BPDE诱发16HBE恶性转化过程中eIF3 p36的表达变化

目的探讨二羟环氧苯并芘（BPDE）诱发人支气管上皮细胞（16HBE）恶性转化过程中不同阶段真核生物蛋白翻译启始因子（elF3 p36 mRNA）表达水平的变化，为进一步阐明BPDE的分子致癌机理提供线索。方法应用RT—PCR和FQ—PCR方法，检测并分析BPDE诱发16HBE恶性转化不同阶段的eIF3p36mRNA表达量的变化。结果相对于非转化对照细胞，BPDE诱发恶性转化16HBE不同阶段细胞（转化细胞和成瘤细胞）的eIF3p36mR-NA基因表达水平均显著高于对照组（P〈0．01或P〈0．05），其中BPDE-转化细胞的elF3 p36平均表达量分别是对照细胞的2．3～5．1倍：而BPDE-转化细胞与BPDE-成瘤细胞的elF3 p36平均表达量相比，差别无显著性（P〉0．05），提示elF3 p36的异常表达量与BPDE诱发16HBE细胞恶变程度之间存在一定的正向关系。结论BPDE在诱发16HBE细胞恶变过程中，存在明显的elF3 p36的异常表达现象，其表达水平与细胞的恶变程度密切相关，这可能是BPDE诱发人细胞肿瘤的重要分子致癌机理之一。     

Malignant transformation and abnormal expression of eukaryotic initiation factor in bronchial epithelial cells induced by cadmium chloride

Objective To analyze the relationship between malignant transformation and abnormal expression of eukaryotic initiation factor 3 （eIF3 p36） in human bronchial epithelial （16HBE） cells induced by cadmium chloride （CdCl2）. Methods 16HBE cells were treated several times with different concentrations of CdCl2. Tumorigenic potential of transformed cells was identified by assays for anchorage-independent growth in soft agar and for tumorigenicity in nude mice after the 35th passage. Total RNA was isolated from 16HBE cells induced by CdC12, including non-transformed, Cd-transformed, and Cd-tumorigenic cell lines. Special primers for eIF3 p36 were designed and the expression of eIF3 mRNA in different cell lines was detected with fluorescent quantitative-polymerase chain reaction technique （FQ-PCR）. Results The 35th passage of 16HBE cells transformed by CdCl2 exhibited overlapping growth. Compared with the non-transformed cells, colonies of transformed cell lines in soft agar showed statistically significant increases and dose-dependent effects （P〈0.01）. All Cd-induced transformed cell lines formed rumors in nude mice within 2 weeks of inoculation, but none of the mice injected with non-transformed cells showed tumors even after 3 weeks. All tumors were pathologically identified as poorly differentiated squamous cell carcinoma. The eIF3 p36 genes in different stages of 16HBE cells transformed by CdCl2 were elevated as compared with the non-transformed control （P〈0.01）, and the eIF3 expression increased with the degree of cell malignancy. Conclusion CdCl2 is capable of inducing morphological transformation in 16HBE cells and transformed cells are potentially tumorigenic. Over-expression of eIF3 p36 is positively correlated with malignant transformation of 16HBE cells induced by CdCl2 and may be one of the molecular mechanisms potentially responsible for carcinogenesis due to Cd.     

Experimental Study onMalignant Transformation of Human Bronchial Epithelial CellsInduced by Glycidyl Methacrylate and Analysis on its Methylation

Objective To establish the model of human bronchial epithelial cells(16HBE) malignant transformation induced by glycidyl methacrylate(GMA) and define the different methylation genes at different stages.Methods DNA was extracted at different 16 HBE malignant phases and changes of genes DNA methylation at different stages were detected using Methylation chip of 'NimbleGen HG18 CpG Promoter Microarray Methylation'.Methylation-specific PCR(MSP) was used to observe the methylation status of some genes,and then compared with the control groups.Results The result showed that GMA induced 16 HBE morphorlogical transformation at the dose of8 μg/mL,and cell exposed to GMA had 1 374 genes in protophase,825 genes in metaphase,1 149 genes in anaphase,respectively;30 genes are all methylation in the 3 stages;318 genes in protophase but not in metaphase and anaphase;272 genes in metaphase but not in protophase and anaphase;683 genes in anaphase but not in metaphase and protophase;73 genes in protophase and metaphase but not in anaphase;67 genes in protophase and anaphase but not in metaphase;59 genes in metaphase and anaphase but not in protophase.Conclusion The pattern of DNA methylation could change in the process of 16 HBE induced by GMA.     

香烟烟雾对人支气管上皮细胞氧化应激作用研究

目的观察香烟形成的可吸入并沉积在呼吸道的香烟烟雾是否对人支气管上皮细胞造成的氧化应激。方法用FA-1型多级撞击式空气采样器对形成的烟雾进行采样,收集到6种大小不同的香烟烟雾颗粒,将采得的不同大小的香烟烟雾颗粒分别对人支气管上皮细胞（16HBE）进行刺激。6h后用荧光探针检测16HBE细胞中的活性氧。结果与未加香烟烟雾颗粒刺激对照组比较,香烟烟雾颗粒明显造成人支气管上皮细胞中活性氧增加。不同大小香烟烟雾颗粒中,第四级（2．1-3．3μm）的香烟烟雾颗粒造成的氧化应激最明显。第六级（0．65～1．1μm）大小的颗粒能直接对人支气管上皮细胞造成损伤。结论可吸入并沉积在呼吸道中的香烟烟雾能造成呼吸道上皮细胞的氧化损伤。也能对呼吸道上皮细胞造成直接损伤。     

应用基因芯片技术筛查肺癌变相关基因的研究

目的 使用基因芯片技术研究肺鳞癌及化学致癌物诱导入气管上皮细胞恶性转化的癌变相关基因。方法 应用含4096条人类全长基因的cDNA芯片分别检测6例肺鳞癌和6例正常肺组织的基因表达谱;并用上述芯片研究苯并(a)芘代谢产物BPDE[anti-Benzo(a)pyrene diolepoxide,BPDE]和结晶型硫化镍所诱导的人支气管上皮细胞恶性转化与正常的人支气管上皮细胞系(16HBE)在基因表达谱上的差异;将3类标本共同的差异表达基因确定为肺癌变的相关基因。结果 在肺鳞癌／正常肺组织之间、BPDE诱导的恶性转化细胞／正常16HBE细胞之间及硫化镍诱导的恶性转化细胞/正常16HBE细胞之间发现差异表达基因分别为171条、143条和151条。通过比较,发现89条与肺癌变相关的共同基因,其中表达显著增加的基因39条,它们是：癌基因6条;细胞周期相关基因4条;细胞增殖基因6条;肿瘤转移基因8条;神经内分泌基因3条;耐药基因1条;凋亡抑制基因1条;氧化基因1条;其他基因9条。表达显著下降的基因50条,它们是：抑癌基因7条;DNA修复基因11条;抗氧化基因1条;GST基因家族3条;细胞骨架基因3条;凋亡诱导基因2条;信号传导基因5条;细胞因子及其受体基因5条;细胞代谢基因7条,细胞外基质基因1条;其他基因5条。结论 cDNA基因芯片技术能有效地研究基因的表达谱,筛查出肺癌变相关基因。     

Alterations of FHIT gene and P16 gene in nickel transformed human bronchial epithelial cells

INTRODUCTION Nickel is a widely distributed occupational and environmental pollutant. Epidemiological studies demonstrated that the incidence of respiratory tract cancer is correlated with worksite exposure to nickel. Nickel is also a potent carcinogen in laboratory animals. The International Agency for Research on Cancer (IARC) has classified nickel compounds as confirmed human carcinogens[1]. However, the mechanism of nickel carcinogenesis remains unknown. Insoluble nickel compounds…     

二氧化硅对人支气管上皮细胞TGF—β1基因产物表达的影响分析

目的分析人支气管上皮细胞（16HBE）在二氧化硅（SiO2）粉尘染毒后TGF-β1基因产物的表达情况,为探索矽肺新的治疗途径提供基础资料。方法以16HBE作为靶细胞,以灭菌SiO2粉尘配置30μg／ml及60μg／ml两种不同浓度的悬浮液（以含10％FBS的DMEM培养基定溶）,以不同浓度的SiO2粉尘悬液分别培养16HBE靶细胞8h、16h、24h、32h,各做三个平行实验孔,同时,做10％FBS的DMEM空白对照;以免疫细胞化学方法检测TGF—β1基因产物的表达。结果在经30ug／ml及60ug／mlSiO2粉尘悬浮液培养8h、16h、24h、32h后,各实验孔16HBE细胞扫描灰度值均较对照组细胞低,结果提示,16HBE细胞经SiO2粉尘染毒后TGF—β1基因产物表达增加。结论体外实验条件下,SiO2粉尘可上调16HBE细胞TGF-β1基因产物的表达。     

镉和镍恶性转化16HBE上调基因eIF3 p36的克隆与序列

目的分析镉和镍恶性转化16HBE（人支气管上皮细胞）成瘤细胞株中翻译起始因子eIF3 p36基因序列的变化情况，探讨镉、镍重金属的致癌分子机制。方法取正常对照16HBE细胞、氯化镉（CAC12）和结晶型硫化镍（NiS）恶性转化的16HBE细胞，用有限稀释法分别建立单细胞克隆株，通过逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）获得目的基因翻译起始因子eIF3 p36的eDNA，将目的基因产物连接到T载体中，转化、扩增重组质粒。提取大肠杆菌中的重组质粒进行DNA测序。将三组DNA测序所得到的基因序列进行对比分析。结果镉、镍转化组各细胞株（各10株）翻译起始因子的eIF3 p36 cDNA测序结果与正常对照细胞（10株）比较未发现基因的突变位点；所有镉、镍转化细胞和正常对照细胞株eIF3 p36 cDNA序列与Genbank数据库进行同源性分析，相似性比值均为100％。结论实验中镉、镍恶性转化16HBE细胞中翻译起始因子eIF3 p36上调未见基因序列改变，提示在镉、镍致癌中可能涉及到表遗传机制。     

表皮生长因子受体参与屋尘螨诱导的气道上皮屏障破坏的机制

目的 探讨屋尘螨(HDM)对肌动蛋白应力纤维(F-actin)重新排布的影响及表皮生长因子受体(EGFR)相关信号通路在其中的作用.方法 选取正常人支气管上皮细胞系16HBE细胞为研究对象,以HDM刺激细胞,予EGFR抑制剂AG-1478进行预处理,实验分为4组:Control组,AG-1478组,HDM组,AG-1478+HDM组,应用Western blotting检测HDM对磷酸化(p-)EGFR、F-actin及粘附连接蛋白E-cadherin和β-catenin表达的影响,应用免疫荧光技术观察F-actin、E-cadherin及β-catenin的分布变化,并测量16HBE细胞层的跨上皮电阻(TER)值和右旋糖苷(FITC-DX)的透过率.结果 HDM刺激细胞10 min时,p-EGFR表达明显增多(P<0.05),E-cadherin(P>0.05)及β-catenin(P>0.05)蛋白表达无明显改变,免疫荧光示HDM刺激后E-cadherin及β-catenin均发生分布异常,由胞膜向胞浆弥散.HDM组TER值(70.00±4.33)%显著下降,FITC-DX透过率(115.98±4.34)%明显增加,加入EGFR抑制剂后E-cadherin和β-catenin的分布异常及TER值(90.00±3.75)%、FITC-DX(101.10±2.10)%透过率均明显改善.HDM刺激后促进F-actin表达增多并出现重新排布,而EGFR抑制剂可明显抑制这一过程(P<0.05).结论 表皮生长因子受体相关信号通路参与了屋尘螨介导肌动蛋白应力纤维的重新排布,并导致气道上皮屏障破坏.     

烟曲霉菌提取物对人支气管上皮细胞修复功能的影响

目的 探讨烟曲霉菌对呼吸道上皮细胞修复功能的影响及其可能机制.方法 实验分为正常对照组、不同浓度(10、20、40 mg/L)AFE组、热处理AFE组.分别应用不同浓度和热处理的烟曲霉菌提取物(aspergillus fumigatus extract,AFE)作用体外培养的人支气管上皮细胞16HBE不同的时间,以细胞体外损伤修复功能、细胞迁移能力、定量细胞黏附能力、细胞伸展面积为指标,观察AFE和热处理的AFE对上皮细胞修复能力的影响.结果 20、40 mg/L AFE均明显抑制16HBE细胞的体外损伤修复功能、细胞迁移能力和细胞黏附能力(P<0.05),并呈明显的时间和浓度依赖性.10 mg/L AFE与正常对照组差异无统计学意义(P>0.05).10、20、40 mg/L AFE均明显抑制细胞的伸展能力(P<0.05),并呈明显浓度依赖性.另外,热处理AFE的蛋白酶完全灭活,对上述观察指标无明显影响(P>0.05).结论 AFE依赖其蛋白酶活性明显抑制细胞的修复功能,并呈明显的浓度和时间依赖性.     

Autophagy Attenuates MnCl2-induced Apoptosis in Human Bronchial Epithelial Cells

Objective To investigate the role of autophagy in MnCl2-induced apoptosis in human bronchial epithelial 16HBE cells.
Methods Cell proliferation was measured by MTT assay. Mitochondrial membrane potential (MMP) and apoptosis were measured by flow cytometry. Autophagic vacuoles were detected by fluorescence microscopy. Cellular levels of apoptosis and autophagy-related proteins were measured by western blotting.
Results 16HBE cell proliferation was inhibited by MnCl2 in a dose- and time-dependent manner. MnCl2-induced 16HBE cell growth inhibition was related to MMP depolarization prior to the induction of apoptosis. Our data revealed that MnCl2-induced apoptosis in 16HBE cells was mediated by decreased expression of Bcl-2 and increased levels of cleaved caspase-3. It was observed that when we exposed 16HBE cells to MnCl2 in a dose-dependent manner, the formation of autophagic vacuoles and the levels of LC-3B-II were elevated. RNA interference of LC3B in these MnCl2-exposed cells demonstrated that MMP loss and apoptosis were enhanced. Additionally, the pan-caspase inhibitor Z-VAD-FMK increased the cellular levels of Bcl-2 and decreased apoptosis, but did not affect the cellular levels of LC3B in MnCl2-treated 16HBE cells.
Conclusion MnCl2 dose- and time-dependently inhibits 16HBE cell proliferation and induces MMP loss and apoptosis. Autophagy acts in a protective role against MnCl2-induced apoptosis in 16HBE cells.     

脂多糖诱导的人气道上皮细胞Caspase-1的表达研究

目的探讨脂多糖（LPS）诱导人气道上皮细胞半胱氨酸天冬氨酸酶-1（Caspase-1）的表达情况。方法体外培养人气道上皮细胞,将其随机分为阴性对照组、LPS组及Caspase-1特异性抑制剂（Ac-YVAD-cmk）＋LPS组（简称cmk＋LPS组）。采用四氮唑盐（MTr）法测定各组细胞的增殖能力;实时荧光定量RT—PCR检测各组细胞Caspase-1mRNA的表达水平;Western—blot测定各组细胞Caspase-1蛋白的表达;ELISA法检测各组细胞上清液白介素1B（IL-1B）水平。结果3组细胞增殖差异无统计学意义（P〉0．05）;LPS组Caspase-1mRNA的表达水平较cmk＋LPS组和对照组增高,3组间差异有统计学意义（P〈0．05）;LPS组Caspase．1蛋白的表达明显高于对照组和cmk＋LPS组,3组间差异有统计学意义（P〈0．05）;LPS组IL．1B水平高于对照组和cmk＋LPS组,3组间差异有统计学意义（P〈0．05）。结论NLRP3炎症复合体诱导的Caspase．1活化参与人气道上皮细胞LPS的致敏过程,并促进下游IL-1B的生成。     

烟雾凝聚物对人正常支气管上皮细胞中p16转录的抑制作用及其机制

目的：通过体外模拟吸烟过程来检测抑癌基因p16表达的变化,探讨p16基因在吸烟导致肺癌发生过程中的作用。方法：常规正常支气管上皮细胞（HBE）分为实验组和对照组,分别接受烟雾凝聚物和DMSO处理。利用免疫印迹和Realtime RT-PCR分别检测P16蛋白表达和mRNA的转录水平。构建p16的基因组启动子载体,利用荧光素酶分析烟雾凝聚物对其转录活性的影响。结果：不同浓度（0,10,25,50,100 mg•L^-1）的烟雾凝聚物处理HBE后,其p16的mRNA和P16蛋白表达水平明显降低,并且表现出剂量依赖性。大于25 mg•L^-1的烟雾凝聚物能明显抑制P16蛋白表达和mRNA的转录水平,与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）,其中100 mg•L^-1烟雾凝聚物表现出最大的抑制效应。烟雾凝聚物也能以剂量依赖方式抑制p16启动子的转录活性,大于25 mg•L^-1的烟雾凝聚物能显著抑制p16启动子的荧光素酶活性,与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）,其中100 mg•L^-1的烟雾凝聚物表现出最大的抑制效应。结论：烟雾凝聚物能够抑制p16启动子的转录活性,进而抑制P16蛋白的表达;P16蛋白表达水平的降低可能是吸烟导致肺癌发生的一种分子机制。     

核因子-κB在红霉素抗炎机制的表达

目的：从分子水平上探讨红霉素（EM）的抗炎作用机制,为临床防治慢性阻塞性肺疾病提供新的思路。方法：体外培养人支气管上皮细胞（16HBE）,将细胞随机分为8组,先加入EM干预,后加入肿瘤坏死因子（TNF-α）刺激。分组：①空白对照组;②TNF-α（20μg／L,16h）;③EM（0．3mg／L,24h）＋TNF-α（20μg／L,16h）;④EM（3mg／L,24h）＋TNF-α（20μg／L,16h）;⑤EM（30mg／L,24h）＋TNF-α（20μg／L,16h）;⑥EM（0．3mg／L,48h）＋TNF-α（20μg／L,16h）。然后收集各组细胞分别提取核蛋白,应用电泳迁移率改变分析法（EMSA）检测核因子-κB（NF-κB）的活性。结果：EMSA结果显示,TNF-α刺激人支气管上皮细胞（16HBE）后,细胞内NF-κB表达增高。先加入不同浓度及作用时间的EM,后加入前炎因子TNF-α刺激16HBE,EMSA结果显示各组细胞NF—κB表达均降低,且提示有随着EM浓度增加,作用时间延长,NF-κB表达受抑制愈明显的趋势,但随着EM浓度增加及作用时间延长到一定的范围,NF-κB表达受抑制差别不明显。结论：TNF-α能激活16HBENF-κB,促进炎症的发生发展,在炎症进程中发挥着重要作用。EM能抑制人16HBENF-κB的激活水平,这可能是EM的抗炎作用机制之一。     

中波紫外线致16HBE细胞损伤及其机制

目的探讨中波紫外线(UVB)照射对人支气管上皮细胞(16HBE)的生物学效应及其机制。方法细胞分为不同照射剂量同一观察时间组(剂量分别为0、10、30、50、70、100 J/m2,观察时间为照后12 h)和同一剂量不同观察时间组(剂量为50 J/m2,观察时间为照后2、4、8、12、24 h)以观察UVB对16HBE细胞的存活率的影响;琼脂糖凝胶电泳观察细胞接受50 J/m2照射后其DNA的断裂情况、流式细胞术检查细胞周期、Western blot检查NF-kB的表达情况。结果 UVB照射后,可使16HBE细胞的存活率下降;DNA出现明显的"梯状条带";细胞发生S期阻滞以及NF-kB蛋白的表达增强。结论 UVB照射能引起16HBE细胞生长抑制和凋亡;其作用机制可能与NF-kB蛋白的表达增强有关。     

25羟维生素D3对支气管上皮细胞维生素D受体表达及分布的影响

目的探讨25羟维生素D3对人正常气道上皮维生素D受体表达及分布的影响。方法选取正常人支气管上皮细胞系16HBE为研究对象,MTT法分别检测不同浓度25羟维生素D3对细胞活力的影响;实验组分为对照组和不同浓度25羟维生素D3处理组。各处理因素作用细胞时间为24 h。用实时荧光定量PCR、Western blot、免疫荧光法观测各处理组维生素D受体(VDR)mRNA及蛋白表达、分布的情况。结果与对照组相比,各个不同处理浓度的25羟维生素D3对VDR的表达量及分布均无显著增加(P>0.05)。结论 25羟维生素D3对支气管上皮细胞的影响可能并不依赖于VDR的表达及转位。     

Lyn对屋尘螨诱导的人支气管上皮细胞中MUC5AC表达的影响及其机制

目的：探讨Lyn对屋尘螨（HDM）诱导的人支气管上皮细胞中MUC5AC表达的影响,并初步阐明其可能的相关作用机制。方法：选取人支气管上皮16HBE细胞,将其分为PBS组（给予PBS）和HDM组（给予1 μg·L^-1HDM）,采用脂质体转染法将LynsiRNA分别转至PBS组和HDM组细胞。构建人MUC5AC启动子荧光素酶报告基因,采用Promega双荧光素酶报告基因试剂盒检测相对荧光素酶活性（RLU）,采用免疫荧光法检测16HBE细胞中MUC5AC的表达,并在共聚焦显微镜下观察。采用Western blotting法检测16HBE细胞中STAT6的表达水平。结果：双荧光素酶报告基因检测,HDM组16HBE细胞中MUC5AC启动子的RLU高于PBS组（P<0.05）;与未干扰时比较,LynsiRNA干扰后HDM组RLU明显升高（P<0.05）。免疫荧光法检测,HDM组MUC5AC表达水平高于PBS组（P<0.05）;与未干扰时比较,LynsiRNA干扰后HDM组MUC5AC表达水平升高（P<0.05）。Western blotting法检测,LynsiRNA干扰后,HDM组细胞中STAT6表达水平升高（P<0.05）。结论：Lyn缺失能增加人支气管上皮细胞中MUC5AC的表达,其机制可能与Lyn调控STAT6信号途径有关。     

人支气管上皮细胞β防御素3表达调控的时效性

目的:观察不同浓度脂多糖(LPS)刺激人支气管上皮细胞(HBECs)不同时间后β防御素3基因(hBD-3Mrna))的表达,探索hBD-3在呼吸道细菌感染中的作用及其时效关系。方法:对照组和不同浓度LPS组(0.01、0.1、1、10μg/mL)诱导HBECs后,分别在不同时间点(1h、2h、4h、8h)行RT-PCR法检测hBD-3mRNA的表达。结果:hBD-3mRNA在对照组人支气管上皮细胞中有微量表达,不同时间组间无显著性差异(P>0.05);hBD-3mRNA在不同浓度LPS组中,随刺激时间增加hBD-3mRNA表达亦随之增加,不同时间组间比较有显著性差异(P<0.01)。结论:LPS能诱导HBECshBD-3表达上调,并在一定范围内呈时间依赖性,hBD-3可能参与气道对LPS最初的防御反应。     

GPC3-WNT-JNK通路介导脂多糖诱导肺局部细胞炎症

目的：探讨GPC3在脂多糖（LPS）诱导的气道上皮细胞局部炎症微环境中的重要作用,并以GPC3-WNT通路介导的调控机制为核心进一步研究LPS诱导的肺局部炎症分子机制。方法：LPS经气道滴入小鼠后模拟肺损伤模型,检测肺泡灌洗液及肺组织中GPC3表达情况以及其表达位置。培养人肺16HBE细胞,LPS刺激16HBE细胞建立急性炎症细胞,予以RT-PCR检测其细胞中GPC3、TNF-α和TGF-β的mRNA表达情况,予以Western Blot检测GPC3、TGF-β和TNF-α蛋白表达情况。加入外源性GPC3刺激16HBE细胞,建立GPC3高表达细胞模型,检测炎症因子TNF-α和TGF-β mRNA的表达情况。不同浓度GPC3-WNT通路抑制剂处理细胞,观察上述指标变化。结果：LPS诱导ALI小鼠模型显示GPC3表达水平显著提高。此外,LPS在体外也产生了GPC3表达升高的现象。同时,外源性GPC3蛋白刺激支气管上皮细胞产生多种炎症因子,可能提示GPC3具有促炎作用。此外,GPC3诱导支气管上皮细胞系炎性细胞因子的产生被WNT-JNK通路的抑制剂阻断,提示ALI/ARDS过程中GPC3参与肺局部的潜在信号通路。结论：LPS刺激支气管上皮细胞的过程中存在一条线性信号通路即GPC3-WNT-JNK。这一发现可能为ALI/ARDS的治疗和生物标志物的开发提供一个新的分子靶点和分子机制。