人支气管上皮细胞恶性转化过程中染色体畸变的研究

目的:研究在烟草特异性亚硝胺(NNK)诱发人支气管上皮细胞(BEAS-2B)恶性转化过程中染色体畸变,探讨其在吸烟高危人群罹患肺癌预警及普查方面的意义.方法用NNK诱发BEAS-2B细胞(BEAS-2BNNK)恶性转化,并在此过程中用常规中期染色体分析方法,动态观察染色体畸变的情况.结果:1.NNK诱发BEAS-2B细胞恶性转化模型的建立①BEAS-2BNNK(实验组)第5代细胞血清抗性显著增强.②第15代BEAS-2BNNK细胞具有锚着独立性生长特性.③第20代BEAS-2BNNK细胞超微结构出现明显异型性.④第25代BEAS-2BNNK细胞在裸鼠体内成瘤,病理为高分化鳞形细胞癌.2.染色体畸变①BEAS-2B(对照组)二倍体细胞占细胞总数的91%～97%,传代后核型稳定;从第5代开始BEAS-2BNNK细胞即逐渐失去正常核型,随着传代次数增加,二倍体细胞比例从83%递减至54%,异倍体及多倍体细胞呈递增趋势,较对照组明显增高.②各代BEAS-2B细胞结构畸变发生率为2%～4%;除第5代BEAS-2BNNK细胞结构畸变总频率(11%)明显高于BEAS-2B细胞外,其余各代细胞与BEAS-2B细胞相近.结论:NNK能成功诱发人支气管上皮细胞(BEAS-2B)细胞恶性转化,为进一步探讨肺癌发生机制、尤其是吸烟致肺癌发生机制提供了理想模型.染色体的异倍性和多倍性在NNK诱发BEAS-2B细胞转化成肺癌过程中可能属早期事件,有望成为吸烟高危人群罹患肺癌的预警及普查指标之一.     

烹调油烟冷凝物诱导永生化人支气管上皮细胞恶性转化的研究

 目的用烹调油烟冷凝物（COFC）诱导正常永生化人支气管上皮细胞（BEP-2D）慢性恶性转化,构建恶性转化的细胞模型,以探讨COFC 的危害。方法通过MTT 法确定诱导物的染毒剂量,以COFC 处理细胞,用血清抗性实验和锚着独立生长实验鉴定细胞恶性转化的倾向和恶性特征,比较对照组和实验组抗血清促分化的能力和集落形成率,并将细胞接种于裸鼠,观察其成瘤情况。结果以50 μg/mL的COFC对细胞进行染毒,传至第20 代细胞,与对照组相比,其抗血清促分化的能力差异均有统计学意义（ P< 0.01）;传至第35 代,转化细胞的锚着独立生长实验克隆形成率差异均有统计学意义（ P< 0.05）,并接种裸鼠成瘤,病理检查结果为低分化鳞癌。结论COFC 可诱导正常永生化人支气管上皮细胞发生恶性转化,提示烹调油烟对人体具有致癌致畸作用。     

烹调油烟冷凝物诱发支气管上皮细胞HPRT 基因位点突变的研究

目的 研究烹调油烟冷凝物致人支气管上皮细胞HPRT 基因位点突变的影响及二甲基亚砜的拮抗作用,以探讨烹调油烟的致突变性及其防护.方法 采用体外多核细胞法研究烹调油烟冷凝物对人支气管上皮细胞HPRT 基因位点的影响及二甲基亚砜的防护作用.结果 烹调油烟冷凝物诱发人支气管上皮细胞HPRT 基因位点突变, 且突变频率随着染毒浓度的增加而升高, 突变频率与烹调油烟冷凝物浓度之间存在一定的剂量- 效应关系,二甲基亚砜对HPRT 基因位点突变有显著的拮抗作用.结论 烹调油烟冷凝物能诱发人支气管上皮细胞HPRT 基因位点突变,二甲基亚砜能抑制烹调油烟冷凝物的诱变作用.HPRT 基因突变频率可望成为接触环境致突变物人群检测的敏感指标.     

亚砷酸钠诱导 HaCaT细胞恶性转化实验

目的探讨低浓度亚砷酸钠（NaAsO2）对人永生化但无致癌性的皮肤角质细胞株（HaCaT）的影响。方法（1）细胞培养：HaCaT细胞株常规培养,隔日换液,4 d传代;（2）细胞毒性实验：MTT法检测细胞毒性,确定最佳染毒剂量;（3）细胞转化实验：HaCaT细胞在含0．05 ppm NaAsO2培养液中连续传代培养40代（约160 d）,细胞培养期间,倒置显微镜下观察每代细胞形态的变化并采集图片,MTT法检测细胞增殖能力,半固体琼脂实验检测细胞克隆形成率。结果NaAsO2处理细胞形态学、增殖能力及非停泊依赖性能力均发生变化,主要表现为多核巨细胞,倍增时间缩短,在半固体琼脂培养基上形成集落及克隆形成率明显增加。结论NaAsO2处理的细胞发生恶性转化,砷诱导体外细胞恶性转化模型建立成功。     

胡麻油烟冷凝物致人胚肺二倍体细胞恶性转化的实验研究

目的研究胡麻油烟冷凝物致人胚胎二倍体细胞恶性转化作用.方法以人胚肺二倍体细胞株为靶细胞,建立体外转化系统,以胡麻油烟冷凝物作为受试物染毒人胚肺二倍体细胞,观察细胞转化情况,并对转化细胞进行生物学性状检测和鉴定.结果实验剂量范围内的胡麻油烟冷凝物（25～400μg/mL）能够诱导人胚肺二倍体细胞发生失去接触抑制性、饱和密度增大、血清需求降低,ConA凝集能力增强、锚着依赖性丧失等多种与肿瘤形成相关的表型改变,并且剂量-反应关系明显（r=0.972,P＜0.01）.结论胡麻油烟冷凝物具有诱导人胚肺二倍体细胞转化的作用.     

支气管上皮细胞表达IL-6和IL-8的研究

目的以支气管上皮细胞株BEAS-2B细胞为研究对象，观察在Th2型细胞因子和促炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNFα)的作用下，IL-8和IL-6的表达变化。方法通过RT-PCR方法测定Th2型细胞因子IL-4、IL-13以及促炎症因子TNFα单独和协同刺激下BEAS-2B细胞IL-8和IL-6的基因表达；通过ELISA方法测定细胞培养上清液中蛋白质的表达。结果在IL-4、IL-13和促炎症因子TNFα的单独刺激下，IL-6和IL-8的基因和蛋白质表达均较未刺激组显著增高；但IL-4、IL-13和TNFα协同刺激后，IL-8的基因和蛋白质表达进一步增高，而IL-6反而降低。结论支气管上皮细胞在TNFα和Th2型细胞因子的协同刺激下，通过调节IL-6和IL-8的表达，进一步调节嗜酸粒细胞性和非嗜酸粒细胞性炎症。     

支气管上皮细胞表达IL-6和IL-8的研究

目的以支气管上皮细胞株BEAS-2B细胞为研究对象,观察在Th2型细胞因子和促炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNFα)的作用下,IL-8和IL-6的表达变化.方法通过RT-PCR方法测定Th2型细胞因子IL-4、IL-13以及促炎症因子TNFα单独和协同刺激下BEAS-2B细胞IL-8和IL-6的基因表达;通过ELISA方法测定细胞培养上清液中蛋白质的表达.结果在IL-4、IL-13和促炎症因子TNFα的单独刺激下,IL-6和IL-8的基因和蛋白质表达均较未刺激组显著增高;但IL-4、IL-13和TNFα协同刺激后,IL-8的基因和蛋白质表达进一步增高,而IL-6反而降低.结论支气管上皮细胞在TNFα和Th2型细胞因子的协同刺激下,通过调节IL-6和IL-8的表达,进一步调节嗜酸粒细胞性和非嗜酸粒细胞性炎症.     

化学致癌物体外转化大鼠气管上皮细胞的研究

作者建立了大鼠气管上皮(rat tracheal epithelial,RTE)细胞的单层原代培养和RTE细胞体外转化实验,比较有滋养层和无滋养层RTE细胞转化系统的实验结果。首次证明烟草中的特殊亚硝胺——甲基亚硝基吡啶基丁酮(NNK)对RTE细胞有体外转化作用。在甲基硝基亚硝基胍(MNNG)和NNK诱导转化实验中,有滋养层和无滋养层体外转化系统得到的结果一致,而后者在RTE细胞体外转化应用中更为敏感而方便。     

LPA2受体介导LPA诱导的人支气管肺上皮细胞PAI-1表达

目的研究溶血磷脂酸(LPA)对原代培养人支气管肺上皮细胞(NHBE)表达纤溶酶原激活物抑制因子-1(PAI-1)的调节作用。方法原代培养人支气管上皮细胞培养于6孔板培养板内,经LPA诱导后,收取RNA裂解液并用实时荧光定量RT-PCR技术检测PAI-1 mRNA表达水平;利用RNA干扰技术研究LPA受体的作用。结果 LPA可诱导NHBE细胞PAI-1 mRNA表达上调且呈时间相关性,此效应可被LPA2 siRNA完全阻断。结论 LPA2受体介导LPA诱导NHBE细胞表达PAI-1。     

逆转录病毒壳蛋白p15E在人肿瘤细胞的表达

肿瘤生长经常伴发免疫抑制。在其成因中有源于肿瘤的免疫抑制活性物质，但其性质大多未阐明。本文报道，采用免疫组化、酶联吸附、流式细胞、核酸原位杂交等技术，观察有免疫抑制活性的逆转录病毒壳蛋白ｐ１５Ｅ在人肿瘤细胞中不同水平的表达情况。结果揭示：肿瘤细胞表达ｐ１５Ｅ比较普遍，从人食管癌、鼻咽癌、直肠癌、卵巢癌（包括癌性腹水和建株细胞系）、胃癌、乳癌等均可被检出。ＲＴ－ＰＣＲ检测显示癌患者的活化淋巴细胞ｐ１５Ｅ表达略高。这些结果提示：来自肿瘤，也许还有来自活化淋巴细胞的ｐ１５Ｅ在肿瘤伴发的免疫抑制中可能起重要作用。     

卡介苗对人肺腺上皮细胞表达Fall-39 mRNA及抗菌活性的影响

目的　探讨卡介苗能否增强 Fall- 39在人肺腺上皮 SPC- A- 1细胞中的表达 ,分离鉴定卡介苗刺激作用的有效胞壁蛋白组份 ,并检测其抗菌活性。方法　根据 Gen Bank中人 Fall- 39的 c DNA序列资料 ,设计特异性引物 ,应用 RT- PCR法检测 SPC- A - 1细胞 Fall- 39m RNA的表达 ,采用超声破碎细胞、蔗糖密度梯度离心、SephadexG- 75柱层析等方法分离卡介苗胞壁蛋白质组份 ;采用琼脂糖弥散杀菌法检测 SPC- A- 1细胞培养上清的抗菌活性。结果　卡介苗刺激 SPC- A - 1细胞 Fall- 39m RNA的表达明显增强 ,而且这种诱导增强表达在一定范围内具有刺激物剂量和时间依赖性。卡介苗胞壁蛋白层析所得 6个组份中 ,组份 4 (相对分子质量范围约 2 1～ 2 9× 10 3)诱导 SPC-A- 1细胞 Fall- 39m RNA的表达增强约 8.5倍 ,其培养上清的抗菌活性显著增强。结论　 BCG胞壁蛋白是 Fall- 39基因的激活因子 ,可诱导其基因的上调表达     

挥发性有机物混合物对人支气管上皮细胞系转化及染色体稳定性的影响研究

目的为探讨化学混合物联合致癌的机制,揭示恶性转化与染色体不稳定性之间的关系,本研究观察了挥发性有机物(VOC)混合物(以VOCs表示)对人支气管上皮细胞系BEAS-2B转化和染色体稳定性的影响。方法用VOCs作为诱导剂,以液体染毒后测定BEAS-2B细胞的半数致死量(LC50),以低剂量(8%LC50)对BEAS-2B细胞进行诱导,获得诱导细胞。观察细胞生长特性改变并筛选诱导克隆,然后用细胞遗传学方法 (G带染色法)观察诱导细胞染色体畸变情况。结果 BEAS-2B细胞在VOCs作用后细胞逐渐变大、变圆,细胞质丰富,并伴有多角形或不规则形;核嗜碱深染,体积增大,核仁增多;细胞复层生长,排列紊乱,细胞克隆为无序的条索状团块状排列。经VOCs诱导后细胞倍增时间〔(1.79±0.02)d〕较对照细胞〔(2.08±0.03)d〕缩短,而饱和密度〔(529.1±31.6)×104/ml〕、最大增殖倍数〔(104.8±6.2)倍〕均高于对照细胞〔(321.2±13.1)×104/ml和(54.6±5.4)倍〕,差异均有统计学意义(P<0.01)。VOCs诱导细胞第15代可在软琼脂培养基内形成典型的甚至肉眼可见的阳性细胞克隆,克隆形成率(35.02±7.80)%高于对照细胞(0.13±0.05)%,差异有统计学意义(P<0.01)。对照细胞与诱导细胞的染色体核型分布比较,差异有统计学意义(P<0.01);诱导细胞中二倍体(2n=46)比例降低,出现了一定数量的非整倍体(77条、80条染色体)、大量亚二倍体(<2n)、超二倍体(>2n&<4n)和多倍体(≥4n)细胞,其非稳定性畸变频率(67%)高于对照细胞(4%),差异有统计学意义(P<0.01)。结论 VOCs可使BEAS-2B细胞发生转化,并影响细胞染色体的稳定性,使其发生畸变并向恶性化方向发展。     

双歧杆菌胞壁蛋白诱导人肠腺上皮细胞β-防御素-2 mRNA的表达

目的 检测双歧杆菌对人肠腺上皮细胞β-防御素-2(hBD-2)基因的激活作用及其活性组分．方法 应用遵转录聚合膏链反应(RT—PCR)法和Northern杂交检测HT-29细胞hBD-2mRNA的表达；采用超声破碎细胞、超速离心、蛋白萃取等方法分离双歧杆菌胞璧蛋白质成分．结果 RT—PCR和Northern杂交分析显示，在正常培养条件下HT-29细胞无可见的hBD-2mRNA表达信号，但在双歧杆菌菌体、细胞璧和胞璧蛋白刺激下均检测出显著的hBD-2mRNA表达．结论 双歧杆菌能诱导人肠腺上皮细胞hBD-2基因的表达。双歧杆菌胞壁蛋白可能是其诱导作用的活性成分。     

Experimental Study onMalignant Transformation of Human Bronchial Epithelial CellsInduced by Glycidyl Methacrylate and Analysis on its Methylation

Objective To establish the model of human bronchial epithelial cells(16HBE) malignant transformation induced by glycidyl methacrylate(GMA) and define the different methylation genes at different stages.Methods DNA was extracted at different 16 HBE malignant phases and changes of genes DNA methylation at different stages were detected using Methylation chip of 'NimbleGen HG18 CpG Promoter Microarray Methylation'.Methylation-specific PCR(MSP) was used to observe the methylation status of some genes,and then compared with the control groups.Results The result showed that GMA induced 16 HBE morphorlogical transformation at the dose of8 μg/mL,and cell exposed to GMA had 1 374 genes in protophase,825 genes in metaphase,1 149 genes in anaphase,respectively;30 genes are all methylation in the 3 stages;318 genes in protophase but not in metaphase and anaphase;272 genes in metaphase but not in protophase and anaphase;683 genes in anaphase but not in metaphase and protophase;73 genes in protophase and metaphase but not in anaphase;67 genes in protophase and anaphase but not in metaphase;59 genes in metaphase and anaphase but not in protophase.Conclusion The pattern of DNA methylation could change in the process of 16 HBE induced by GMA.     

Exosomes Derived from Hydroquinone-transformed Human Bronchial Epithelial Cells Inhibited Recipient Cell Apoptosis by transferring miR-221

Objective Although benzene is a confirmed environmental carcinogen, the mechanism of its carcinogenicity remains largely unclear. The suggested oncogene, miR-221, is elevated and plays important roles in various tumors, but its role in benzene-induced carcinogenesis remains unknown. Methods In the present study, we constructed hydroquinone (HQ, a representative metabolite of benzene with biological activity)-transformed malignant cell line (16HBE-t) and analyzed the level of miR-221 in it with qRT-PCR. Exosomes from 16HBE-t cells incubated with or without an miR-221 inhibitor were isolated by ultracentrifugation, characterized by transmission electron microscopy and laser scanning confocal microscope, and then transfected into 16HBE cells. The effects of exosomal miR-221 on apoptosis induced by HQ in recipient cells were determined using flow cytometry. Results The amount of miR-221 in 16HBE-t was significantly increased compared with controls. When recipient cells ingested exosomes derived from 16HBE-t, miR-221 was increased, and apoptosis induced by HQ was inhibited. Blocking miR-221 in 16HBE-t using an inhibitor did not significantly alter miR-221 or apoptosis in recipient cells. Conclusion Exosomal miR-221 secreted by 16HBE-t inhibits apoptosis induced by HQ in normal recipient cells.     

高糖诱导人肾小球系膜细胞SGK的表达

目的　研究高糖环境中人肾小球系膜细胞(human mesangial cells, HMC) 中血清和糖皮质激素诱导的激酶(serum and glucocorticoid inducible kinase, SGK) 3种亚型SGK1、SGK2和SGK3的表达及意义。方法　将培养的HMC分为正常组(5 5 mmol/L D 葡萄糖)、高糖组(25 mmol/L D -葡萄糖) 和甘露醇对照组(19. 5 mmol/L甘露醇和5. 5 mmol/L D 葡萄糖)。采用RT PCR 方法检测SGK1、SGK2 和SGK3 mRNA 的表达, Western blot 方法检测SGK1蛋白的表达。结果　在高糖及甘露醇刺激下, HMC中SGK1、SGK2和SGK3 mRNA及SGK1 蛋白的表达明显上调(P<0. 05); 其中高糖上调SGK的表达明显高于甘露醇(P<0 .05)。结论　高糖能促进HMC的SGK1、SGK2 和SGK3mRNA及SGK1蛋白的表达, SGK1可能是高糖作用于HMC的细胞内信号通路中靶分子之一, 由它介导的高糖信号转导途径在糖尿病肾病的发生中可能起了重要作用。     

XRCC1在MMS致人细胞DNA单链断裂修复中的作用

[目的]阐明人X线修复交叉互补基因1(XRCC1)在人支气管上皮细胞DNA单链断裂修复(SSBR)中的作用.[方法]以XRCC1蛋向缺陷细胞株为模型,用标准断裂剂甲基磺酸甲酯(MMS)染毒,检测细胞存活、微核形成、彗星实验及细胞周期变化等方法测定细胞遗传毒性.[结果]XRCC1蛋白水平的降低使细胞对DNA损伤剂的杀细胞效应敏感度增加、微核形成增加、DNA单链损伤修复能力降低以及引起明显的细胞周期阻滞.[结论]结果提示XRCC1基因在DNA单链损伤修复及基因组稳定性方面起着重要的作用.