故作为后续实验的处理浓度。沉默LSINCT5能显著提高卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。LSINCT5-siRNA+顺铂组中Caspase 3蛋白和mRNA相对表达量均明显高于其他各组(P0.05)。结论:沉默LSINCT5提高了卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。沉默LSINCT5联合顺铂能明显抑制卵巢癌细胞的增殖,促进卵巢癌细胞凋亡。     

β-连环素对卵巢癌细胞顺铂耐药性的影响

目的:探讨信号分子β连环素(β-catenin)在多个卵巢癌耐药细胞系中的表达及其对顺铂耐药性的影响。方法:首先在2个卵巢癌耐药细胞系(C13K,SKOV-3),2个卵巢癌敏感细胞系(OV2008,A2780),A2780顺铂敏感株、A2780-cis顺铂耐药株,COC10顺铂敏感株、COC1-cis顺铂耐药株中检测β-catenin蛋白的水平。通过小干扰RNA(si RNA)介导的RNA干扰技术靶向沉默细胞中β-catenin的表达,实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)和蛋白质印迹法(Western blotting)验证β-catenin基因沉默效果。台盼蓝染色方法分析β-catenin基因沉默对细胞化疗药物顺铂敏感性的影响,流式细胞术检测顺铂处理后β-catenin基因沉默细胞的凋亡率。Western blotting筛选多个凋亡相关信号分子的改变。结果:β-catenin在2个卵巢癌耐药细胞系C13K,SKOV-3中蛋白水平较敏感细胞系明显上调。与亲本A2780和COC10细胞相比,在耐药株A2780-cis和COC1-cis中表达水平也明显增高。β-catenin si RNA能显著抑制细胞中β-catenin蛋白的水平。β-catenin基因沉默后,卵巢癌耐药细胞C13K,SKOV-3对顺铂敏感性显著增高;流式细胞术进一步分析发现β-catenin基因沉默可以促进顺铂介导的卵巢癌耐药细胞的细胞凋亡。Western blotting发现β-catenin基因沉默后,顺铂处理可以显著上调促凋亡分子p53和caspase-3蛋白水平。结论:β-catenin在卵巢癌耐药细胞系表达明显增高,β-catenin沉默可以促进卵巢癌耐药细胞对顺铂的敏感性,并同时促进了顺铂介导的细胞凋亡。     

Pembrolizumab联合卡铂对顺铂耐药卵巢癌细胞增殖及凋亡的影响和机制研究

目的 探讨Pembrolizumab联合卡铂对顺铂耐药卵巢癌细胞(SKOV-3/顺铂)的增殖、凋亡的影响和机制.方法 CKK-8法检测SKOV-3/顺铂的耐药指数和半数抑制浓度(IC50).CKK-8法、流式细胞术(FCM)检测实验组和对照组的增殖、凋亡.蛋白免疫印迹法(western blotting)检测程序性死亡...     

人卵巢上皮性癌顺铂耐药细胞系3AO/cDDP模型的建立及耐药机理的实验研究

目的：模拟临床卵巢上皮性癌化疗的用药特点建立顺铂耐药细胞系3AO／CDDP,检测LRP、MRP、P－gp、GSTπ和TopeⅡ表达。方法：以临床卵巢上皮性癌化疗用药的最低剂量换算终浓度,采用大剂量顺铂（10μg／ml）反复间歇24h暴露法建立顺铂耐药细胞系;用FCM法检测LRP、MRP、P－gp、GSTπ和TopoⅡ表达。结果：历时4．5个月建成顺铂耐药株3AO／cDDP,耐药性稳定,耐药指数1．62,与临床耐药倍数相近。3AO／cDDP细胞MRP、P－gp表达与3AO相比无明显变化（P＞0．05）,LPR、GSTπ表达明显升高（P＜0．005及P＜0．05）,Tope-Ⅱ含量明显降低（P＜0．05）。结论：3A0／cDDP是模拟临床用药特点建立的、研究顺铂耐药的理想模型;顺铂耐药与LRP、GSTπ表达升高及TopoⅡ含量降低有关,与MRP、P-gp无关。     

卵巢上皮性癌顺铂耐药细胞株的建立及其多药耐药蛋白的表达

目的 以较大剂量和反复间歇用药的方式建立卵巢上皮性癌顺铂（ｃＤＤＰ）耐药细胞株３ＡＯ／ｃＤＤＰ,并检测其肺耐药蛋白（ＬＲＰ）、多药耐药相关蛋白（ＭＲＰ）和Ｐ－糖蛋白（Ｐ－ｇｐ）的表达。方法 以卵巢上皮性癌化学治疗用药的最低剂量换算终浓度,采用大剂量ｃＤＤＰ（１０μｇ／ｍｌ）反复间歇２４ｈ暴露法建立３ＡＯ／ｃＤＤＰ细胞株;用流式细胞仪（ＦＣＭ）检测ＬＲＰ、ＭＲＰ和Ｐ－ｇｐ的表达。结果 历时４．５个月     

卵巢上皮性癌细胞系铂类药物耐药相关蛋白的比较蛋白质组分析

目的 对卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞系进行铂类药物耐药相关蛋白的比较蛋白质组分析.方法 应用双向凝胶电泳和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）寻找对铂类药物敏感（SKOV3和A2780）及耐药（SKOV3/CDDP、SKOV3/CBP、A2780/CDDP和A2780/CBP）卵巢癌细胞系的差异表达蛋白质.RT-PCR、蛋白印迹法分别验证差异表达蛋白质在各细胞系中mRNA和蛋白的表达水平.结果 共发现5种蛋白质（膜联蛋白A3、破解蛋白、辅酶Ⅱ依赖的异柠檬酸脱氢酶1、谷胱甘肽转移酶omega 1和丝切蛋白1）在3种及3种以上耐药细胞中均有差异表达,膜联蛋白A3的表达差异最显著.膜联蛋白A3基因的mRNA和蛋白表达水平,SKOV3/CDDP、SKOV3/CBP、A2780/CDDP和A2780/CBP细胞较SKOV3和A2780细胞明显升高.结论 应用蛋白质组学技术对SKOV3和A2780细胞系及其4种耐药细胞系进行比较蛋白质组分析,共识别鉴定出5种蛋白质,膜联蛋白A3、破解蛋白、辅酶Ⅱ依赖的异柠檬酸脱氢酶1、谷胱甘肽转移酶omega 1和丝切蛋白1可能参与卵巢癌铂类药物耐药机制的形成.     

PTEN基因逆转卵巢上皮性癌细胞耐药的机制研究

目的通过检测PTEN基因在卵巢上皮性癌（卵巢癌）顺铂敏感细胞株0V2008及0V2008配对的顺铂耐药细胞株C13K中的表达,探讨转染PTEN基因能否逆转C13K细胞对顺铂的耐药及其相关机制。方法半定量RT-PCR技术和蛋白印迹法检测0V2008和C13K细胞中PTENmRNA和蛋白的表达。将野生型PTEN基因真核表达质粒在脂质体介导下转染C13K细胞,同时以转染空载体和未转染的C13K细胞作为对照,分别应用RT-PCR技术检测各组细胞PTENmRNA表达的变化,应用蛋白印迹法检测各组细胞PTEN、蛋白激酶B（AKT）及磷酸化AKT（p-AKT）蛋白表达的变化;四甲基偶氮唑蓝（M1Tr）比色法观察转染PTEN基因后C13K细胞对顺铂敏感性的变化,流式细胞仪分析顺铂作用后的细胞凋亡情况。结果（1）PTENmRNA在0V2008和C13K细胞中的表达水平分别为1．02±0.05和0．45±0.03,而0V2008、C13K细胞中PTEN蛋白的表达水平分别为1.02±0.07、0．55±0．03,两种细胞PTENmRNA和蛋白的表达水平分别比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。（2）PTEN基因转染48h后,C13K细胞中PTENmRNA、蛋白的表达水平分别为2.04±0．10和0．94±0．04,分别与转染空载体和未转染的C13K细胞比较,差异均有统计学意义（P〈0．01）;p-AKT蛋白的表达水平（0.94±0．07）较转染空载体（1．66±0．10）和未转染（1．68±0．14）的C13K细胞显著降低（P〈0．05）。（3）转染PTEN基因的C13K细胞对顺铂的半数抑制浓度（IC50）为（7.2±0．3）μmol／L,明显高于转染空载体和未转染的C13K细胞[分别为（12．7±0．4）、（13．0±0．3）μmol／L,P〈0,05]。（4）顺铂作用24h后,转染PTEN基因、转染空载体和未转染的C13K细胞的凋亡率分别为（41.7±0.9）％、（18．6±0．7）％和（15,3±0．8）％,前者明显高于后两者（P〈0．01）。结论PTEN基因在0V2008细胞中的表达明显高于C13K细胞。转染野生型PTEN基因能有效提高C13K细胞内PTEN基因的表达,并通过降低C13K细胞中AKT磷酸化的水平恢复C13K细胞对顺铂的敏感性。     

Survivin反义寡核苷酸诱导人卵巢癌耐药细胞株COC_1/DDP凋亡的实验研究

目的 :探讨经脂质体介导的survivin反义寡核苷酸诱导人卵巢癌耐药细胞株COC1/DDP凋亡的作用。方法 :将脂质体介导的survivin反义寡核苷酸 (survivin ASONs)作用于COC1/DDP细胞 ,采用一步法RT PCR检测survivin、bcl 2mRNA的表达 ,并进行细胞核DNA梯形电泳 ,检测caspase 3活性 ,流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期。结果 :经survivin ASONs作用后COC1/DDP细胞中survivin等抗凋亡基因的表达下降 ,细胞核DNA电泳呈现凋亡细胞特有的梯状条带 ,caspase 3活性增加且呈时间依赖性 ,细胞凋亡率达33.18% ,细胞周期G2 /M及S期明显下降而多阻滞于G0 /G1期 ,与对照组差异有显著性(P <0 .0 5 )。结论 :survivin ASONs反义寡核苷酸能诱导人卵巢癌耐药细胞株COC1/DDP细胞凋亡 ,且效果显著     

细胞周期同步化逆转卵巢癌对紫杉醇耐药的研究

目的:探讨卵巢癌对紫杉醇耐药的产生和细胞周期的相关性以及细胞周期同步化方法逆转卵巢癌对紫杉醇耐药的可能性。方法:化疗敏感的卵巢癌SKOV3,A2780细胞株和用脱氧胸腺嘧啶核苷(细胞周期S期同步化药物)处理相应的耐药细胞后更换普通培养基,8～10h后加入紫杉醇(100nmol/L),10～12h后撤出紫杉醇,设立不经同步化处理的细胞作对照,收集不同时间点细胞用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果:SK-OV3,A2780敏感和耐药组细胞经细胞周期同步化处理后加入紫杉醇其凋亡率敏感和耐药细胞均较对照组增高,以48h检测结果差异最显著。结论:细胞周期同步化方法有可能成为加强紫杉醇的作用效果以及逆转耐药性的有效方法。     

米非司酮对卵巢上皮性癌耐药细胞DNA修复基因表达和顺铂敏感性的影响

目的 研究米非司酮对卵巢上皮性癌(卵巢癌)耐药细胞DNA修复基因表达的调控,及对顺铂的增敏作用.方法 应用四甲基偶氮唑蓝比色法检测2.5、5.0、10.0 μmol/L米非司酮作用后卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1/DDP的顺铂半数抑制浓度(IC50);用RT-PCR技术、流式细胞仪检测米非司酮联合顺铂作用后COC1/DDP细胞ERCC1、BRCA1、hMLH1 mRNA的表达水平及细胞周期和凋亡率的变化;建立COC1/DDP细胞裸鼠皮下移植瘤模型,分为顺铂组、米非司酮组、联合组和对照组,观察米非司酮在裸鼠体内对顺铂的增敏作用.结果 2.5、5.0、10.0 μmol/L米非司酮分别使COC1/DDP细胞对顺铂的IC50下降为(3.18±0.46)、(1.95±0.14)和(0.64±0.18)μg/ml,2.5 μmol/L米非司酮联合顺铂作用后的IC50与单用顺铂者[(3.71±0.38)μg/ml]比较,差异无统计学意义(P=0.076),其他浓度之间两两比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).米非司酮下调ERCC1、BRCA1、hMLH1 mRNA表达水平,3种基因mRNA的相对表达量随米非司酮浓度的升高均呈下降趋势.2.5、5.0、10.0 μmol/L米非司酮联合顺铂对COC1/DDP细胞作用后,G0/G1,期细胞比例升高(分别为51.68%、53.74%、55.08%).2.5、5.0、10.0 μmol/L米非司酮与10 μg/ml顺铂联合作用使细胞凋亡率分别增加为5.11%、9.13%和12.24%.米非司酮联合顺铂治疗裸鼠皮下移植瘤的生长抑制率为70.1%,与顺铂组、米非司酮组(分别为22.5%、6.5%)比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 米非司酮通过下调ERCC1、BRCA1、hMLH1基因的表达及阻滞G0/G1期细胞、增加细胞凋亡率来增强顺铂对卵巢癌细胞的抗肿瘤敏感性.     

单己糖神经酰胺与卵巢癌顺铂耐药性关系的研究

目的　研究单己糖神经酰胺 (ceramidemonohexoside ,CMH)与卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1 DDP细胞的顺铂耐药性的关系 ,及其在COC1 DDP细胞凋亡中的作用。方法　分别提取、纯化COC1 DDP细胞 (用浓度为 1 2 5、5μmol L的米非司酮处理前、后 )和卵巢癌顺铂敏感细胞株COC1细胞的中性鞘糖脂 ,用高效薄层层析、凝胶光密度成像系统分析细胞中CMH的相对含量。将COC1 DDP细胞分为 :顺铂 ( 0 1、0 2 5、0 5、1 2 5、2 5μg ml)组、米非司酮 ( 1 2 5、2 5、5、10、2 0 μmol L)组、顺铂 ( 0 1～2 5μg ml) +米非司酮 ( 1 2 5、5μmol L)组 ,用四甲基偶氮唑蓝 (MTT)法检测各组细胞的生存率、琼脂糖凝胶电泳检测各组细胞DNA的变化、透射电子显微镜观察各组细胞的形态变化。结果　COC1 DDP细胞中CMH的相对含量为 ( 3 7 1± 3 3 ) % ,明显高于COC1细胞的 ( 14 1± 1 4) % (P <0 0 0 1) ;COC1 DDP细胞分别经 1 2 5、5μmol L米非司酮处理后 ,CMH的相对含量下降到 ( 2 6 6± 2 6) %和 ( 17 5±0 7) % ,分别与米非司酮处理前比较 ,差异均有显著性 (P <0 0 5,0 0 0 1)。MTT法检测显示 ,米非司酮浓度在 5μmol L以下时 ,对COC1 DDP细胞不产生明显的抑制作用 (P >0 0 5) ;顺铂 +米非司酮组COC1 DDP细胞抑制率较