表皮葡萄球菌ica操纵子与细胞间多糖粘附素及生物膜表型的相关性

目的 探讨表皮葡萄球菌 ica 操纵子与细菌间多糖粘附索(polysaccharide intercellular adhesin,PIA)及生物膜表型之间的关系.方法 采用聚合酶链反应(PCR)检测 icaA 基因,刚果红琼脂平皿检测 PIA,微量板半定量法检测细菌生物膜表型;统计学分析 icaA 基因与 PIA 及生物膜表型之间的相关性.结果 49 株临床分离菌株中,32.7%(16/49)能形成生物膜,67.3%(33/49)无生物膜形成.icaA 基因阳性菌株中 80%(8/10)有生物膜形成,ica 操纵子与生物膜表型密切相关(P<0.01);PIA 阳性菌株中63.6%(14/22)有生物膜形成,PIA 与生物膜表型密切相关(P<0.01).结论 表皮葡萄球菌 ica 操纵子的存在与生物膜表型密切相关,PIA 的合成是生物膜形成的关键环节.     

ica操纵子对表皮葡萄球菌在不同骨科植入物表面黏附和生物膜形成的影响

目的 探讨ica操纵子对表皮葡萄球菌在骨科植入物表面黏附和生物膜形成能力的影响,为临床骨科材料的使用提供理论依据.方法 采用PCR扩增表皮葡萄球菌ica操纵子的icaADBC基因,荧光定量PCR检测ica操纵子基因的表达,苯酚-硫酸法检测细胞间多糖黏附素(PIA)的合成,黏附能力检测采用菌落平板计数法,生物膜形成能力检测采用结晶紫染色法.结果 11株表皮葡萄球菌临床菌株扩增出ica操纵子的icaADBC基因,且在菌株中均有表达.ica操纵子基因表达高的菌株其PIA分泌量较高.表皮葡萄球菌在骨组织上的黏附和生物膜形成能力最强,其次为钛合金和不锈钢.icaA基因表达与细菌在3种生物材料上的生物膜形成相关.结论 表皮葡萄球菌在不同骨科植入物上具有不同的黏附和生物膜形成能力,ica操纵子基因通过调节PIA分泌量而影响表皮葡萄球菌生物膜的形成.     

隐丹参酮对表皮葡萄球菌生物膜形成关键调控基因表达的抑制作用

目的 探讨隐丹参酮对表皮葡萄球菌(SE)生物膜形成中关键调控基因的抑制作用.方法 体外建立SE黏附、聚集和成熟各阶段生物膜模型,采用RT-PCR检测在隐丹参酮作用下;SE生物膜形成中关键调控基因icaA、atlE、aap、luxS的表达变化.结果 28 μg/mL的隐丹参酮能明显抑制生物膜形成中黏附、聚集、成熟整个过程4个关键调控基因的表达,差异有统计学意义(P<0.05);32 μg/mL的隐丹参酮对黏附和聚集阶段生物膜形成中关键调控基因luxS有抑制作用,差异有统计学意义(P<0.05),能使icaA、atlE、aap 基因表达量下降,但差异无统计学意义(P>0.05),增加成熟阶段生物膜形成中4个关键基因的表达量,但差异无统计学意义(P>0.05);此外,128 μg/mL的隐丹参酮与32 μg/mL的隐丹参酮相比,前者生物膜形成中4个关键基因的表达明显低于后者,差异有统计学意义(P<0.05).结论 隐丹参酮对SE各阶段生物膜形成中关键调控基因icaA、atlE、aap、luxS表达具有抑制作用,且这种抑制作用存在一定的剂量和时间效应.     

临床分离表皮葡萄球菌生物膜形成与其耐药性的相关性分析

目的分析临床分离的表皮葡萄球菌对抗菌药物的耐药性与生物膜形成能力的关系。方法收集成都地区两家医院非重复临床分离表皮葡萄球菌45株,用半定量黏附实验检测其生物膜形成能力,采用K-B法以统一方案进行抗菌药物药敏试验,按CLSI2009版判断结果,用χ2检验分析表皮葡萄球菌耐药性与生物膜形成能力之间的关系。结果 45株表皮葡萄球菌中18株为生物膜形成株,其中12株来源于分泌物标本,6株来源于其他无菌体液。来源于分泌物和其他无菌体液的表皮葡萄球菌生物膜形成能力差异无统计学意义（P〉0.05）;45株表皮葡萄球菌除对万古霉素、利奈唑胺、喹奴普丁/达福普丁有较高的抗菌活性外,对青霉素、氨苄西林/克拉维酸、苯唑西林、头孢唑啉、复方新诺明、林可霉素、环丙沙星、红霉素、庆大霉素、亚胺培南的耐药率均〉50%,特别是苯唑西林耐药表皮葡萄球菌（MRS）高达88.9%.可形成生物膜和不可形成生物膜的菌株对抗菌药物耐药率差异无统计学意义（P〉0.05）。结论表皮葡萄球菌对抗菌药物的耐药性与其生物膜形成能力无相关性。     

亚抑菌浓度隐丹参酮对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响

目的:探讨亚抑菌浓度隐丹参酮对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响。方法:以万古霉素为药物对照,微量稀释法测定隐丹参酮与万古霉素对表皮葡萄球菌的MIC值;半定量粘附实验、XTT、扫描电镜和RT-PCR分别检测1/2MIC浓度的隐丹参酮与万古霉素作用下表皮葡萄球菌生物膜基质量、膜内菌代谢活性、微观形态结构和atl E基因表达情况的变化。结果:隐丹参酮与万古霉素对表皮葡萄球菌的MIC值分别为2μg/m L与4μg/m L;1μg/m L的隐丹参酮与2μg/m L的万古霉素均能抑制表皮葡萄球菌生物膜基质量、膜内菌代谢活性和atl E基因表达,且1μg/m L的隐丹参酮抑制作用明显强于2μg/m L的万古霉素,差异有统计学意义(P0.05);SEM观察1μg/m L的隐丹参酮作用下表皮葡萄球菌已不能形成生物膜结构,而2μg/m L的万古霉素作用下依然能够形成生物膜结构。结论:亚抑菌浓度下的隐丹参酮能抑制表皮葡萄球菌生物膜形成,且抑制作用强于亚抑菌浓度万古霉素。     

临床分离表皮葡萄球菌生物膜相关遗传背景与表现型关系研究

目的 了解临床感染分离表皮葡萄球菌中生物膜相关基因分布与生物膜表现型之间的关系,探索表葡菌生物膜相关临床感染的机制。方法 收集我院临床感染标本中分离并鉴定的表葡菌50株,采用PCR方法扩增管家基因16S基因作为参照,扩增agrA,icaADB,atlE及fbe基因,经琼脂糖电泳扩增产物,检测上述基因分布情况;采用刚果红检测表葡菌粘附株,采用96孔平底组织培养盘法半定量检测表葡菌生物膜表现型,了解其与上述基因遗传背景的相关性。结果 agrA,atlE与fbe基因分布较广泛,但与生物膜表现型之间相关性无统计学意义。icaADB及同时具有4种相关基因与生物膜表现型之间相关性有统计学意义。结论 目前已知的表葡菌生物膜主要调控基因中,icaADB及同时携带4种相关基因与临床分离表葡菌生物膜表现型之间有相关性,但并不完全对等,说明临床分离表葡菌生物膜的形成可能还存在其它调控因素的影响。     

双组分信号转导系统SrrBA调控表皮葡萄球菌生长和生物膜形成

目的:探讨双组分信号转导系统SrrBA在表皮葡萄球菌中的调控作用。方法:利用同源重组技术构建表皮葡萄球菌srrBA基因敲除突变株,通过检测OD600值绘制其有氧生长曲线,并观察其厌氧生长状态,微量板半定量方法检测其生物膜形成能力。结果:经PCR扩增和测序验证获得了表皮葡萄球菌srrBA基因敲除突变株(SE 1457-ΔsrrBA)。突变株的生长不论是在有氧还是在厌氧条件下均明显滞后于野生株。此外,突变株形成生物膜的能力较之野生株也显著下降。结论:双组分系统SrrBA可调控表皮葡萄球菌的生长和生物膜形成。     

表皮葡萄球菌AtlE蛋白介导生物膜起始黏附的相关机制

目的探讨表皮葡萄球菌atlE基因编码的AtlE蛋白介导生物膜起始黏附的相关机制。方法采用RT-PCR法检测表皮葡萄球菌atlE基因在不同时期的表达水平,用紫外分光光度计检测DNA的方法检测了相应时期的胞外DNA的释放量,并用DNA酶（DNaseⅠ）研究表皮葡萄球菌胞外DNA在生物膜形成和起始黏附中的作用;采用pBT2质粒同源重组敲除的方法构建了表皮葡萄球菌1457的atlE基因突变株,研究atlE基因敲除突变对起始黏附能力、生物膜形成及胞外DNA释放能力的影响。结果表皮葡萄球菌atlE基因的表达与胞外DNA的释放量有相关性;DNA酶能影响未成熟生物膜且能降低起始黏附能力;△atlE菌株胞外DNA的释放减少。起始黏附能力明显降低,不形成生物膜。结论表皮葡萄球菌atlE基因编码的AtlE蛋白能通过释放胞外DNA在表皮葡萄球菌的生物膜起作用。     

葡萄球菌生物膜与宿主免疫相互作用的研究进展

葡萄球菌造成的生物膜相关性感染易于慢性化和顽固化,究其原因与生物膜形成后葡萄球菌抗生素耐药性增加和逃避宿主免疫防御有关。目前生物膜引起的耐药已引起人们的广泛关注,但关于生物膜与宿主免疫系统之间相互作用的研究还相对较少。机体免疫反应可分为固有免疫和获得性免疫,固有免疫主要包括一些免疫屏障、免疫分子及免疫细胞对微生物进行防御,获得性免疫则主要通过免疫细胞对微生物识别产生相应的抗体。     

Penetration of erythromycin through Staphylococcus epidermidis biofilm

Background The catheter related infection caused by Staphylococcus epidermidis biofilm is increasing and difficult to treat by antimicrobial chemotherapy. The properties of biofilms that give rise to antibiotic resistance are only partially understood. This study aimed to elucidate the penetration of erythromycin through Staphylococcus epidermidis biofilm.

Methods The penetration ratio of erythromycin through Staphylococcus epidermidis biofilms of 1457, 1457-msrA, and wild isolate S68 was detected by biofilm penetration model at different time points according to the standard regression curve. The RNA/DNA ratio and the cell density within the biofilms were observed by confocal laser microscope and transmission electromicroscope, respectively.

Results The penetration ratios of erythromycin through the biofilms of 1457, 1457-msrA, and S68 after cultivation for 36 hours were 0.93, 0.55 and 0.4, respectively. The erythromycin penetration ratio through 1457 biofilm (0.58 after 8 hours) was higher than that through the other two (0.499 and 0.31 after 24 hours). Lower growth rate of the cells in biofilm was shown, with reduction of RNA/DNA proportion observed by confocal laser microscope through acridine orange stain. Compared with the control group observed by transmission electrmicroscope, the cell density of biofilm air face was lower than that of agar face, with more cell debris.

Conclusions Erythromycin could penetrate to the Staphylococcus epidermidis biofilm, but could not kill the cells thoroughly. The lower growth rate of the cells within biofilm could help decreasing the erythromycin susceptibility.

     

外排泵msrA在表皮葡萄球菌生物被膜对红霉素耐药性中的作用

目的:探讨外排泵msrA在表皮葡萄球菌生物被膜对红霉素耐药性中的作用.方法:从野生菌株中克隆msrA基因全长,并通过穿梭载体pBT2电转化至限制缺陷菌株金黄色葡萄球菌RN4220,提取质粒后再转化S.epidermidis 1457(ica ,产膜阳性菌),得到S.epidermidis 1457-msrA.实时荧光RT-PCR检测S.epidermidis 1457-msrA和野生株S68浮游菌、生物被膜内细菌红霉素作用24 h前后msrA mRNA的表达.结果:表葡膜内菌msrA的表达在红霉素(10倍MIC)作用前后未见统计学差异.结论:提示膜内菌对红霉素耐药性的增加可能与外排泵基因的上调无关.     

表皮葡萄球菌全面调节子的表达在生物被膜耐药性中的作用

目的:探讨表皮葡萄球菌全面调节子的表达在生物被膜耐药性中的作用.方法:采用实时荧光定量RT-PCR对表皮葡葡球菌1457生物被膜内细菌红霉素作用前后全面调节子(agr,sarA,sigB)的表达进行检测.结果:在表皮葡萄球菌1457中,agrD和RNAⅢ在膜内菌中的表达均高于浮游菌,且红霉素作用24 h后的表达高于作用前(P＜0.05);sarA膜内菌的表达高于浮游菌(P＜0.05),但红霉素作用前后的表达无统计学差异(P＞0.05);膜内菌sigB和反应sigB 调控的活性基因asp23的表达红霉素作用前后无统计学差异(P＞0.05).结论:由于agrD和RNAⅢ参与群体效应系统的调节,提示群体效应调节在红霉素耐药性增加中起着重要作用.     

盐酸小檗碱对表皮葡萄球菌生物被膜形成及相关基因表达的抑制作用

目的 通过检测盐酸小檗碱单用或联合抗菌药物对表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis,Se.)形成生物被膜及所需基因的抑制作用.方法 体外构建表皮葡萄球菌生物被膜模型,盐酸小檗碱单用或联合万古霉素、环丙沙星、红霉素分别干预生物被膜的形成,采用CRA平板法检测药物对Se.生物被膜的抑制作用,荧光定量RT-PCR方法检测约物作用前后表皮葡萄球菌icaA基因和agr基因的表达变化.结粜盐酸小檗碱对icaA基因和agr基因的影响作用不及万古霉素、环丙沙星、红霉素;当不同浓度的盐酸小檗碱分别与万古霉素、环丙沙星、红霉素联用时,随着盐酸小檗碱的浓度增加,联合用药对icaA基因和agr基因的抑制作用逐渐减弱.结论 中药单体(盐酸小檗碱)对Se.形成生物被膜及所需关键基因的表达有一定的抑制作用,但抑制作用不及抗生索(万古霉素、环丙沙星、红霉素),并且不能与抗生索(万占霉素、环丙沙星、红霉素)联合用药,它们之间存在拮扰作用.     

临床分离表皮葡萄球菌的大环内酯耐药性与生物膜形成能力、icaA基因型的关系

目的 研究68株临床分离表皮葡萄球菌大环内酯耐药性与生物膜形成能力、icaA基因型之间的关系,初步预测采用大环内酯抗菌药物预防表皮葡萄球菌生物膜感染的有效性.方法 以琼脂平板稀释法测定菌株的最小抑菌浓度,采用微孔测定法考察临床分离表皮衙萄球菌生物膜形成能力,通过PCR法测定icaA基因型,探讨三者之间的关系.结果 临床分离表皮葡萄球菌对大环内酯耐药程度较高(88.2%),且耐药菌生物膜形成能力较敏感菌显著增强(P<0.05),耐药菌与敏感菌的icaA阳性比率没有统计学差异(P>0.05).结论 红霉素、阿奇霉素、克拉霉素等常用的大环内酯类药物可能难以有效地预防表皮葡萄球菌生物膜感染.     

金黄色葡萄球菌临床分离株生物膜形成能力及其相关基因的检测

目的： 检测临床分离金黄色葡萄球菌（金葡菌）的生物膜形成能力及其相关基因。方法： 用半定量微量平板法检测临床分离的92株金葡菌生物膜形成能力,并通过扫描电镜观察生物膜形态,用PCR法来检测生物膜形成的相关基因ica和sarA。结果： 92株临床分离金葡菌菌株均可形成生物膜,PCR结果显示100%的分离株均含有sarA基因,78株（84.78%）含有ica基因。结论： 临床分离的金葡菌都具有形成生物膜的能力,生物膜形成的相关基因ica和sarA的携带率较高。     

表皮葡萄球菌luxS基因敲除重组质粒的构建

目的构建1个含有luxS基因上、下游片段、抗卡那霉素基因的重组克隆质粒,用以敲除表皮葡萄球菌luxS基因。方法检索GenBank获得luxS基因序列以设计引物,以生物膜阳性表皮葡萄球菌基因组DNA为模板,采用高保真PCR扩增得到包含luxS基因上游片段、完整的luxS基因和luxS基因下游片段的长片段DNA;以pEASYT4质粒为模板扩增得到抗卡那霉素基因,再用内侧引物分别扩增luxS基因上、下游序列,按luxS基因上游片段＋抗卡那霉素基因＋luxS基因下游片段的顺序重组连接,转化JMl09感受态细胞,通过卡那霉素筛选、酶切分析和PCR一测序验证luxS基因敲除的重组克隆载体。结果经酶切后电泳验证重组质粒中各目的片段插入无误,PCR检测结果证明重组质粒luxS基因缺失,测序结果显示碱基无错配,含目的基因的重组质粒菌株在含卡那霉素培养平板内正常生长,证明插入的抗卡那霉素基因表达良好。结论表皮葡萄球菌luxS基因敲除重组质粒构建成功,为后续luxS基因缺陷株的构建奠定了基础。     

A new blaLEN-17 gene in a clinical isolate of Staphylococcus epidermidis in Shanghai, China

The introduction of the antibiotics into clinical practice has significantly reduced the mortality of infectious diseases. Although chromosomally mediated β-1actamase is natural in many genera of bacteria, the intensive use of antibiotics is the main cause for the increasing emergence of new β-1actamases. So far, more than 340 β-lactamases have been identified,1 among which, more than 200 are extended-spectrum β-lactamases （ESBLs）.2 The most prevalent β-lactamases are class A enzymes, including SHV and TEM. Genes encoding these enzymes generally located in large transferable plasmids. The dissemination of these plasmids attributes to the increasing incidence and spread of v-lactam resistance. It is important to investigate the prevalence and allelic distribution of genes encoding β-lactamase in the bacterial population in order to prevent the emergence of ESBLs in those bacteria and the spread of ESBLs in the clinical setting.     

人参皂苷对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制作用

目的探讨人参皂苷对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制作用。方法采用羊肉汤二倍稀释法测定人参皂苷对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制作用。结果本次研究共得44株标准株,其中阳性被膜菌株31例,被膜形成率为70.45%,编号为SA17的为强成膜菌株,MIC标准菌株20株,强成膜株SA17 41株;MBC标准菌株30株,强成膜株SA17 60株。药物浓度3.2/1.6时,金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制率比较,差异有统计学意义(P0.05)。药物浓度100、50、25、12.5、6.3时金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制率比较,差异无统计学意义(P0.05)。人参皂苷能下调agr、sar A、fnb A基因表达,其中0.1、1.0、10.0浓度下调agr、sar A、fnb A基因表达,与对照相比,差异有统计学意义(P0.05)。结论人参皂苷对金黄色葡萄球菌生物被膜具有显著的抑制作用,随着药物浓度的增加,其抑制率显著增加。人参皂苷可下调agr、sar A、fnb A基因表达,减少细菌黏附性。