构建中国汉族人亚健康状态肾阴虚证的DNA消减文库

目的:采用抑制性消减杂交技术构建汉族人亚健康状态肾阴虚证DNA消减文库。方法:实验于2004-02在南方医科大学南方医院糖尿病分子实验室完成。样本来源于南方医科大学南方医院汉族亚健康且中医辨证为肾阴虚证的患者1例及健康自愿者1名作为其对照组。用硅胶法抽提血白细胞DNA,用RsaI酶切基因组DNA成大小不等的片段,分别与两种不同的接头连接,进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应,将聚合酶链反应产物与U载体连接,经蓝白斑筛选后,再用聚合酶链反应方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建亚健康肾阴虚证DNA消减文库。结果:用抑制性消减杂交方法筛选出了亚健康肾阴虚证的差异DNA片段,得到680个白色克隆,随机调取96个白色克隆,再经聚合酶链反应方法快速筛选出阳性重组质粒91个,从而成功地构建了亚健康肾阴虚证的DNA消减文库。结论:抑制性消减杂交技术能够快速有效地分离差异DNA片段以构建亚健康肾阴虚证DNA消减文库,为进一步筛选和克隆亚健康肾阴虚证相关基因奠定了基础。     

运用抑制性消减杂交技术构建2型糖尿病肾阴虚证的相关基因文库

目的：运用抑制性消减杂交技术构建2型糖尿病肾阴虚证DNA消减文库，为制定2型糖尿病的一、二级康复预防提供理论参考。方法：选择2004—08南方医科大学南方医院内分泌科就诊的汉族2型糖尿病患者1例．符合中医肾虚证诊断标准中关于典型肾阴虚证的诊断，肝肾功能正常，无急慢性感染。以同时期、同性别、年龄相当的自愿者1名作为正常人对照。参照Maxim方法采用硅胶法抽提2例观察对象血白细胞DNA，用RsaⅠ酶切基因组DNA成大小不等的片段，分别与两种不同的接头连接，进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应，将聚合酶链反应产物与U／A载体连接，经蓝白斑筛选及菌液聚合酶链反应筛选出阳性重组质粒，构建糖尿病肾阴虚证DNA消减文库。测定抽提基因组DNA的纯度及含量；基因组DNARsaⅠ酶切产物；消减杂交产物扩增结果；蓝白斑筛选阳性克隆；聚合酶链反应方法筛选重组质粒。结果：用抑制性消减杂交技术筛选出了糖尿病肾阴虚证的差异DNA片段．基因组DNA经过RasⅠ酶切消化后．所得DNA片段主要集中在200～2000bp；消减杂交产物经两次聚合酶链反应扩增后，产物明显增多，内含数条隐约可见的条带．主要集中在0．2～1．5kb；蓝白斑q互补筛选出含有外源插入片段的阳性克隆，结果正向消减杂交产物得到286个克隆．反向消减杂交产物得到262个克隆；随机挑取92个阳性克隆，经聚合酶链反应分析证实86个克隆的质粒内均载有差异性DNA片段，大小为200～1000bp，从而成功构建了糖尿病肾阴虚证特异的DNA消减文库。结论：抑制性消减杂交技术能够快速有效地分离差异DNA片段以构建糖尿病肾阴虚证DNA消减文库，为进一步筛选和克隆糖尿病肾阴虚证相关基因奠定了基础。     

运用抑制性消减杂交技术构建2型糖尿病肾阴虚证的相关基因文库

目的:运用抑制性消减杂交技术构建2型糖尿病肾阴虚证DNA消减文库,为制定2型糖尿病的一、二级康复预防提供理论参考。方法:选择2004-08南方医科大学南方医院内分泌科就诊的汉族2型糖尿病患者1例,符合中医肾虚证诊断标准中关于典型肾阴虚证的诊断,肝肾功能正常,无急慢性感染。以同时期、同性别、年龄相当的自愿者1名作为正常人对照。参照Maxim方法采用硅胶法抽提2例观察对象血白细胞DNA,用RsaI酶切基因组DNA成大小不等的片段,分别与两种不同的接头连接,进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应,将聚合酶链反应产物与U/A载体连接,经蓝白斑筛选及菌液聚合酶链反应筛选出阳性重组质粒,构建糖尿病肾阴虚证DNA消减文库。测定抽提基因组DNA的纯度及含量;基因组DNARsaI酶切产物;消减杂交产物扩增结果;蓝白斑筛选阳性克隆;聚合酶链反应方法筛选重组质粒。结果:用抑制性消减杂交技术筛选出了糖尿病肾阴虚证的差异DNA片段,基因组DNA经过RasI酶切消化后,所得DNA片段主要集中在200～2000bp;消减杂交产物经两次聚合酶链反应扩增后,产物明显增多,内含数条隐约可见的条带,主要集中在0.2～1.5kb;蓝白斑α互补筛选出含有外源插入片段的阳性克隆,结果正向消减杂交产物得到286个克隆,反向消减杂交产物得到262个克隆;随机挑取92个阳性克隆,经聚合酶链反应分析证实86个克隆的质粒内均载有差异性DNA片段,大小为200～1000bp,从而成功构建了糖尿病肾阴虚证特异的DNA消减文库。结论:抑制性消减杂交技术能够快速有效地分离差异DNA片段以构建糖尿病肾阴虚证DNA消减文库,为进一步筛选和克隆糖尿病肾阴虚证相关基因奠定了基础。     

狼疮性肾炎肾阳虚证cDNA消减文库的构建

目的：采用抑制性消减杂交技术构建汉族人狼疮性肾炎肾阳虚证cDNA消减文库。方法：选择2005—08／10南方医科大学南方医院中医科收治的狼疮性肾炎肾阳虚证患者5例，另选择与上述年龄相匹配的健康正常人5名作为正常对照组。狼疮性肾炎肾阳虚证患者组和正常对照组进行正向和反向消减杂交。采用Trizol一步法提取总RNA，用SMART（Switch Mechanism At 5 end of RNA Template）技术逆转录并扩增总cDNA，用RsaI酶切基因组cDNA成大小不等的片断，分别与两种不同的接头连接，进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应，将聚合酶链反应产物与U载体连接，经蓝白斑筛选后，再用聚合酶链反应方法插入片段筛选出阳性重组质粒，构建狼疮性肾炎肾阳虚证消减文库。结果：TRIzol一步法抽提的总RNA纯度高（A260nm/A280nm。〉1．90），用SMART技术扩增微量RNA，扩增产物双链cDNA主要分布在0．5～10kb，基因组cDNA经RsaI内切酶酶切后片段主要集中在200～2000bp。用抑制性消减杂交方法筛选出了狼疮性肾炎肾阳虚证的差异cDNA片段，得到了480个白色克隆，再经聚合酶链反应方法快速筛选出阳性重组质粒，从而成功地构建了狼疮性肾炎肾阳虚证的cDNA消减文库。结论：抑制性消减杂交技术能够快速有效地分离差异cDNA片段以构建狼疮性肾炎肾阳虚证cDNA消减文库，为进一步筛选和克隆狼疮性肾炎肾阳虚证相关基因奠定了基础。     

狼疮性肾炎肾阳虚证cDNA消减文库的构建

目的:采用抑制性消减杂交技术构建汉族人狼疮性肾炎肾阳虚证cDNA消减文库。方法:选择2005-08/10南方医科大学南方医院中医科收治的狼疮性肾炎肾阳虚证患者5例,另选择与上述年龄相匹配的健康正常人5名作为正常对照组。狼疮性肾炎肾阳虚证患者组和正常对照组进行正向和反向消减杂交。采用Trizol一步法提取总RNA,用SMART(Switch Mechanism At 5 end of RNATemplate)技术逆转录并扩增总cDNA,用RsaI酶切基因组cDNA成大小不等的片断,分别与两种不同的接头连接,进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应,将聚合酶链反应产物与U载体连接,经蓝白斑筛选后,再用聚合酶链反应方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建狼疮性肾炎肾阳虚证消减文库。结果:TRIzol一步法抽提的总RNA纯度高(A260/A280nmnm>1.90),用SMART技术扩增微量RNA,扩增产物双链cDNA主要分布在0.5～10kb,基因组cDNA经RsaI内切酶酶切后片段主要集中在200～2000bp。用抑制性消减杂交方法筛选出了狼疮性肾炎肾阳虚证的差异cDNA片段,得到了480个白色克隆,再经聚合酶链反应方法快速筛选出阳性重组质粒,从而成功地构建了狼疮性肾炎肾阳虚证的cDNA消减文库。结论:抑制性消减杂交技术能够快速有效地分离差异cDNA片段以构建狼疮性肾炎肾阳虚证cDNA消减文库,为进一步筛选和克隆狼疮性肾炎肾阳虚证相关基因奠定了基础。     

应用抑制消减杂交技术构建哮喘病人嗜酸细胞差异表达基因消减cDNA文库

目的：构建哮喘病人治疗前后嗜酸细胞差异表达基因的消减cDNA文库。方法：采用新近建立的抑制消减杂交方法，哮喘治疗前后的嗜酸细胞为试验和对比材料，分离哮喘病人嗜酸细胞中差异表达基因的cDNA片段，将其与T载体进行T／A连接构建文库，将连接产物用氯化钙转化法转化大肠杆菌进行文库扩增和蓝白斑筛选。随机挑取100个白色克隆用茵落PCR进行鉴定。结果：扩增消减cDNA文库获得300余个白色阳性克隆，随机挑取100个白色克隆用PCR进行扩增，90％的克隆中均有200～600bp的插入片段，这些片段可能是哮喘嗜酸细胞差异表达基因的cDNA片段。结论：用SSH法及T／A克隆技术成功构建了哮喘病人治疗前后嗜酸细胞差异表达基因消减cDNA文库，该消减cDNA文库的建立为进一步筛选、克隆哮喘病人嗜酸细胞差异表达的新基因奠定了基础。     

瘢痕疙瘩抑制消减cDNA文库构建和质量分析对筛选和克隆瘢痕疙瘩相关基因的意义

目的:构建瘢痕疙瘩抑制消减cDNA文库,为进一步筛选、克隆瘢痕疙瘩特异表达的基因奠定基础。方法:实验于2003-09/2004-08在南方医科大学基因工程研究所完成。从同一标本的瘢痕疙瘩和正常皮肤组织分离poly(A)+RNA,经反转录后,利用抑制消减杂交方法,通过两轮杂交和两次抑制聚合酶链反应构建了两种组织间差异表达基因的cDNA消减文库。结果:挑取了84个克隆进行聚合酶链反应扩增检测是否有插入片段,结果显示71个克隆有插入片段,其中45个克隆片段大小范围为200～750bp,符合预期的文库构建要求。结论:应用消减杂交的方法,在去除相同遗传背景的条件下,可以建立较特异的瘢痕疙瘩cDNA消减文库,该文库为进一步批量筛选瘢痕疙瘩发生相关基因群和克隆瘢痕疙瘩特异表达基因奠定了基础,为创伤临床康复治疗提供理论依据。     

多重耐药肺炎链球菌差异DNA消减文库的构建及初步筛选

目的比较肺炎链球菌多重耐药株与敏感株标准参考菌之间的差异基因。方法使用抑制性消减杂交技术构建多重耐药肺炎链球菌差异DNA消减文库,经斑点杂交筛选阳性克隆后对部分DNA片段进行测序和同源分析。结果成功的构建了肺炎链球菌多重耐药株差异DNA消减文库,经斑点杂交的初步筛选,有17个仅能与多重耐药株DNA探针杂交,而不能与敏感株DNA探针杂交。对这17个克隆片段测序及基因库检索分析,发现2个未知新序列。结论从全基因角度研究肺炎链球菌多耐药菌株与标准菌株基因组DNA分子遗传差异,为发现、克隆肺炎链球菌多重耐药相关基因提供依据。     

结核分枝杆菌Ag85B基因克隆及表达质粒构建

目的 克隆并构建编码结棱分枝杆菌Ag85B分泌蛋白的重组表达质粒。方法 采用聚合酶链反应(PCR)方法从结棱分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出Ag85B基因(978bp)，并克隆到T栽体，然后用双内切酶消化后，与同样酶消化的pGEX-4T-2连接，转入大肠杆菌E．coli DH5α，阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。结果 酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符，测序结果与文献报道一致，证实符合表达框架。结论成功地克隆并构建了Ag85B基因的重组表达质粒pGEX-Ag85BV。     

结核分枝杆菌MPT64基因克隆与表达质粒构建

[目的] 克隆并构建编码结核分枝杆菌MPT64分泌蛋白的重组表达质粒。[方法] 采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出MPT64基因(687bp)，并克隆到T载体，然后用双内切酶消化后，与同样酶消化的pGEX-4T-2连接，转化大肠杆菌E．coil DH5α，阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。[结果] 酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符，测序结果与文献报道一致，证实符合表达框架。[结论] 成功地克隆并构建了MPT64基因的重组表达质粒pGEX-MPT64。     

结核分枝杆菌Ag85B基因克隆及表达质粒构建

目的　克隆并构建编码结核分枝杆菌Ag85B分泌蛋白的重组表达质粒。方法　采用聚合酶链反应 (PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出Ag85B基因 (978bp) ,并克隆到T载体 ,然后用双内切酶消化后 ,与同样酶消化的pGEX 4T 2连接 ,转入大肠杆菌E .coliDH5α,阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。结果　酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符 ,测序结果与文献报道一致 ,证实符合表达框架。结论　成功地克隆并构建了Ag85B基因的重组表达质粒 pGEX Ag85BV。     

人直肠腺癌消减杂交差异片段的生物信息学分析

目的探测人直肠腺癌发生和发展过程中差异表达的基因片段,了解人直肠腺癌的分子生物学机制。方法应用抑制性消减杂交技术,获得人直肠腺癌差异表达的基因,用生物信息学cDNA文库筛选的方法,对人直肠腺癌cDNA消减文库中的差异基因片段的序列作预测和分析。结果用抑制性消减杂交技术随机挑取获得的阳性克隆,提取质粒,双酶切分析,进行序列测定,得到与直肠腺癌发病相关的差异基因片段-9cDNA(Genbank登录号为BM360862),用cDNA文库筛选得到一个全长cDNA序列。基因表达系列分析(SAGE)显示除了直肠腺癌外、9cDNA还分布于前列腺腺癌、脑干成神经管细胞瘤、胰腺腺癌、胚胎正常血管内皮细胞、脑室管细胞瘤。结论直肠腺癌的发病是多环节和多步骤的过程,9cDNA与直肠腺癌发病相关,对9cDNA基因差异片段进一步研究,将为了解直肠腺癌发病的特异相关基因奠定基础。     

胎兔皮肤创伤消减文库构建与瘢痕愈合基因的初步筛选

目的：许多哺乳动物的胎儿在妊娠期前2/3内皮肤创伤为无瘢痕愈合，其发生机制至今尚不完全清楚。应用抑制性消减杂交获得差异表达的片段并构建消减文库，为差异基因的筛选及可能出现的未知基因的功能研究提供前期铺垫。方法：选择孕20d的胎兔及孕兔分别在腰部做全层皮肤切口，12h后取材作为胎兔创伤（fetal trauma，FT）、胎兔对照（fetal control，FC）和成兔创伤（adult trauma，AT）。提取总RNA，合成dscDNA，经Rsa I酶切、Adaptor连接，两次杂交及两次抑制性PCR可获得差异性表达的片段。将扩增产物插入T载体并转染工程菌，培养后挑选阳性克隆。结果：经逐步验证获得61个较为可靠的阳性克隆。结论：设计并应用改良的SSH(2Drivers）替代传统的SSH，经实验证实在理论及实际操作上均可行且合理。消减文库的构建对无瘢痕愈合相关基因及其功能的后续研究提供了可靠的材料。     

儿童急性淋巴细胞白血病差异表达基因文库的构建和筛选

目的克隆和分离儿童急性淋巴细胞白血病（ ALL）差异表达基因，探讨小儿白血病的发病机制。方法 Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞，抽取mRNA，逆转录成cDNA；经RsaⅠ酶切，实验组cD-NA被分成两组，分别与两种不同的接头连接后，与对照组cDNA进行两次消减杂交和两次抑制性聚合酶链反应（ PCR），提取、纯化PCR产物，与PT-Adv载体连接构建cDNA消减文库，利用PCR扩增、测序和同源性分析差异表达的序列。结果选取文库中60个克隆进行菌落PCR分析，可以检出大小为200～600 bp的插入片段。从中随机挑选20个克隆进行测序、生物信息学分析，其中18个克隆与已知基因有高度序列同源性，符合率为98％～100％，共编码17种基因。这些基因大多涉及基因表达调控、DNA损伤修复、细胞周期、物质代谢等，均与细胞增殖、分化有关。此外发现2个新基因。结论本实验表明我们已成功构建小儿ALL相关消减cDNA文库，为小儿ALL发病机制的研究奠定了基础。     

人骨形成蛋白2真核表达载体的构建和体外表达

背景：骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein2，BMP-2）是已知的所有生长因子中对骨的形成作用最强的生长因子，被认为是最具有前途的骨诱导物质。目的：构建人骨形成蛋白2真核表达载体并观察其体外表达情况。设计、时间及地点：自身对照实验，于2005-07／2006-05在华中科技大学同济医学院分子生物中心实验室完成。材料：pcDNA3．1（＋）载体由华中科技大学同济医学院左石博士惠赠；成骨肉瘤组织由华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科提供。方法：从人成骨肉瘤细胞中提取细胞总RNA，利用反转录．聚合酶链反应方法扩增获得人BMP-2基因cDNA，将基因片断重组到pGEM-T质粒中构建pGEM．T-hBMP-2重组质粒载体，转化到大肠杆菌DH5n后筛选阳性克隆，利用限制性酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒。分别用RcoRI和NotI双酶切pGEM-T-hBMP-2质粒和pcDNA3．1真核表达载体，将克隆载体中人骨形成蛋白2基因重组到pcDNA3．1真核表达载体，提取质粒作酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序后，用脂质体体外转染小鼠骨髓基质细胞，反转录-聚合酶链反应检测BMP．2的表达。主要观察指标：①人骨肉瘤细胞总RNA反转录-聚合酶链反应结果。②重组质粒pGEM．T-hBMP-2和pcDNA3．1-hBMP-2的构建和酶切鉴定。③BMP-2在小鼠骨髓基质细胞内的表达。结果：人骨肉瘤细胞总RNA经反转录-聚合酶链反应扩增后，获得1．2kb条带。经酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序证实实验成功克隆BMP-2基因，重组质粒pcDNA3．1-hBMP-2构建正确；该重组质粒能在体外培养的小鼠骨髓基质细胞中有效表达BMP-2。 结论：实验成功克隆人骨形成蛋白2基因并构建了此基因的真核表达载体。     

骨形成蛋白2重组腺病毒的构建对骨缺损基因治疗的价值

背景：目前，人们利用基因重组技术已经表达出人类基因重组骨形态发生蛋白2，并且在常位和异位成功地诱导出新骨。但由于重组人骨形态发生蛋白2比天然骨形态发生蛋白2的诱导成骨活性较低，且尚未找到十分理想的载体。目的：通过构建骨形成蛋白重组腺病毒，为骨缺损的基因治疗提供可行载体。设计：单一样本实验。单位：西安交通大学第一医院分子生物学实验中心。材料：PACCMV-PLPA质粒，PJM17质粒，293细胞系。方法：实验于2001-09／02-06在西安交通大学第一医院分子生物学实验中心完成。应用反转录-聚合酶链反应法克隆出骨形态发生蛋白质类2全长基因，构建重组腺病毒载体，DNA-磷酸钙共沉法将辅助质粒PJM17转染293细胞，同源重组构建出重组腺病毒。测滴度并用氯化铯梯度离心纯化备用。主要观察指标：①聚合酶链反应产物克隆结果。②PACCMV-BMP2穿梭质粒的鉴定结果。③重组腺病毒的构建结果。结果：①聚合酶链反应产物克隆结果：克隆构建的重组质粒命名为pGEM-T／hBMP2，大小为（3015＋1213）bp。琼脂凝胶电泳结果显示实际值与理论值完全一致。②PACCMV-BMP2穿梭质粒的鉴定结果：质粒大小约为10Kbp，因PACCMV-PLPA质粒多克隆位点属PUC质粒系列，故用EcoRⅠ酶切，可将重组质粒线性化，大小为10Kbp。而EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切时，可得到8．8Kbp和1．2Kbp两个可见片段。③重组腺病毒的构建结果：重组病毒的鉴定应用聚合酶链反应技术，利用BMP2全长特异引物扩增出目的片段1．2Kbp，与理论值完全一致。结论：骨形态发生蛋白2重组腺病毒的构建成功为骨缺损等疾病的基因治疗奠定了可行的载体基础。     

化脓性链球菌高毒力株特异基因文库的构建和分析

目的构建化脓性链球菌毒力基因文库,克隆和筛选化脓性链球菌高毒力株特异表达基因。方法采用抑制消减杂交方法,以从患者体内分离的链球菌作为毒力菌株,分离毒力基因,将其与PMD18-T载体进行T/A连接构建文库,将连接产物转化感受态大肠杆菌TOP10进行文库扩增后,将转化菌液涂布于LB固体平板,构建化脓性链球菌毒力株特异基因消减文库,用斑点杂交初步筛选后,将获得的阳性克隆进行测序和同源性分析。结果酶切产物为100~2 000 bp,连接效率大于50%,成功构建了化脓性链球菌毒力基因消减文库,所得阳性克隆经斑点杂交筛选后测序,与Genebank数据库进行同源性比对,5个未知序列可能为新基因,7个与已知基因有高度的同源性。结论用抑制消减杂交技术及T/A克隆技术成功构建了化脓性链球菌毒力基因文库;5个未知的新序列可能与化脓性链球菌的高毒力有关。     

自身引物菌落聚合酶链反应筛选LoxP序列重组阳性克隆

目的 研究LoxP序列小片段重组阳性克隆的筛选和鉴定方法。方法 采用合成的LoxP为上游引物，载体互补的序列为下游引物，直接以菌落为模板进行聚合酶链反应(PCR)，电泳分离出784bp的条带者为阳性；PCR阳性克隆再用酶切法进行对比鉴定及DNA测序分析确证。结果 用菌落PCR法随机筛选的6个菌落中3个为阳性，随机取1个阳性克隆进行DNA序列分析，证实含有LoxP插入序列。用酶切法对此3个阳性克隆进行鉴定，3个克隆和未进行酶切的对照均出现100bp以下模糊带，结果不能判断。结论 自身引物菌落PCR法用于筛选和鉴定LoxP序列重组阳性克隆是一种快速、简便、经济、高效的方法。     

瘢痕疙瘩抑制消减cDNA文库构建和质量分析对筛选和克隆瘢痕疙瘩相关基因的意义

目的:构建瘢痕疙瘩抑制消减cDNA库,为进一步筛选、克隆瘢痕疙瘩特异表达的基因奠定基础.方法:实验于2003-09/2004-08在南方医科大学基因工程研究所完成.从同一标本的瘢痕疙瘩和正常皮肤组织分离poly(A) RNA,经反转录后,利用抑制消减杂交方法,通过两轮杂交和两次抑制聚合酶链反应构建了两种组织间差异表达基因的cDNA消减库.结果:挑取了84个克隆进行聚合酶链反应扩增检测是否有插入片段,结果显示71个克隆有插入片段,其中45个克隆片段大小范围为200～750 bp,符合预期的库构建要求.结论:应用消减杂交的方法,在去除相同遗传背景的条件下,可以建立较特异的瘢痕疙瘩cDNA消减库,该库为进一步批量筛选瘢痕疙瘩发生相关基因群和克隆瘢痕疙瘩特异表达基因奠定了基础,为创伤临床康复治疗提供理论依据.     

血管内皮生长因子165真核基因转染载体转染的骨骼肌细胞

背景：血管内皮生长因子基因转染治疗组织损伤的研究倍受关注,构建稳定可靠的人血管内皮生长因子真核表达载体有重要意义。目的：克隆人血管内皮生长因子基因血管内皮生长因子165片段,构建pcDNA4-HisMax-C/VEGF165真核表达质粒,并验证其转染大鼠骨骼肌细胞的可靠性。方法：采用反转录-聚合酶链反应技术,从人卵巢癌患者外周血中提取并扩增出血管内皮生长因子165基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA4-HisMax-C真核表达载体上,构建成pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒,聚合酶链反应扩增,分别用酶切电泳分析和DNA测序的方法对提取和重组DNA进行鉴定。pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒转染骨骼肌细胞1周后反转录-聚合酶链反应提取血管内皮生长因子基因并酶切电泳鉴定。结果与结论：构建的重组质粒目的基因片段为人血管内皮生长因子165cDNA,对大鼠骨骼肌细胞转染后检测到血管内皮生长因子165基因片段。提示成功地克隆了血管内皮生长因子165基因并构建了其真核表达质粒,能以此为载体转染至骨骼肌细胞,并已整合到骨骼肌的基因组参与转录,证明了其转染的有效性。