血管内皮生长因子反义寡核苷酸抑制甲状腺癌血管生成的效应

目的探讨反义寡核苷酸(ASODN)抑制甲状腺癌细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达及内皮细胞生长的效应。方法设计合成靶向VEGF的ASODN转染人髓状甲状腺癌细胞系(TT)细胞,并制备相应条件培养基作用内皮细胞ECV304,设正义寡核苷酸(SODN)和空白对照组进行比较。观察细胞生长状态,RT PCR、免疫细胞化学法检测TT细胞VEGFmRNA和蛋白表达,四氮唑蓝法检测TT和ECV304细胞生长抑制率(IR),流式细胞仪、吖啶橙/溴化乙锭染色法检测ECV304细胞凋亡状态。结果ASODN组TT细胞VEGFmRNA和蛋白表达显著低于SODN和对照组(P<0.01),但IR差异无统计学意义(P>0.05);各转染组ECV304细胞IR差异亦无统计学意义(P>0.05);而经各ASODN组TT细胞条件培养基作用的ECV304细胞生长明显受抑,IR(分别为0.21±0.03、0.31±0.01、0.42±0.22)显著高于SODN组(0.05±0.03,P<0.01),并伴明显细胞凋亡,上述效应呈浓度依赖性。结论ASODN可通过特异性封闭甲状腺癌细胞VEGF表达,抑制内皮细胞生长,干扰肿瘤血管生成。     

Ku70反义寡核苷酸增强甲状腺癌细胞的辐射敏感性

目的 研究DNA修复基因Ku70反义寡核苷酸(ASODN)对甲状腺癌细胞辐射敏感性的影响.方法 设计合成特异性靶向Ku70的ASODN,以不同浓度转染人甲状腺髓样癌细胞(TT),并设脂质体和正义寡核苷酸(SODN)对照组进行比较.采用Western印迹技术检测各组细胞中Ku70蛋白表达水平.利用不同剂量60 Co γ射线照射细胞后,细胞克隆形成实验检测细胞存活分数.CCK-8法、Annexin-V/PI染色法分析ASODN对细胞活力和细胞凋亡的影响.彗星电泳法比较γ射线照射后DNA双链断裂的修复效率.结果 转染ASODN各组细胞Ku70蛋白表达均较脂质体对照组、SODN组明显降低,并呈浓度依赖性;照射后细胞存活率降低(P＜0.01),凋亡率显著增加(P＜0.01),DNA双链断裂的修复效率降低(P＜0.01).结论 ASODN能够特异性地下调甲状腺癌细胞Ku70的表达,抑制γ射线照射后细胞存活和DNA双链断裂修复,提高肿瘤细胞的辐射敏感性.     

Survvin反义寡核苷酸诱导人胃癌细胞凋亡的作用

目的探讨生存素（Survivin）反义寡核苷酸（ASODN）诱导人胃癌细胞SGC7901凋亡的作用。方法设计合成特异性靶向Survivin的ASODN,将胃癌细胞株分为空白对照组（Sham组）、脂质体转染对照组（Lip组）、正义链转染对照组（Lip-SODN组）和ASODN转染组（Lip-ASODN组）。作用48h后,Westemblot法检测各组Survivin表达情况,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,免疫组化SP法检测细胞中PCNA表达情况。结果脂质体介导Survivin ASODN转染后的胃癌细胞Survivin蛋白表达明显下降;ASODN转染组细胞凋亡率明显高于各对照组（P均〈0．05）,各对照组间无统计学差异（P〉0．05）。ASODN转染后胃癌细胞中PCNA表达水平明显降低。结论 Survivin ASODN转染胃癌细胞能下调Survivin蛋白表达,诱导胃癌细胞凋亡,抑制细胞增殖,具有明显的抗癌作用。     

VEGF反义寡核苷酸对体外生长的大肠癌HT-29细胞的抑制作用

目的:探讨血管内皮生长因子(VEGF)反义寡核苷酸(ASODN)对体外生长的人大肠癌HT-29细胞的抑制作用.方法:实验设空白对照组、脂质体转染组、错义链转染组(SODN组)和不同浓度反义链转染组(ASODN组).用LipofectamineTM2000介导的VEGF ASODN和错义寡核苷酸(SODN)转染人大肠癌细胞株HT-29,半定量RT-PCR检测各组细胞VEGF mRNA的表达:Western blot测定转染48、72 h后VEGF蛋白表达:MTT法和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡.结果:转染48 h后,ASOND组的VEGF mRNA表达水平明显低于脂质体对照组和SODN组(0.455±0.032 vs 0.934±0.031,0.915±0.004,p<0.01);脂质体对照组与SODN组之间无显著差异.细胞转染48、72 h后,ASODN组蛋白表达明显弱于脂质体对照组和SODN组,且72h弱于48 h.与对照组比较.VEGF ASODN对HT-29细胞有明显的生长抑制作用,并且抑制呈剂量和时间依赖性(P<0.05).结论:VEGF ASODN通过抑制VEGF的基因表达,对体外生长的人大肠癌HT-29细胞的增殖进行抑制.     

survivin反义寡核苷酸对SMMC-7721细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察survivin反义寡核苷酸(ASODN)对人肝癌细胞株SMMC-7721增殖和凋亡的影响.方法 人工合成survivin基因ASODN和正义ODN(SODN),并行硫代磷酸化修饰,通过脂质体途径转染SMMC-7721;分别用RT-PCR和Western blot检测survivin mRNA和蛋白表达;用MTT法检测ASODN对SMMC-7721增殖的影响;流式细胞仪检测细胞周期变化及细胞凋亡率;倒置显微镜观察细胞形态变化.结果 SMMC-7721可强表达survivin mRNA和蛋白;ASODN呈浓度依赖性抑制survivin mRNA和蛋白表达及SMMC-7721增殖,诱导细胞凋亡,使细胞阻滞于G2/M期.SODN对survivin mRNA和蛋白及SMMC-7721的增殖、细胞周期无明显抑制作用.结论 脂质体介导转染survivin ASODN可抑制细胞增殖、使细胞阻滞于G2/M期,从而促进细胞凋亡.     

端粒酶逆转录酶基因反义寡核苷酸抑制肺癌细胞端粒酶活性和诱导细胞凋亡

目的 研究端粒酶逆转录酶（hTERT)基因反义寡核苷酸（ASODN）对肺癌细胞端粒酶活性和细胞凋亡的影响。方法 实验分为ASODN组、正义寡核苷酸（SODN）组和空白对照组,所用ASODN和SODN的浓度分别为10μmol/L,脂质体为16mg/L,采用端粒重复扩增法、逆转录－聚合酶链反应、Western Blot及流式细胞术分别观察各组端粒酶活性、hTERP mRNA和蛋白质表达以及细胞凋亡。结果 ASODN组显著下调或抑制肺癌细胞端粒酶活性和hTERT表达,但直到第21天才出现细胞凋亡增多。结论 端粒酶活性与hTERT表达密切相关。     

存活素与血管内皮生长因子反义寡核苷酸对人甲状腺髓样癌裸鼠模型的作用

目的探讨存活素与血管内皮生长因子（VEGF）反义寡核苷酸（ASODN）对人甲状腺髓样癌（MTC）裸鼠模型的作用。方法构建的28只人甲状腺髓样癌裸鼠模型，随机分配到对照组和治疗组。对照组包括未处理组，正义寡核苷酸（SODN）组（VEGF SODN组和存活素SODN组）和SODN联合组；治疗组包括ASODN组（VEGF ASODN组和存活素ASODN组）和ASODN联合组。各组每日一次瘤内注射相应处理液，连续7d。治疗结束后l周末，杀死全部瘤鼠，切取瘤体，测算瘤重和抑瘤率以评价肿瘤生长情况，瘤组织石腊切片分别行HE、免疫组化和DNA末端原位标记法（TUNEL法）染色以评价组织病理构造、VEGF与存活素蛋白表达和细胞凋亡的变化。结果HE染色显示，治疗组血管生成明显降低。此外，相对于对照组，治疗组具有显著的VEGF和存活素低表达、高凋亡、低瘤重和高抑瘤率特点（均P〈0．01），并且ASODN联合组较ASODN组更为显著（均P〈0．05），而对照组间和SODN组间未见上述各特点的统计学差异。结论在裸鼠MTC模型，人甲状腺髓样癌存活素和VEGF的单或双靶向基因沉默治疗能够达到明显抑瘤效果。并且联合治疗更为突出。这为发展甲状腺髓样癌的基因治疗提供了实验依据。     

生存素反义寡脱氧核苷酸对人胃癌细胞株凋亡的影响

背景：生存素（survivin）是凋亡抑制蛋白（IAP）基因家族成员之一，在多数肿瘤组织中高表达。目的：观察生存素反义寡脱氧核苷酸（ASODN）对人胃癌细胞株凋亡的影响。方法：将体外培养的人胃癌细胞株SGC-7901分为不同浓度生存素ASODN组、无关寡脱氧核苷酸（N-ODN）组和对照组。以四甲基偶氮唑蓝（MTT）试验检测生存素ASODN对SGC-7901细胞生长的影响；通过形态学观察、DNA电泳和流式细胞仪分析反映细胞凋亡情况；以端粒重复序列扩增-酶联免疫吸附测定（TRAP-ELISA）方法检测端粒酶活性。结果：生存素ASODN能抑制SGC-7901细胞生长，诱导细胞凋亡，抑制端粒酶活性。凋亡细胞形态学上表现为细胞膜起泡、染色质固缩、核碎裂、凋亡小体形成；DNA电泳呈现凋亡特征性阶梯状条带；流式细胞仪分析显示G1期前出现亚二倍体凋亡峰。结论：生存素ASODN能诱导人胃癌细胞株SGC-7901凋亡，抑制细胞生长及其端粒酶活性。     

生存素反义寡核苷酸诱导肝癌细胞凋亡的实验研究

目的　生存素 (survivin)是近年来发现的凋亡抑制蛋白家族新成员 ,在多数恶性肿瘤组织中丰富表达。因此 ,观察生存素反义寡核苷酸转染对肝癌细胞凋亡、增殖、细胞对化疗药物敏感性的影响。方法　设计合成特异性靶向生存素的反义寡核苷酸 (ASODN)。肝癌细胞株hepG2 分为 6组 :空白对照组、脂质体转染对照组、正义链转染对照组、2 0 0、40 0和 6 0 0nmol/LASODN转染组。作用 2 0h后收获各组细胞。倒置显微镜观察细胞形态变化 ,Westernblot法检测各组细胞生存素表达情况 ,流式细胞术检测各组细胞增殖和凋亡指数 ,MTT法检测 5 氟尿嘧啶 (5 FU)和顺铂 (DDP)对各组细胞的生长抑制率。结果　各ASODN转染组细胞生存素表达有不同程度减弱 ,细胞变圆、折光增强、漂浮、细胞碎片形成等 ,而各对照组细胞生长良好 ;各ASODN转染组细胞凋亡指数明显高于各对照组 (P <0 .0 5 ) ,以 6 0 0nmol/L转染组最为明显 (P <0 .0 5 ) ,而各对照组间差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ;各ASODN转染组细胞增殖指数明显低于各对照组 (P <0 .0 5 ) ,以 6 0 0nmol/L转染组最为明显 (P <0 .0 5 ) ,而各对照组间差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ;等浓度化疗药物 5 FU和DDP对各ASODN转染组细胞的抑制率明显高于各对照组(P <0 .0 5 ) ,以 6 0 0nmol/L     

PBCA纳米粒介导的hTERT反义寡核苷酸对肺癌A549细胞周期和凋亡的影响

目的以聚氰基丙烯酸丁酯纳米粒（PBCA-NPs）作为端粒酶逆转录酶（hTERT）反义寡核苷酸（ASODN）载体，转染肺癌A549细胞，观察其对该细胞周期和凋亡的影响。方法PBCA-NPs携带hTERT ASODN转染A549细胞后，绘制细胞生长曲线表达细胞生长状态的变化；流式细胞仪（FCM）检测细胞周期及细胞凋亡情况。结果ASODN转染后A549细胞增殖减慢FCM检测结果显示．ASODN转染后细胞周期变化明显，细胞被阻滞于G0／G1期，细胞凋亡率明显增加。结论hTERTA SODN能有效改变A549细胞的细胞周期，诱导细胞凋亡的发生。     

Survivin antisense oligodeoxynucleotide inhibits growth of gastric cancer cells

AIM: To investigate the effect of transfected survivin antisense oligonucleotide (ASODN) on proliferation and apoptosis of gastric cancer cells. METHODS: The authors designed ASODNs targeting different regions of survivin mRNA, including surviving ASODN1, ASODN2 and ASODN3. ASODNs were transfected into gastric cancer cell line SGC 7901, cell growth was detected by MTT assay. Cells exposed to the potent oligonucleotide were also examined for apoptosis induction by FCM and fluorescence microscopy. Semiquantitive RT-PCR and Western blot examinations were carried for expression of survivin mRNA and protein. RESULTS: ASODN3 caused a statistically significant reduction of cell viability to 60.6% (+/-2.9%) (P<0.01), while ASODN1 and ASODN2 had no such changes (P>0.05). The cell growth was also significantly inhibited by ASODN3, compared with reversal and scrambled sequence. A significant loss of survivin mRNA was presented in ASODN3 treated cells and this was not seen in treatment with sense ODN or scramble ODN. Protein level was significantly decreased 48 h after survivin ASODN trasfected by approximately 2-fold decrease compared with untreated controls. However, ASODN3 did not induce significant apoptosis response until 48 h after transfection (P>0.05). CONCLUSION: ASODN3, which targets translation initiation part, can be identified as a most potent antisense compound. Srvivin ASODN3 may provide a novel approach to therapy of gastric cancer.     

The Mechanism Underlying Vascular Smooth Muscle Cell Apoptosis Induced by Atorvastatin may be Mainly Associated with Down-regulation of Survivin Expression

Purpose Studies have shown that statins may induce vascular smooth muscle cells (VSMCs) apoptosis. But its mechanisms are incompletely understood. In this study, we investigate the effects of atorvastatin and survivin antisense oligonucleotides (ASODN) on VSMCs apoptosis and the relation between survivin and VSMCs apoptosis. Materials and methods Cultured VSMCs were treated with atorvastatin and vascular endothelial grow factor (VEGF). Apoptosis of VSMCs at 6–72 h after treatment with atorvastatin was detected by means of Hoechst33258 staining. Survivin and Fas factors expression were detected by means of immunohistochemistry. Survivin and Fas mRNA expression were detected by means of RT-PCR. In order to determine the relations between survivin and VSMCs apoptosis, we also performed transfection of VSMCs with survivin ASODN using GenePORTER Transfection Reagent and studied the survivin protein expression by means of western blotting. Results VSMCs apoptosis after treatment with atorvastatin was increased in a dose- and time-dependent manner. The expression of survivin and survivin mRNA in VSMCs was significantly down-regulated at 24 h and disappeared at 48–72 h after treatment with atorvastatin. Fas and Fas mRNA in VSMCs could only be detected at 72 h and not at 6–48 h after treatment with atorvastatin. We did not observe any effects of VEGF on VSMCs apoptosis, on survivin and survivin mRNA expression, and on Fas and Fas mRNA expression in VSMCs after treatment with atorvastatin. At 48 hours after the start of transfection, survivin protein expression was significantly reduced after transfection with 0.5, 1.0 and 2.0 μg/ml of survivin ASODN and there was no survivin protein expression after transfection with 3.0 and 4.0 μg/ml of survivin ASODN. In contrast, in the GenePORTER only and SODN studies, survivin protein expression was observed with western blotting. Hoechst33258 staining showed that treatment of VSMCs with survivin ASODN resulted in VSMCs apoptosis. Conclusions Atorvastatin induces VSMCs apoptosis in a dose- and time-dependent manner. Transfection of survivin ASODN can directly induce VSMCs apoptosis. The mechanisms of VSMCs apoptosis induced by atorvastatin may be mainly associated with down-regulation of survivin expression in VSMCs. Up-regulation of Fas in VSMCs may play a role in later stages following atorvastatin treatment.     

存活素与血管内皮生长因子在甲状腺癌中的表达及其意义

目的探讨细胞凋亡抑制因子存活素在甲状腺癌中的表达效应及其与血管内皮生长因子(VEGF)表达的关系。方法采用免疫组织化学方法(SABC法)检测68例甲状腺癌、12例甲状腺腺瘤和10例正常甲状腺组织中存活素、caspase-3、VEGF蛋白表达,并结合甲状腺癌主要临床病理参数进行分析。结果存活素在正常甲状腺组织中未见表达,在甲状腺腺瘤中仅现微弱表达(16.7%),而在甲状腺癌中呈显著表达(57.4%);caspase-3在3种组织均有较高表达(70.0%、75.0%、69.1%),而VEGF在甲状腺癌和腺瘤中有不同程度表达(75.0%和41.7%);甲状腺癌中存活素与caspase-3表达无关,与VEGF表达显著正相关(r=0.302,P<0.05),且二者的表达在甲状腺癌组织学分型、临床分期及淋巴转移组间差异均有统计学意义。结论存活素特异性地表达于甲状腺癌组织中,可能通过阻抗细胞凋亡,并与VEGF协同促进血管生成,参与甲状腺癌的发生发展。     

Survivin反义寡核苷酸诱导肝癌细胞凋亡的作用

目的 用反义寡核苷酸封闭肝癌细胞中survivin基因的表达,研究其诱导细胞凋亡的作用及其机制。方法 用脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染人肝癌细胞株SMMC-7721细胞,流式细胞仪检测细胞周期变化及细胞凋亡比率,激光共聚焦显微镜观察细胞骨架微丝系统变化,激酶活性检测方法测定细胞内caspase-3活性变化,免疫沉淀法测定细胞内丝裂原活化蛋白激酶p38(p38MAPK)活性的变化。结果 脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染肝癌细胞后Ⅰ～Ⅵ组(空白对照、正义对照、400、600、800、1000ng/ml反义转染组)细胞内p38MAPK活性分别为7.03、7.07、13.47、16.37、43.97及47.87;caspase-3活性分别为0.015±0.010、0.014±0.002、0.026±0.003、0.042±0.001、0.093±0.001及0.100±0.001;Ⅳ～Ⅵ组细胞内p38MAPK及caspase-3活性较对照组明显升高。转染后细胞发生G_2/M期阻滞,Ⅰ～Ⅵ组细胞凋亡率分别为0.70％、0.76％、2.43％、7.82％、23.11％及31.35％,各实验组细胞凋亡较对照组明显增加。细胞内微丝形态结构破坏,Ⅰ～Ⅵ组细胞肌动蛋白平均荧光强度分别为189.69±6.68、184.23±8.76、173.14±8.15、99.48±6.57、76.69±10.05及63.80±6.79,Ⅳ～Ⅵ组细胞肌动蛋白平均荧光强度较对照组明显降低。结论 脂质体介导转染survivi