生物素标记DNA探针的研制(简报)

目前国内外应用核酸分子杂交技术检测外源基因以诊断病毒等微生物的感染,探测内源基因的多态性和缺陷以诊断遗传病和研究肿瘤。其中基因探针(即DNA探针)是关键,常用~32P放射性同位素标记DNA作探针。由于~32P脱氧核苷三磷酸半衰期短、价钱昂贵、主要依靠进口、以及保存和防护运输等原因,使基因诊断技术不能广泛应用。本文参考国外经验,用生物素标记的DNA作探针巳获得成功. 生物素标记的DNA是已知片断,例如作者用生物素标记HBV-DNA及Y染色体特异的DNA等.标记方法既采用传统的缺口平移法,以Bio-ll-duTP(BRL公司产品)为标记底物,标记双链DNA还     

应用特异双引物法标记DNA探针

作者应用位于探针DNA两端的两个DNA片段作引物,以探针DNA为模板,在大肠杆菌DNA聚合酶I的介导下,经过1—3次变性、退火和延伸过程,使探针DNA得到标记.3次实验结果表明,应用此法标记的DNA探针的比活性可以达到2×10~(14)cpm/g DNA,标记效率大于60％;而用缺刻翻译法标记的DNA探针,其标记效率只有22.7％.表明这是一种较好的DNA探针标记方法.     

PCR制备地高辛配基标记的探针检测登革病毒核酸

用聚合酶链反应(PCR)技术,以重组质粒PDEⅡ305 DNA为模板,在底物中补充标记的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(DIG-dUTP),经扩增反应制备了地高辛配基标记的登革病毒2型(DEN_2)cDNA探针。DNA-RNA斑点杂交表明该探针有DEN_2型特异性,可检出0.1Pg DEN_2-RNA。PCR扩增标记只用10 ng模板DNA,数小时内可制备约Iug标记的cDNA探针,而用六聚核苷酸随机引物(RHP)标记,从质粒DNA酶切、片段回收到标记获得探针,至少需数10 h。可见PCR技术直接制备地高辛配基标记的cDNA探针较方便,快速、标记率高、特异性强,具有一定的应用前景。     

用地高辛配基标记DNA探针及其应用

核酸杂交技术中,同位素标记DNA探针是最常用的技术,其优越性是检测灵敏度高,但同时有很多缺点。80年代初,Langer等开始用生物素标记多核苷酸探针。随着方法的不断完善,近年来已用于基因诊断、定位及表达等研究。本文报道一种新的非同位素标记技术,即用地高辛配基(digoxigenin-dUTP)标记DNA探针,其原理是具有类固醇半抗原性质的地高辛配基,通过随机引物(random pr-imer法)掺入到DNA上,与靶DNA进行碱基互补同源序列结合形成杂交产物,然后通过酶联免疫法与     

随机引物法标记放射同位素DNA探针及其应用

我们报告应用随机引物和 DNA聚合酶I Klenow大片段进行放射性同位素 DNA探针标记,获得高比放射性DNA基因探针的方法。同时应用这种方法标记了MDRl基因cD-NA探针对脑胶质瘤基因组 DNA进行Southern blot杂交获得满意效果。我们认为,该方法较缺口平移标记法不仅放射比活性高,而且简便易行,是一种适合临床开展分子生物学研究的实验技术。     

PCR制备地高辛配基标记的探针检测登革病毒核酸

用聚合酶链反应(PCR)技术，以重组质粒PDEⅡ305 DNA为模板．在底物中补充标记的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(DIG-dUTP)，经扩增反应制备了地高辛配基标记的登革病毒2型(DEN2)cDNA探针。DNA-RNA斑点杂交表明该探针有DEN2型特异性，可检出0．1pgDEN2-RNA。PCR扩增标记只用10ng模板DNA，数小时内可制备约1ug标记的cDNA探针，而用六聚棱苷酸随机引物(RHP)标记，从质粒DNA酶切、片段回收到标记获得探针，至少需数10h。可见PCR技术直接制各地高辛配基标记的cDNA探针较方便，快速、标记率高、特异性强，具有一定的应用前景。     

地高辛标记探针在斑点杂交检测HBV DNA中的初步应用

应用核酸分子杂交检测血清HBV DNA已成为诊断乙肝病毒(HBV),感染及判断其复制状态的重要手段。由于同位素标记探针的半衰期短及放射性污染等缺陷,限制了该技术的推广应用。生物索标记探针的灵敏度和特异性都不十分理想。本文制备地高辛际记的HBV DNA探针,初步应用于血清斑点杂交,是一种适合临床应用的探针检测技术。     

非同位素标记DNA探针和凝胶迁移分析法测定NF-κB激活实验研究

目的:探讨地高辛标记DNA探针和凝胶迁移分析法测定NF-κB激活的优势。方法:用地高辛标记NF-κB基序DNA探针,检测标记效率,探针与核蛋白的结合反应产物经过聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜,高温干燥后,与碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体杂交,加入CSPD检测化学发光强度。结果:按照上述方法标记DNA探针,标记效率较高。样品核蛋白与地高辛标记的NF-κB基序DNA探针共同孵育,两者相互结合,进行凝胶迁移分析,出现高密度的迁移带。在反应体系中额外加入过量未标记的NF-κB基序DNA探针或抗NF-κB/P65或NF-κB/P50抗体后,抑制了两者的结合,迁移带消失,而加入过量未标记的Oct2A基序DNA探针,不能抑制两者结合,迁移带密度无明显降低,证实了核蛋白NF-κB与DNA探针结合的特异性。结论:本方法无放射性污染,无需特殊设备,操作简便、稳定性好、敏感性强,图像清晰、背景低。     

用生物素标记DNA探针检测红内期间日疟原虫

在疟疾基因诊断的研究中,目前所用的DNA探针大多是用放射性同位素~(32)P标记的,~(32)P有辐射能量强和检测敏感度高的优点,但是半衰期短,价格昂贵,有辐射危害和易污染环境等不足之处,难以用于疟疾流行病学现场.用非同位素取代放射性同位素标记探针是疟原虫核酸探针研究中的大趋势,作者首次报道用生物素标记DNA探针检测红内期间日疟原虫.1 材料和方法 含间日疟原虫DNA插入片段的重     

随机引物引导的乙型肝炎病毒DNA探针标记和重复杂交

随机引物引导的探针标记足一种比切中移位更为有效的探针标记方法,作者应用这种方法制备~(32)P标记的乙型肝炎病毒(HBV)DNA探针。经液闪测定,探什比放射性为lxl0~(9)cpm/ug,(32)P掺入率为71.43％,均比切口移位有关参数上限高出数倍。将这种探针用于尼龙膜载样杂交,在每100cm~(2)的样膜所加探针放射性强度为5 x10~(6)cpm、浓度为20ug/L条件下,放射自显影24小时即可出示清晰结果。并且检出HBV DNA灵敏度达0.1Pg,检测HBSAg和HBCAg双阳性血清,HBVDNA阳性率达87％(26/30)。用这种方法还制备地高辛素标记的HBV DNA探针,并在探针浓度为20 ug/L条件下,对~(32)p探针杂交过的样膜重复杂交。结束检出HBV DNA灵敏度为0.05 Pg,检测HBsAg和HBeAg双阳性血清,HBV DNA阳性率为73％(22/30)。上述结果表明随机引物引导标记可用于制备高比放同位素探针和高敏感性非同位索探针。前者对研究微量基因必不可少,后者对基层单位常规开展检测非常重要。     

应用pAW101 DNA探针作人流胚胎组织的亲权鉴定

用pAW1015kb的DNA片段为探针检测人流胚胎与其亲代的DNA限制性片段长度多态性(RFLPs)的遗传关系。同时测定他们的某些同工酶(葡萄糖磷酸变位酶、酯酶D、乙二醛酶Ⅰ)型。在不违反孟德尔遗传规律的前提下,按M(?)ller-Essen公式计算,其父权概率都已达到或超过可以确认亲生关系的标准。这一方法的建立,使过去棘手的早期妊娠的亲权鉴定之难题获得圆满解决。此外,本文还对这一方法的优越性进行了讨论。     

血型检验四项统计学指标在综合判断亲子关系中的应用

本文提出用父权指数ＰＩ值、父权概率Ｗ值、母子对的累积非父排除总概率ＰＥ值及考虑后概率的父权概率ＰＰ值等４项统计学指标对未排除亲子关系案例的血型检验结果，作定量分析比较，按所给参考标准，综合判断亲子关系的方法；推导出ＰＩ、ＰＰ和ＰＥ值的简便计算公式　并进行了例算分析。本法简易实用，可提高肯定父权结论的可靠性。     

Identifiler体系在亲子鉴定中的应用分析

目的 运用AmpFlSTR Identifiler PCR 扩增试剂盒用于亲子鉴定126例,探索此试剂盒在亲子鉴定案例中的应用价值.方法 采用荧光标记STR-PCR复合扩增、毛细管电泳基因分型技术,应用ABI 310遗传分析仪对126例亲子鉴定的个体进行15个STR位点的基因分型.结果 在126例亲子鉴定中,否定亲权的25个案例中均至少有3个位点不符;认定亲权的101例中,亲子关系指数(RCP)均＞99.98%,在认定的亲子关系中,有3例出现1个位点的基因突变.结论 应用Identifiler 体系的15个STR位点的基因鉴定,能成功地开展亲子鉴定,并显著提高了亲子关系指数.     

DNA探针的PCR标记法

采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）对幽门螺杆菌染色体ＤＮＡ片段进行地高辛配基标记制备探针，与经典的随机引物标记法相比较，ＰＣＲ标记法能使探针产量明显提高，而且快速、经济，值得进一步应用和探讨。     

高温对人外周血淋巴细胞DNA、RNA及蛋白质合成的影响

高温作为辐射增敏技术,与放疗相结合,用于临床治疗肿瘤已取得显著的进展。我们应用同位素标记的方法,对人外周血淋巴细胞进行高温处理(43℃),结果提示高温能影响淋巴细胞DNA、RNA及蛋白质的合成,其热敏感性顺序与辐射相同,即DNA>RNA>蛋白质,并就其作用机制进行了详细的讨论。     

随机扩增多态DNA技术在地高辛标记HCMV DNA探针中的应用研究

应用ＲＡＰＤ－ＰＣＲ技术结合地高辛非放射性标记系统制备了人巨细胞病毒ＤＮＡ探针，并与常规随机引物法进行对照。ＲＡＰＤ－ＰＣＲ制备的ＨＣＭＶＤＮＡ探针长度呈多态性，扩增过程中不需合成特异引物，探针特异性强，产量高，用５０ｎｇＨＣＭＶＤＮＡ模板即可制备８．０μｇ探针；标记体系中ＲＡＰＤ－ＰＣＲ方法Ｄｉｇ－ｄＵＴＰ浓度为５．２％。表明ＲＡＰＤ－ΡＣＲ技术可用于少量ＤＮＡ模板制备大量ＤＮＡ探针，适用于原位杂交等需高浓度探针的核酸杂交及临床大量标本的测试，是一种经济方便的探针制备技术     

Detection of filarial larvae in mosquitoes with oligonucleotide probe

Ｎｏｗ,ｔｈｅｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｏｆｆｉｌａｒｉａｓｉｓｉｎＣｈｉｎａｈａｓｂｅｅｎｄｅｖｅｌｏｐｅｄｉｎｔｏｔｈｅｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎｓｔａｇｅｆｒｏｍｃｏｎｔｒｏｌｓｔａｇｅ．Ｆｉｌａｒｉａｌｎａｔｕｒａｌｉｎｆｅｃｔｉｏ...     

牙龈卟啉菌全染色体探针的鉴定

（1）目的 对地高辛标记的牙龈卟啉菌47A-1全染色体探针的敏感性和特异性进行检测。（2）方法 采用斑点印迹法和狭缝印迹法，将获得的牙龈卟啉菌47A-1全染色体探针与口腔中14种共18株常见细菌DNA进行杂交鉴定，检测其敏感性和特异性。（3）结果 探针敏感性达到lng同源序列水平，与18株口腔内常见菌种的杂交结果显示，除与3株同种菌杂交外，与中间型普氏菌、产黑色素普氏菌、栖牙类杆菌、多形类杆菌以及不解糖卟啉菌等相关菌存在不同程度的交叉反应，采用氯化锂法纯化探针对杂交结果没有明显影响。（4）结论 牙龈卟啉菌47A-1全染色体探针敏感性较高但特异性不强，其制和轩容易，化学性质稳定，具有一定的推广使用价值。     

PCR法快速制作地高辛配基标记的人型结核杆菌DNA探针

该文探索了用PCR法快速制作地高辛配基标记的DNA探针的方法．证明可靠、安全、快速。对结核病防治而言，找到了一种优于结核培养的查菌方法；对其他需DNA探针的情况而言，该文探索到一种快速制作法。     

重组P53基因在HepG-2中的表达及作用

为进一步探索正常Ｐ５３ 对肿瘤细胞增殖的抑制作用,本文用磷酸钙ＤＮＡ共沉淀法,将本室构建的ＰＸＴ１Ｐ５３ 真核表达细胞转移至ＨｅｐＧ２ 肝癌细胞系内,经斑点杂交技术和间接免疫荧光技术证实,外源性Ｐ５３ 基因已在ＨｅｐＧ２ 细胞中稳定表达,导入的Ｐ５３基因亦能抑制ＨｅｐＧ２ 肝癌细胞系增殖并诱导其凋亡。实验结果提示正常Ｐ５３ 基因可成为治疗不同肿瘤的重要靶分子之一。