重组人血管抑素的克隆、表达及活性测定

目的：研究血管抑素（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）的临床应用价值,将其开发为多肽类药物。方法：ＲＴ－ＰＣＲ从胎儿肝脏钓取人血管抑素全编码区ｃＤＮＡ,使用Ｐｉｃｈｉａ分泌型酵母表达系统表达重组人血管抑素,重组蛋白经肝素亲和层析纯化后,以鸡胚尿囊膜法血管生成实验及小鼠创伤愈合实验检测活性。结果：重组人血管抑素在酵母系统中得到较高量表达（５ｍｇ／Ｌ）,经肝素亲和层析纯化,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示分子量为４３ｋＤ。活性实验表明,重组蛋白能够抑制新生管形成、抑制伤口愈合。结论：重组人血管抑素在酵母系统中实现高效表达,并具有很好的生物学活性。     

人ENO1(Enolase-α)基因的原核表达、蛋白纯化及多克隆抗体的制备

目的:构建人ENO1(human Enolase-α)基因的原核表达质粒,诱导重组蛋白的表达,利用纯化后的蛋白制备具有活性的ENO1多克隆抗体.方法:用PCR方法从胃癌MKN45细胞全基因组中扩增出目的基因ENO1,将目的基因和原核表达载体pET30a(+)分别双酶切,回收酶切产物并用T4连接酶连接,获得重组质粒pET30a(+)-ENO1.将重组质粒转入大肠埃希菌菌株BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用Ni-NTA亲和层析柱纯化,利用纯化的ENO1活性蛋白作为抗原免疫家兔,制备抗血清多克隆抗体,并用Western blot检测其特异性.结果:目的基因与原核表达载体经双酶切鉴定所切下的片段大小与理论值相符,测序结果表明重组人ENO1基因序列与NCBI(NM_001428.3)公布序列一致.经SDS-PAGE分析,结果显示重组蛋白的分子量约在47kDa,条带单一,无杂带出现,主要以可溶性形式存在.Western blot证实多克隆抗体制备成功.结论:成功表达、纯化了ENO1融合蛋白,制备了具有高特异性的多克隆抗体,为进一步肿瘤疫苗的研制和肿瘤标志物快速诊断的研究奠定基础.     

sFv及重组人TNF-α融合基因表达载体的构建及瞬时表达

目的 :构建pEGFP sFv rhTNF α表达载体 ,观察其在成骨肉瘤细胞 990 1中的瞬时表达。方法 :应用PCR方法对各目的基因进行扩增并经测序载体pGEM T Easy测序后 ,以逆转录病毒载体pLXSN中的多克隆位点将二者融合为融合基因sFv rhTNF α ,并将其亚克隆至pEGFP N3 的EcoRI和BamHI位点间 ,成功构建表达载体pEGFP sFv rhTNF α ,并在该载体转染人成骨肉瘤细胞 990 1后观察融合蛋白表达情况。结果 :酶切鉴定证实sFv rhTNF α融合基因片段已克隆到pEGFP N3 的EcoRI和BamHI位点间 ,并在转染人成骨肉瘤细胞 990 1中观察到sFv rhTNF α融合基因及绿色荧光蛋白的表达。结论 :pEGFP sFv rhTNF α表达载体便于观察转染细胞中sFv rhTNF α融合蛋白的表达情况及蛋白定位 ,为单链抗体基因联合细胞因子基因疗法提供有利条件。     

干扰素α-2a对人鼻咽癌细胞株CNE-I放射敏感性的影响

目的探讨干扰素α2a对人鼻咽癌细胞株CNEI放射敏感性及其细胞周期的影响。方法用不同浓度的干扰素α2a处理CNEI细胞后用6MVX线照射,计算细胞存活率。流式细胞仪分析CNEI细胞周期动力学改变。结果0.5×106、1.0×106、1.5×106IU/L干扰素α2a干预CNEI细胞后细胞存活分数分别为0.62、0.43、0.20,放射增敏比为1.16、1.57、1.93;1×106IU/L干扰素α2a干预CNEI细胞24h后,与对照组比较细胞增殖周期G1和G2+M细胞数增多,S期细胞数减少(P<0.01)。结论干扰素α2a能抑制人鼻咽癌细胞株CNEI的生长,并具有放射增敏效应,放射增敏机制可能与其调节CNEI细胞增殖周期有关。     

人α1抗胰蛋白酶基因的克隆及在COS-7细胞中的表达

目的克隆人α1抗胰蛋白酶(α1-AT)基因并在真核细胞中表达。方法以人α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)基因的总RNA为模板，采用反转录PCR法得到α1-AT的编码区cDNA，构建真核表达载体pcDNA3．1( )-α1-AT，在脂质体介导下转染非洲绿猴肾细胞系COS-7，经G418压力筛选建立稳定转染人α1-AT的细胞系，用Western印迹检测其在COS-7细胞中的表达。结果获得的人α1-AT cDNA序列与文献报道的核苷酸序列一致，Western印迹证实稳定转染人α1-AT的COS-7细胞系中有α1-AT的表达。结论构建了人α1抗胰蛋白酶的真核表达载体，并在COS-7细胞中获得稳定表达。     

小鼠蛋白激酶CK2α亚基的克隆、测序、表达及初步鉴定

背景与目的：蛋白激酶CK2是一种高度保守性的真核细胞中普遍存在的丝／苏氨酸激酶,它的活性在人的许多肿瘤细胞是升高的,可作为一种癌基因起作用。为了深入进行CK2结构与功能的研究,本研究拟构建小鼠蛋白激酶CK2α亚基cDNA重组表达质粒,并进行表达和初步鉴定。方法：通过反转录PCR从NIH 3T3小鼠成纤维细胞获得小鼠CK2α亚基编码区cDNA。将Nde I/BamH I双酶切PCR产物连接到同样双酶切并经牛小肠碱性磷酸酶去磷酸化的表达载体pT7-7进行定向克隆。转化感受态大肠杆菌DH5α获得转化子,琼脂糖凝胶电泳初步筛选转化子,将阳性克隆进行单和双酶切分析鉴定。随机挑选4个阳性克隆进行DNA测序,将序列完全正确的重组质粒转化表达菌BL21（DE3）,挑单克隆小量培养,IPTG诱导表达,Western blot鉴定。结果：转化子的阳性筛选率为100％;限制性酶切分析结果表明,插入片段和重组质粒的大小与理论推测值相符。DNA正反向测序结果表明：从4个阳性克隆中筛选1个PCR过程不产生突变的重组质粒,并将其质粒命名为pTMCKA。重组质粒转化表达菌经IPTG诱导后出现一分子量42kDa蛋白过度表达,Western blot结果证明过度表达产物能与抗人CK2α亚基抗体发生特异性免疫反应。结论：重组小鼠蛋白激酶CK2α亚基的克隆表达获得成功。     

癌-睾丸抗原GAGE-1基因的重组、表达及纯化

目的 为进一步研究临床应用癌-睾丸抗原GAGE-1诱导特异性抗肿瘤免疫反应,对GAGE-1基因进行克隆、体外原核重组表达及蛋白分离纯化。方法 运用RT-PCR技术从人QGY-7701肝癌细胞株中扩增GAGE-1基因片段,插入原核表达载体pGEX-6p-1中,构建重组表达质粒pGEX-6p-1-GAGE-1,并导入大肠杆菌BL21,IPTG诱导目的蛋白表达;经包涵体透析复性及GST柱亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析鉴定。结果 扩增得到GAGE-1基因5’端251 bp片段,与GeneBank公布的序列一致,构建的PGEX-6p-1-GAGE-1原核表达质粒经IPTG诱导,在大肠杆菌中表达分子量约35.7 kD的GST-GAGE-1融合蛋白,纯化后蛋白纯度为90%以上。结论 成功构建PGEX-6p-1-GAGE-1重组表达质粒,并成功表达纯化了GST-GAGE-1融合蛋白,为进一步深入研究GAGE蛋白奠定了基础。     

HSV-TK2重组TNF-α融合基因表达载体的构建及在肝细胞癌细胞中的瞬时表达

目的：构建双特异性细胞因子融合基因表达载体及在肝细胞癌细胞中瞬时表达。方法：应用PCR方法对各目的基因进行扩增并经测序载体pGEM-T-Easy测序后，以逆转录病毒载体pLXSN中的多克隆位点将二者融合为融合基因TK-TNF-α，并将其亚克隆至pEGFP-N3的EcoRl和BamHl位点间，成功地构建表达载体pEGFP-TK-TNF-α仅，并在该载体转染人肝细胞癌细胞HCC9204后观察融合蛋白表达情况。结果：酶切鉴定证实TK-TNF-α融合基因片段已克隆到pEGFP-N3的EcoRl和BamHl位点问，并在转染人肝细胞癌细胞7901中观察到TK-TNF-α融合基因绿色荧光蛋白的表达。结论：pEGFP-TK-TNF-α表达载体便于观察转染细胞中融合蛋白的表达情况及蛋白定位，为双特异细胞因子基因疗法提供有利条件。     

人肺癌细胞NHE—1基因片段的克隆及其反义表达载体的构建

Na~ /H~ 交换泵(Na~ /H~ exchanger,NHE)基因家族有5个亚型,分别命名为NHE-1,2,3,4及β-NHE,其中NHE-l是一种管家基因.NHE-l能通过Na~ /H~ 交换,将胞内H~ 排出,是维持胞内pH在中性或偏碱性(pH= 7.0～7.2)的一种重要膜蛋白.肿瘤细胞由于其糖酵解的反巴士德效应,导致酸性产物的异常增加,但肿瘤细胞能依靠表达增强的NHE-1膜蛋白,将胞内H~ 泵出胞外,阻止癌细胞酸化.而目前已证明胞内H~ 的蓄积将会诱发细胞凋亡.因此,抑制人肺癌细胞NHE-1基因上调表达将诱发细胞酸化和凋亡,达到肿瘤治疗的目的.为将来在有机整体中实施NHE-1基因抑制的肿瘤治疗奠定基础,我们从人肺癌组织细胞中克隆了NHE-1基因cDNA的部分序列,并构建了其反义表     

人可溶性APRIL（sAPRIL）基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 克隆并表达人可溶性增殖诱导配体(sAPRILA探索其在多种肿瘤细胞的增殖和存活以及促肿瘤形成中的作用。方法 从GENBANK中查找人APRIL蛋白(编号：075888)序列，取其部分胞外(sAPRIL)序列设计引物，用RT-PCR从扁桃体总RNA中扩增出人sAPRIL基因，测序后将克隆载体经酶切并构建表达载体，在大肠杆菌中表达，纯化蛋白后进行细胞学实验。结果 经克隆测序后进行同源比较，证实所克隆的基因即为sAPRIL在大肠杆菌中表达量达43．6％，获得纯化蛋白，3H-TdR掺入实验表明sAPRIL有明显刺激肿瘤细胞增殖的作用。结论 APRIL有明显促进肿瘤的形成及肿瘤细胞的增殖与存活的作用，该基因的克隆与表达为深入研究sAPRIL的功能奠定了基础。     

人睾丸肿瘤抗原MAGE-E1基因的克隆测序及在原核系统中的表达

目的：扩增及克隆人的MAGE-E1基因并利用大肠杆菌进行表达。方法：从人胶质瘤细胞系BT-325中提取总RNA，用RT-PCR从中扩增出MAGE-E1基因片段。将MAGE-E1基因片段插入载体pGEM-T easy中，经全自动序列分析仪测序正确后，再克隆至表达载体pGEX-4T-2中，构建重组表达载体pGEX-4T-2-MAGE-E1，并转化大肠杆菌进行表达。结果：1mmol／L．异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导5h，MAGE-E1蛋白表达即达高峰，SDS-PAGE及凝胶密度扫描分析表明，表达出Mr约41000大小的蛋白，占菌体总蛋白的35％。结论：成功扩增、克隆MAGE-E1基因，并在大肠杆菌中得到稳定高效表达。     

重组人canstatin的克隆、表达及其活性鉴定

目的: 克隆并表达canstatin基因，初步检测其抑制血管生成的活性。方法: 采用RTPCR方法从人胚肝组织中钓取canstatin cDNA，克隆入pMD18T载体中，并测序鉴定。在QIA表达系统中表达，Ni柱亲和层析纯化。进行生物学活性鉴定。结果: 经序列分析所获684 bp人canstatin基因与报道一致，重组进pQE30表达载体，IPTG诱导表达并纯化成功，表达产物能明显抑制血管生成。结论: 成功构建人canstatin cDNA克隆和表达载体并在大肠杆菌M15中高效表达。纯化回收产物在鸡胚绒毛尿囊膜（chorioallantoic membrane,CAM）实验中具有明显抑制血管生成活性     

人食管癌相关基因在大肠杆菌中的表达

目的　研究食管癌相关基因 1(ECRG 1)的编码蛋白质在大肠杆菌中的表达 ,进一步制备抗ECRG 1编码蛋白质的多克隆抗体。方法　用逆转录多聚酶链式反应 (RT PCR)方法克隆ECRG 1基因蛋白编码序列。构建该基因的表达质粒 ,在大肠杆菌中诱导表达 ,以Westernblot鉴定。用聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE电泳 )纯化的蛋白免疫BALB/C小鼠制备多抗。结果　RT PCR所分离的ECRG 1基因蛋白编码序列 ,经测序证明与 5′ RACE方法钓取的该基因序列相符。Westernblot证实该基因编码蛋白质在大肠杆菌中表达 ,并获得效价为 1∶32 0 0的多克隆抗体。结论　ECRG 1基因编码蛋白质能够在原核细胞中表达 ,并能获得抗ECRG 1基因编码蛋白质的多克隆抗体 ,为进一步深入研究该蛋白质的结构与功能打下了基础     

Snail/GST融合蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

引言上皮型钙粘附素(E-cadherin,E-cad)介导的粘附系统的破坏,是肿瘤从非浸润性转化为浸润性的关键步骤[1]。而锌指转录因子Snail,具有下调E-cad的作用[2],本研究通过制备Snail抗体,为进一步开展E-cad的功能研究和应用奠定了基础。1材料和方法1.1主要试剂和菌株主要试剂购自北京中山公司;大肠杆菌DH5a和BL21由北京大学临床肿瘤学院北京市肿瘤防治研究所细胞实验室保存。1.2 pGEX-4T-1/Snail原核表达载体的克隆从人血管内皮细胞提取总RNA,在逆转录酶作用下,合成cDNA。以逆转录的cDNA为模板,用上游引物5′-CT-GCAGGACTCTAATCCAG-3′(含有EcoRI内切酶位点)和下游引物5′-ATCCTTGGCCTCAGAGAGC-3′(含有Sal I内切酶位点),进行PCR扩增,得到Snail C-末端377bp的DNA片断;酶切、琼脂糖凝胶电泳分离后,用玻璃奶法(自制)纯化回收,与pGEX-4T-1原核表达载体定向连接。转化DH5α感受态细菌,提取质粒并酶切鉴定重组体。1.3融合蛋白的诱导表达与纯化1.3.1表达鉴定表达质粒Snail/pGEX-4T-...     

肾癌患者血清 VHL、HIF-1α和 HIF-2α的表达及临床意义

目的：探讨血清VHL,HIF-1α和HIF-2α的表达水平与肾癌临床病理特征的关系。方法收集肾癌患者43例（肾癌组）和同期健康查体者40例（对照组）;检测两组血清VHL,HIF-1α和HIF-2α水平;测定患者癌灶最大直径;对所有患者进行6个月随访。结果与对照组比较,肾癌患者血清VHL水平明显降低,而HIF-1α和HIF-2α水平明显升高（P＜0．01）;肾癌患者血清VHL、HIF-1α和HIF-2α表达与患者年龄、性别无明显相关（P＞0．05）,而与病理分级、临床分期、癌灶大小以及淋巴结转移显著相关（P＜0．01）;所有肾癌患者随访6个月,6例复发,37例未复发,复发组患者术后血清VHL水平明显低于未复发组,而HIF-1α和HIF-2α水平明显高于未复发组,比较差异均有统计学意义（ P＜0．05, P＜0．01）。结论血清VHL,HIF-1α和HIF-2α水平与肾癌病理分级、临床分期、癌灶大小以及淋巴结转移显著相关,提示上述指标可成为判定肾癌发生、发展以及复发的重要指标。     

sFv及重组人IFN—α融合基因表达载体的构建及瞬时表达

目的：构建pEGFP-sFv-rhIFN－α表达载体，观察其在成骨肉瘤细胞9901中的瞬时表达。方法：应用PCR方法对各目的基因进行扩增交经测序载体pGEM-T-Easy测序后，以逆转录病毒载体pLXSN中的多克隆位点将二者融合为融合基因sFv-rhIFN－α，并将其亚克隆至pEGFP-N3的EcoRI和BamHI位点间，成功构建表达载体pEGFP-sFv-rhIFN－α，并在该载体转梁人成骨肉瘤细胞9901后观察融合蛋白表达情况。结果：酶切鉴定证实sFv-rhIFN－α融合基因片段已克隆到pEGFP-N3的EcoRI和BamHI位点间，并在转梁人成骨肉瘤细胞9901中观察到sFv-rhIFN－α融合基因及绿色荧光蛋白的表达。结论：pEGFP-sFv-rhIFN－α表达载体便于观察转染细胞中sFv-rhIFN－α融合蛋白的表达情况及蛋白定位，为单链抗体基因联合细胞因子基因疗法提供有利条件。     

干扰素α-1b对HepG2细胞MMP-2和TIMP-2表达水平影响的研究

目的:研究α干扰素(IFN-α-1b)对人肝癌细胞系HepG2细胞MMP-2和TIMP-2表达水平的影响,探讨IFN-α抗肝细胞癌生长与转移复发的相关分子机制.方法:培养HepG2细胞,在不同剂量的IFN-α干预下,于不同时间提取上清液,通过ELISA方法检测MMP-2、TIMP-2蛋白的表达浓度.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法半定量检测IFN-α干预组与对照组MMP-2、TIMP-2基因mRNA的表达.结果:在培养HepG2细胞24及48 h后,IFN-α剂量为3 000 IU/mL时的MMP-2蛋白浓度分别为(1 725.3±300.7)及(2 899.8±343.2)ρg/mL,与空白对照组相比明显降低,差异有统计学意义,P值分别为0.001和0.000;各时间段TIMP-2浓度与对照组比较差异均无统计学意义;MMP-2、TIMP-2浓度比值较对照组显著降低,差异有统计意义,P值分别为0.003和0.001.48 h干预组(3 000 IU/mL)与对照组比较MMP-2 mRNA表达水平差异有统计学意义,F=2.711,P=0.005.结论:大剂量IFN-α可通过抑制HepG2细胞MMP-2的表达水平下调MMP-2、TIMP-2浓度比值,并呈剂量效应关系.IFN-α对HepG2细胞MMP-2表达的抑制作用在其抗肝细胞癌生长与转移复发中发挥一定作用.     

脂质体介导的人α-干扰素基因转移的肿瘤细胞克隆株的建立及其生物学活性的观察

肿瘤的基因疗法近年来有了飞速的发展，其中被认为很有希望在肿瘤基因治疗领域有所突破的途径之一就是肿瘤细胞靶向的细胞因子基因疗法。(Tumor cells-targeted cytokine gene thempy)α-干扰素(IFN-α)是一种经大量临床应用证实了的具有显著免疫调节作用和抗肿瘤、抗病毒作用的细胞因子：因此，     

HIF-1α基因沉默对人肺腺癌细胞A549裸鼠移植瘤生长及survivin表达的影响

目的观察缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因沉默对肺癌的抑瘤效应和survivin表达的影响。方法将实验用肺腺癌A549细胞分为空白对照组、无意义序列转染组和实验组,接种裸鼠,建立裸鼠荷瘤模型,观测HIF-1α-MiRNA对裸鼠皮下移植瘤的生长抑制作用和对survivin表达的影响。采用免疫组化SP法,检测HIF-1α和survivin蛋白在裸鼠移植瘤中的表达。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测HIF-1α和survivin mRNA的表达。采用原位末端标记（TUNEL）法检测肿瘤组织中细胞凋亡。结果实验组裸鼠肿瘤的生长速度较空白对照组、无意义序列转染组明显减慢（P〈0.05）。接种60 d后处死裸鼠,实验组裸鼠的肿瘤重量为（0.59±0.28）g,明显轻于空白对照组[（1.90±0.18）g]和无意义序列转染组[（1.66±0.24）g,P〈0.01]。实验组肿瘤组织中HIF-1αmRNA和蛋白的相对表达量分别为（0.45±0.04）%和（24.56±5.83）%,survivin mRNA和蛋白的相对表达量分别为（0.32±0.02）%和（29.08±3.99）%,均明显低于空白对照组、无意义序列转染组（P均〈0.05）。但实验组肿瘤组织中凋亡细胞的数量显著高于对照组。结论以HIF-1α为靶点的基因治疗,可能通过下调靶基因survivin的表达促进肺癌细胞凋亡,发挥抑制肿瘤生长的作用。     

干扰素α调控维甲酸诱导基因G表达分子机制的新发现

目的 探讨干扰素α(IFN-α)调控维甲酸诱导基因G(RIG-G)表达调控的分子机制.方法 采用Western blot方法检测急性早幼粒白血病细胞系NB4经IFN-α处理后信号传导和转录活化因子1(STAT1)、p-STAT1和RIG-G蛋白的表达变化.采用细胞转染、报告基因实验、免疫共沉淀实验和染色质免疫沉淀实验等技术,研究STAT1缺失的U3A细胞中,STAT1、STAT2和IFN调节因子9(IRF-9)在IFN-α调控RIG-G基因表达中的作用及其机制.结果 在 U3A 细胞中,只有当STAT2和IRF-9共同转染时,RIG-G启动子荧光素酶报告基因的表达活性才明显升高,约为空载对照组的8倍.在无IFN-α作用时,野生型或突变型STAT2与IRF-9共同转染U3A细胞可产生相似的效应;但IFN-α能进一步增强野生型STAT2与IRF-9的转录激活作用,约为未加IFN-α时的6倍,而对突变型STAT2无效.STAT2能与IRF-9相互作用,并能与RIG-G基因的启动子结合.结论 STAT2和IRF-9能以不依赖于STAT1的形式发生相互作用,所形成的复合物是介导IFN-α调控RIG-G基因表达的关键性转录因子,这是一种有别于经典JAK-STAT途径的新的干扰素信号转导方式.