HLA-DQA1及DIS80基因分型在亲子鉴定中的应用

人类白细胞抗原 (ＨＬＡ)是与其他组织共有的极复杂的血型系统 ,其遗传多态性是其他血型无法比拟的。ＨＬＡ分型被广泛用于亲权鉴定和个体识别。传统的ＨＬＡ分型主要是微量淋巴细胞毒性试验及混合淋巴细胞培养试验。由于ＨＬＡ抗血清不易获得 ,且对检材要求较高 ,仅检测ＨＬＡ Ａ、Ｂ两位点上的抗原。随着分子生物学技术的发展 ,聚合酶链反应 (ＰＣＲ)技术在法医学中广泛应用 ,ＨＬＡ分型已逐渐从传统的检测细胞抗原水平过渡到检测基因分型 ,使个体鉴别能力及父权排除率有很大提高 ,亲权鉴定的父权相对机会 (ＲＣＰ)达到 99.98%。材料和方…     

幽门螺杆菌基因分型及耐药检测寡核苷酸芯片的制备及鉴定

目的探讨应用寡核苷酸芯片简单快速检测幽门螺杆菌(HP)感染并对其致病性相关的基因型及耐药性同时进行检测的方法,并进行鉴定。方法根据Hp的致病性将其分为cagA 和cagA-两种基因型,通过检测23SrRNA基因是否发生点突变判断其对克拉霉素的耐药性。应用寡核苷酸芯片技术对临床标本的Hp进行基因分型和耐药性检测,并制备相应的寡核苷酸芯片。通过构建的野生型模板和突变模板证实制备的寡核苷酸芯片的准确性。结果制备的寡核苷酸芯片可准确地将Hp分为cagA 和cagA-两种基因型,并能够通过检测23SrRNA基因中4种常见的、与克拉霉素耐药性密切相关的点突变,判断幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药性。结论应用寡核苷酸芯片可快速检测Hp感染并同时对其致病性相关的基因型及耐药性进行检测。     

脑脊液病原菌16S rRNA微型寡核苷酸芯片检测方法的初步研究

目的 初步建立一种脑脊液标本中常见病原菌的快速检测方法。方法 根据病脊液标本中常见病原菌16SrRNA基因保守区的序列设计用于基因扩增的通用引物,制备细菌的通用探针、革兰阳性和阴性菌通用探针,以及肠杆菌科属、嗜血杆菌属和脑膜炎奈瑟菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肺炎链球菌、产单核李斯特菌的属或种特异性探针,将探针加尾后固定于尼龙膜上制成寡核苷酸芯片。提取标本中病原菌DNA后用通用引物行PCR扩增．扩增过程中用生物素标记;将产物变性后分别与点有各种探针的尼龙膜反向杂交．检测脑脊液中细菌的感染情况。结果 所有探针均只与其相应的细菌DNA扩增产物反应产生杂交信号。结论建立的脑脊夜病原菌寡核苷酸芯片能够准确、敏感、快速、高效地检测脑脊液标本中病原菌的感染情况。     

单克隆抗体修饰玻璃表面制备蛋白质芯片的初步研究

目的探讨应用单克隆抗体修饰玻璃表面制备蛋白质芯片的方法.方法用不同浓度的抗6X His单克隆抗体修饰玻璃表面,从蛋白质固定效率和固定蛋白质的反应活性两个方面,对修饰效果进行评价.结果初步观察到单克隆抗体修饰玻片对蛋白质的固定量较醛基化修饰的玻片没有明显增加,但其固定蛋白质中有反应活性的蛋白质的比例较高.结论单克隆抗体修饰的玻片也适合于制备蛋白质芯片.     

寡核苷酸芯片在胃癌p53基因热点突变检测中的应用研究

目的 应用寡核苷酸芯片技术检测胃癌p53基因突变的价值。方法 提取胃癌基因组DNA，以荧光标记引物进行PCR，扩增p53基因特异性片段；将修饰合成的探针按微矩阵排列点样于化学处理过的载玻片上，制成寡核苷酸芯片；将PCR产物与寡核苷酸芯片进行杂交，经严格洗片后在激光共聚焦扫描仪上扫描芯片，获取图象分析结果。结果 检测10例胃癌组织标本的p53基因突变情况，发现其中7例野生型，3例在第7外显子发生点突变。结论 p53基因突变与胃癌发生机制有关，同时芯片技术在检测基因突变方面的应用将对胃癌研究的基础理论及临床应用具有重要意义。     

人乳头瘤病毒基因分型芯片的研究

目的建立人乳头瘤病毒（Human papillomavirus,HPV）基因分型芯片技术,采用基因测序技术对该芯片进行评价,探讨其临床使用价值。方法利用基因工具软件比对HPV L1基因。设计可扩增高危型HPV的通用简并引物和可以鉴别HPV型别的基因探针,仪器将探针点样于尼龙膜上,制备HPV分型基因芯片。芯片检测的样本结果与HPV基因测序的结果进行比较,以评价芯片的分析性能。结果建立的HPV基因芯片的灵敏度为102cfu／ml,重复性检测的HPV型符合率为96．7％（87／90）,与基因测序结果分型的符合率高达94．3％（66／70）,可以检测常见的高危型和导致性传播疾病的HPV型别,可在6～7h内出结果,结果可通过仪器判读。结论HPV基因芯片具有较高的敏感性和重复性,与基因测序的结果符合率高,具有临床推广使用潜力。     

一种用于芯片质控的通用序列标签寡核苷酸探针的设计

目的设计一种带有通用序列标签的寡核苷酸探针以应用于寡核苷酸芯片点样的质量控制。方法以HIV寡核苷酸探针作为核心序列,在其一端或两端连接上多种通用序列标签（usz）构建新型探针。然后打印芯片,以Cy5标记的通用引物（Cy5-UP,与UST互补）进行杂交,筛选出5条荧光信号强的探针,重新打印芯片。再分别以不同浓度梯度的、Cy5标记的通用引物（Cy5-UP）和随机引物（Cy5-RP）与芯片杂交,比较两者杂交效率。结果Cy5-UP的杂交结果显著优于Cy5-RP的杂交结果,特别是在较低浓度时。结论利用Cy5标记的通用引物检测探针上的通用序列标签,可以为芯片点样的质量控制提供一种更有效的方法。     

一种新的修饰型反义寡核苷酸抑制肿瘤细胞表达bcl-2的初步研究

目的：用新的修饰型吗呆代反义寡核苷酸（M－ODN）抑制肿瘤细胞bcl-2的表达，探讨发展新的抗肿瘤药物的可能性。方法：用吗啉代bcl-2反义寡核苷酸作用于K－562细胞，并与全硫代修饰的bcl-2反义寡核酸（S－ODN）为对比，MTT法观察细胞生长抑制率，流式细胞术观察细胞凋亡率。结果：吗啉代修饰型的bcl-2反义寡核苷酸在作用效率、持久性及低细胞毒性等方面均优于硫代修饰。结论：反义吗啉代寡核有望成为新的肿瘤基因治疗手段。     

寡核苷酸醛基芯片点样条件的优化

对点样探针的浓度、探针缓冲液的浓度及pH值对醛基玻片探针固定效果的影响进行了探讨,实验结果表明:pH=9、探针浓度为200mmol/L时,探针固定效果较好,所制备的芯片的灵敏度高.     

应用寡核苷酸芯片检测白血病患者P53和K-ras基因点突变

目的 研究白血病病例中P53、K—ras基因点突变情况。方法 采用寡核苷酸芯片技术对临床收集的白血病标本进行P53、K—ras突变热点检测。结果 共检测出P53突变8例、K—RAS突变4例。其中P53突变包括ANLL—M3 2例，M2 3例，ANLL—M5、ALL、CML各1例。K—ras突变包括CML3例，ALL1例。结论 P53、K—ras突变在白血病发生、发展中起到一定作用。应用寡核苷酸芯片进行P53、K—ras点突变检测，优缺点并存，具有一定临床实用价值。     

藏、汉族人群HLA-DQA1、DQB1基因多态性

目的研究藏、汉族人群HLA-DQA1、DQB1等位基因频率分布及群体间的遗传距离。方法采用序列特异性引物聚合酶链反应（PCR／SSP）和PCR产物的限制性片段长度多态性分析（PCR／RFLP）方法检测HLA-DQA1、DQB1各等位基因频率。结果结果显示,OQA1＊0501和DQB1＊0301为藏族常见等位基因,频率分别为23．2％和33．0％;而DQA1、＊0301和DQB1,＊0301为房山汉族常见等位基因,频率分别为25．O％和28．1％。藏族OQA,＊0201,DQB．＊0201,0601等位基因频率明显低于汉族人群,P值分别为〈0．005,〈0．025和〈0．01;相反,藏族DQA．＊0501和DQB．＊0402等位基因频率明显高于汉族人群,P值分别为〈0．005,〈0．025。结论藏族与北方汉族HLA-DQA1、DQB。位点某些等位基因频率分布存在差异,可能与地理环境及自然选择有关。     

结核分枝杆菌基因分型及其耐药性分析

目的探讨四川地区结核患者结核分枝杆菌基因分型及其与耐药性关系。方法采用PCR和琼脂糖凝胶电泳技术,对124株结核分枝杆菌的6个可变重复位点进行检测,并应用Gel-Proanalyzer3.0软件和BioNumerics（Version3.0）软件对检测结果进行基因型分析,同时分析其基因型与耐药之间的关系。结果124株结核分枝杆菌共分为37个不同的VNTR类型,成簇基因型占74.19%（92/124）,单一基因型占25.81%（32/124）。耐药菌株在成簇类型和单一类型的分布上存在统计学差异。结论四川地区结核患者的结核分枝杆菌具有明显的基因多态性,成簇类型是主要流行菌株,应加强流行结核菌株的监控。     

HLA-DQA1基因多态性与支气管哮喘及慢性支气管炎易感性的比较研究

目的　研究支气管哮喘与慢性支气管炎患者HLA DQA1等位基因的异同。方法　采用限制性片断长度多态性聚合酶链反应技术 (PCR RFLP) ,对 4 0例支气管哮喘及 2 1例慢性支气管炎江西籍汉族患者进行HLA DQA1等位基因频率的检测 ,与 4 2例江西籍汉族正常人进行比较分析。结果　与正常对照组比较 ,支气管哮喘及慢性支气管炎组HLA DQA1 0 4 0 1基因频率均明显增高 (P <0 0 1) ,且在支气管哮喘组中 ,HLA DQA1 0 6 0 1基因频率明显增高 (P <0 0 1) ;支气管哮喘组与慢性支气管炎组比较 ,HLA DQA1 0 4 0 1、 0 6 0 1基因频率的分布无显著性差异 (P >0 0 5 )。其余各等位基因频率在三组间分布也无显著性差异 (P >0 0 5 )。结论　江西汉族人群的HLA DQA1 0 4 0 1、 0 6 0 1基因可能为支气管哮喘的易感基因 ,HLA DQA1 0 4 0 1基因可能为慢性支气管炎的易感基因 ,提示哮喘和慢性支气管炎有部分相同的免疫遗传机制。     

新疆维吾尔族HLA-DQA1基因多态性与乙型肝炎病毒感染结局相关性研究

目的 探讨新疆维吾尔族人类白细胞抗原(HLA)-DQA1区等位基因多态性与乙型肝炎病毒(HBV)感染临床转归的相关性.方法 应用序列特异性引物-聚合酶链反应技术(PCR-SSP)对70 例慢性乙型肝炎患者,46 例HBV携带者,42 例HBV感染后自然恢复者,80例健康献血员进行HLA-DQA1基因分型,并比较DQA1多态性的分布频率及其差异.结果 HBV感染后自然恢复组与健康对照组HLA-DQA1*0102分布频率高于慢性乙型肝炎组和HBV携带者组,差异均有统计学意义(P<0.05);HBV携带者组HLA-DQA1*0501分布频率高于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05);慢性乙型肝炎组HLA-DQA1*0501分布频率高于HBV感染后自然恢复组与健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05);其他各等位基因频率在各组间差异无统计学意义.结论 新疆维吾尔族人群中携带HLA-DQA1*0501等位基因者感染HBV后可能会增加慢性乙肝发生的风险,而携带HLA-DQA1*0102者可能会降低慢性乙肝发生的风险.     

妊娠期糖尿病与HLA-DQA1基因多态性相关性的研究

目的:探讨妊娠期糖尿病(GDM)的易感性与HLA-DQA1基因多态性的关系。方法:采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测35例GDM患者(GDM组)及35例正常妊娠晚期妇女(对照组)的HLA-DQA1基因多态性频率。结果:GDM组孕妇与对照组孕妇相比较,HLA-DQA1*0201基因频率明显升高(22.86%vs11.43%),差异有显著性(P<0.05)。结论:HLA-DQA1*0201基因在天津及秦皇岛地区汉族GDM患者中频率较高,可作为GDM易感基因的候选基因,未发现GDM的保护基因。     

HCV反向点杂交基因分型方法的建立

目的利用反向点杂交技术建立HCV基因分型新方法。方法在HCV5'端非编码区(5'NCR)设计引物和分型探针(1.2.3.6型),采用反向点杂交分型技术对53例HCV RNA阳性(浓度均在102～107IU/mL之间)血清进行分型,并以基因序列分析作为金标准,对新方法的敏感性、特异性和重复性进行评价。结果反向点杂交基因分型新方法检出的基因型有52例:1b型32例占60.38%,2a型4例占7.55%,6a型8例占15.09%,3b型8例占15.09%;未检出的基因型有1例,用基因序列分析也未能确定型別(失败的原因应是该HCV RNA扩增产物浓度偏低2.24×102IU/mL)。本研究的方法敏感性为98.1%,特异性为100%,随机抽取20份标本再次检测的结果与前次检测的结果完全一致,重复性好。结论相对现有的型特异性PCR分型、基因芯片、核酸序列分析等各种方法,反向点杂交技术用于HCV基因分型是一种准确有效和简便经济的方法。     

HLA-DQA1基因与广西地区2型糖尿病关联性的研究

目的:探讨2型糖尿病(DM)及其并发症与HLA的相关情况.方法:采用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)法对72名广西汉族2型糖尿病(DM)及46名汉族正常对照的HLA-DQA1位点进行基因分型.结果:2型DM组DQA1*0401等位基因频率明显低于正常对照组,DOA1*0104等位基因频率明显高于正常对照组,2型DM并肾病组和并高血压组DQA1*0501等位基因频率分别低于无肾病组和无高血压组.结论:广西汉族2型DM及其并发症与HLA有关联;HLA-DQA1*0401可能为2型DM的保护基因,HLA-DQA1*0104可能为2型DM的易感基因;HLA-DQA1*0501对2型DM并肾病、高血压具有保护作用.     

液相芯片技术在人乳头瘤病毒分型检测中的应用

目的构建人乳头瘤病毒(HPV)基因分型的液相芯片,针对中国常见的23种型别的HPV进行分型检测,并探讨其在临床应用中的特异性和敏感性。方法采用HPV通用型引物MY09/11以及一条简并引物对临床样本进行PCR扩增;针对HPV不同型别设计分型探针,并偶联到Luminex微球上,通过LuminexTM平台对PCR产物进行分型检测。同时以测序法作为验证标准,对液相芯片法(Luminex法)检测结果进行评价。结果以测序法作为验证标准,Luminex法对314例HPV样本的分型检测结果为灵敏度98.10%,特异性98.08%,符合率98.09%。Kappa一致性检验结果为0.962。结论 Luminex法用于HPV感染样本中的分型检测具有高灵敏度和特异性,可以用于临床HPV诊断。     

HLA—DQAl基因多态性与儿童Graves’病的相关性研究

目的 :分析重庆地区汉族儿童Graves’病 (Graves’disease,GD)与人类白细胞抗原DQA1基因 (HLA -DQA1)多态性的相关性。方法 :用聚合酶链反应 -单链构象多态性 (PCR -SSCP)及DNA测序方法 ,对已经确诊的重庆汉族GD患儿 85例和正常对照组 5 0名儿童的外周血白细胞基因组DNA的HLA -DQA1基因多态性进行分析。结果 :在GD组和对照组中检测到 7种单链构象 ,分别标为abcdefg带型。GD组中d(HLA -DQA1 0 10 2 )、f(HLA -DQA1 0 30 2 / 0 5 0 1)两带型频率 (分别为 4 3.5 % ,VS 8.0 % ;2 7.0 %VS 8.0 % )显著高于正常对照组 (χ2 =18.79,P =0 .0 0 1,RR =8.86 ;χ2 =6 .80 ,P =0 .0 0 9,RR=4 .2 7) ,而b带型 (HLA -DQA1 0 10 1/ 0 30 1)频率 (8.2 %VS 5 2 .0 % )显著低于正常对照组 (χ2 =2 9.4 3,P <0 .0 0 1,RR =0 .0 8)。结论 :HLA -DQA1 0 10 2和HLA -DQA1 0 30 2 / 0 5 0 1可能与GD易感性相关 ,而HLA -DQA1 0 10 1/ 0 30 1可能与GD的保护性相关。提示上述 3基因位点可能分别是重庆地区汉族儿童GD的易感基因和保护基因。     

HLA-DRB1基因芯片与PCR-SSP分型的比较

目的：比较基因芯片和PCR-SSP用于汉族南方人群HLA-DRB1基因分型的结果，评价分型芯片的准确性。方法：77份待分型样本，分别用等位基因特异的PCR-SSP和基因分型芯片对DRB1分型。芯片分型通过组间特异引物扩增基因组DNA，扩增用荧光标记。扩增标记后的产物与分型芯片的探针杂交，通过杂交产生的荧光信号确定样品的HLA-DRB1基因亚型，比较两种方法分型所获得的结果，不吻合的样本全部经第三方验证或测序。结果：77份样本，两种方法分型全部成功。分型结果的吻合率为93％。不吻合样本6份，其中SSP定型纯合子4份，芯片分型全部为杂合子。经第三方验证，证实芯片对纯合子和杂合子的分型全部正确。另外2份不吻合的样本经测序，证实SSP分型错误1份，芯片分型错误1份。芯片的重复率为96％。结论：基因芯片是一种理想的分型方法，具有特异性高、重复性好、操作简便、所需样本量少、一次可作多份样本的优点。