苦参查尔酮异构酶的基因克隆与表达分析*

目的为明晰苦参查尔酮异构酶（sfCHI）的结构基因信息及其在苦参黄酮类化合物生源路径中的表达调控机理。方法 本实验以苦参为研究对象,基于其转录组学数据,克隆sfCHI基因并针对该cDNA序列展开生物信息学分析,采用半定量PCR方法检测安徽产苦参不同组织中sfCHI基因表达情况。结果 结果显示苦参sfCHI基因的cDNA序列长度为1 265 bp,含有630 bp的开放式阅读框(ORF),编码209个氨基酸;序列分析表明sfCHI与狭叶羽扇豆查尔酮异构酶基因相似性最高,达89.95%;进化树分析该基因与大豆、野大豆等植物的亲缘关系较近;半定量PCR结果显示sfCHI基因在苦参根中表达量最低,在叶、叶柄与茎中的表达未见明显差异。结论 本研究通过对苦参查尔酮异构酶的基因克隆与不同组织间的表达分析,初步明确了该基因的序列信息与理化特征,这对进一步研究苦参黄酮类物质生物合成机制将起到积极的推动作用。     

4，2’-二羟基查尔酮及其类似物的合成

目的：合成4,2＇-二羟基查尔酮及其类似物。方法：以羟取代苯甲醛和邻羟基苯乙酮为原料、哌啶为催化剂,通过羟醛缩合反应合成4,2＇-二羟基查尔酮及其5个类似物。结果：成功合成出4,2＇-二羟基查尔酮及其5个类似物,并经MS、^1H-NMR、IR分析确证。结论：以哌啶为催化剂,经羟醛缩合制备查尔酮类化合物具有一定的优越性,值得进一步深入研究。     

2’-羟基查尔酮的合成工艺研究

正查尔酮作为黄酮类化合物家族的一员,具有广泛的生物活性,如抗菌、抗氧化、降血脂、抗炎等作用[1-2]。尤其2’-羟基查尔酮是合成黄酮、黄酮醇以及二氢查尔酮衍生物等的重要中间体,也可用于香料和药物等精细化学品的合成。     

CDH22基因克隆及其真核表达载体的构建与表达

目的克隆人CDH22基因并构建其真核表达载体。方法设计CDH22特异性引物,提取人大肠癌细胞系SW480总RNA,用RT-PCR方法获取人CDH22cDNA,经T-A克隆,通过双酶切及测序鉴定,将CDH22克隆至pCDNA3/HA,构建人CDH22基因的真核表达载体pCDNA3/HA-CDH22,转染HEK293A细胞,用WesternBlot及免疫荧光细胞化学技术检测目的蛋白的表达。结果成功扩增出人CDH22全长cDNA,双酶切鉴定证实成功构建pCDNA3/HA-CDH22真核表达载体,测序结果表明CDH22全长cDNA与GeneBank中CDH22序列完全一致,转染HEK293A细胞后,可检测出Mr约为86KD的目的蛋白,而免疫荧光细胞化学技术也检测到蛋白表达。结论获得人CDH22基因全长cDNA并成功构建了CDH22真核表达载体,证实pCDNA3/HA-CDH22转染HEK293A细胞后可表达HA-CDH22蛋白,为深入研究CDH22基因在肿瘤发生发展中的作用奠定了基础。     

HPLC测定益胃素中甘草查尔酮的含量

益胃素是一种抗胃溃疡新药,其中所含黄酮类化合物主要有甘草查尔酮、甘草甙、甘草素等,尤以甘草查尔酮的含量最高。本文建立了高效液相色谱法(HPLC)测定益胃素中甘草查尔酮含量的方法。BondapakC_(18)柱,乙腈:0.03M磷酸二氢钾(50:50)为流动相。本法的回收率为97～102％,变异系数小于4％(n=5)。     

含查尔酮结构香豆素衍生物的合成及抗肿瘤增殖活性

基于活性亚单元拼接原理,将查尔酮分子片段拼接到香豆素结构中,设计并合成了一系列新型含查尔酮结构的香豆素衍生物;以苯乙酮和对甲基苯甲醛为原料,经克莱森-施密特缩合、溴代、环合、消除等反应制备得到24个目标化合物;化合物结构经¹H NMR、ESI-MS确证。采用MTT法评价了化合物对HepG2、DU145及A549肿瘤细胞的抗增殖作用。结果表明,部分化合物对肿瘤细胞具有较好抗增殖作用,其中Ⅰc,Ⅱb,Ⅱc和Ⅱd对HepG2和A549的抗增殖作用较强,IC₅₀分别为2.05~9.16 mol/L和3.48~10.81 mol/L,在此基础上初步探讨了此类化合物的构效关系。     

聚维酮和阿霉素灌注后膀胱癌的P170、DNA TOPO Ⅱ异构酶的表达

目的 :探讨聚维酮 (PVP)和阿霉素 (ADM)对膀胱癌细胞的抗耐药机制。方法 :选择T0 T1期膀胱癌 38例 ,其中 2 5例术前灌注PVP和ADM(PVP组 ) ,另 13例灌注生理盐水 (NS)和ADM(NS组 )。对所有的手术标本进行P170和DNATOPOⅡ异构酶的免疫组化染色。结果 :38例术前P170表达率为 16 .4 % ,PVP组表达率为 2 9.5 % ,NS组为 6 2 .8% ,PVP组的表达率与术前组比较差异无显著性 ,但明显低于NS组 ,差异具有显著性 (P <0 .0 1)。术前组、PVP组和NS组的DNATOPO异构酶的表达率分别为 4 .2 %、6 .8%和 8.3% ,三组间差异无显著性。结论 :P170的表达增高可能是肿瘤对ADM类药物产生耐药的原因之一。PVP可提高肿瘤对阿霉素的抗耐药性     

查尔酮化合物Butein-0908对5种水产动物病原菌的抑菌作用

目的 研究查尔酮化合物Butein-0908对5种水产动物病原菌的抑菌活性.方法 采用纸片扩散法和二倍稀释法,测定化合物Butein-0908对副溶血弧菌、嗜水气单胞菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌和温和气单胞菌的最低抑菌质量浓度和最低杀菌浓度.并检测化合物Butein-0908对病原菌菌体生长曲线的影响.结果 试验结果 表明,化合物Butein-0908对副溶血弧菌、鳗弧菌和嗜水气单胞菌有较强的抑菌效果,最低抑菌质量浓度均为8.87、13.43、16.48 mg/L,最低杀菌质量浓度分别为18.48、27.69、34.15 mg/L;对温和气单胞菌和哈维氏弧菌的抑菌效果弱于副溶血弧菌、嗜水气单胞菌和鳗弧菌.其中对副溶血弧菌的抑制效果最佳.使致病菌的迟缓期延长2~7 h,提示Butein-0908可能通过影响致病菌生长繁殖来达到抑菌的效果.结论 Butein-0908可通过影响致病菌生长繁殖来达到抑菌的效果     

明日叶查尔酮对荷瘤小鼠抗氧化能力影响作用的研究

目的研究明日叶查尔酮（AC）对荷H22肝癌小鼠细胞抗氧化能力的影响。方法将50只荷H22肝癌小鼠随机分为肿瘤对照组、环磷酰胺组、明日叶查尔酮高、中、低剂量组共五组,每组10只。AC低、中、高剂量组每日分别灌胃给予8、16、32 mg.kg-1明日叶查尔酮,肿瘤对照组给予生理盐水,环磷酰胺（CTX）组隔日腹腔注射20 mg.kg-1的CTX。第11天处死小鼠,取瘤组织检测各组小鼠血清脂质过氧化物（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶水平（GSH-Px）、总抗氧化能力（T-AOC）等指标,用MTT法检测各组小鼠肿瘤细胞增殖活性。结果 AC各剂量组尤其是中、高剂量组能够显著提高小鼠细胞的抗氧化能力,与肿瘤对照组比较,差异均有统计学意义（P〈0.01）;肿瘤对照组肝癌细胞增殖活性为（1.135±0.032）U.mL-1,AC高剂量组为（0.716±0.018）U.mL-1,两者比较,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论明日叶查尔酮能增强荷H22肝癌小鼠细胞的抗氧化能力,抑制肿瘤细胞增殖活性。     

正交试验优选金荞麦的提取工艺研究

目的 优选金荞麦中有效成分表儿茶素的提取工艺。方法 采用HPLC法测定表儿茶素,以干膏得率和表儿茶素提取率为考察指标,采用正交试验设计优选最佳提取工艺。结果 优选工艺为药材加10倍量45%乙醇,回流提取3次,每次1.5 h。结论 优选所得的工艺稳定可行,可作为金荞麦的提取工艺。     

陕产黄花油点草总黄酮部位纯化工艺研究

目的 优选大孔吸附树脂纯化陕产黄花油点草总黄酮部位的最佳工艺。方法 以紫外分光光度法测定总黄酮的量。采用每克树脂纯化转移总黄酮的量为指标,通过考察动态吸附-解吸附、静态吸附-解吸附过程,对AB-8、D-101、HPD-450、HPD-600、HPD-700大孔树脂进行了优选;再进一步考察提取药液质量浓度、洗脱剂用量、径高比、药液的pH值对树脂纯化工艺的影响,确定最佳工艺条件,并对优选工艺条件进行了验证试验。结果 药液质量浓度为1.2 g/mL,径高比为1∶5,药液pH 6.47,生药材-树脂为1∶3,上样体积流量为1 BV/h,洗脱液为40%乙醇,洗脱体积流量为1 BV/h,洗脱体积为2 BV。结论 该工艺科学合理,可有效实现总黄酮部位的富集。     

显齿蛇葡萄查耳酮合成酶基因cDNA克隆及蛋白质序列分析

目的 对显齿蛇葡萄Ampelopsis grossedentata查耳酮合成酶（CHS）基因进行克隆及序列分析。方法 根据已经克隆的植物基因的保守序列设计一对引物,以显齿蛇葡萄总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增CHS基因序列并连接到pMD18-T Simple载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序。结果 得到一段1 173 bp的序列,序列分析表明,该片段编码390个氨基酸,与其他高等植物CHS基因氨基酸序列同源性在67.9%以上。结论 首次从显齿蛇葡萄中克隆了CHS基因,为有效利用该基因奠定了基础。     

骨碎补黄酮类化合物的研究进展与开发前景

骨碎补黄酮类化合物是骨碎补中含有的一类生物活性较强的成分,具有促进骨折愈合、防治骨质疏松、抗氧化、抗炎、调血脂、抗过敏、抗病毒等多种药理活性,有很高的利用价值。综述了骨碎补中黄酮类化合物的化学成分、药理作用及应用现状等方面的研究进展,为骨碎补黄酮类成分的进一步开发利用提供参考。     

制备液相色谱分离制备玉郎伞查尔酮类化合物

目的 对壮药玉郎伞查尔酮类化合物进行分离制备和结构鉴定。方法 利用制备液相色谱分离、制备查尔酮类化合物,经HPLC测定其质量分数、用UV,IR,MS,1D、2D-NMR,X射线单晶衍射等对其进行结构鉴定。结果 从玉郎伞中首次分离制备出两种查尔酮类化合物,其结构分别为cis-2, 6-二甲氧基查尔酮和cis-17-甲氧基-7-羟基-苯骈呋喃查尔酮。结论 该方法制备玉郎伞查尔酮类化合物质量分数很高,且简便、快速、可靠。     

毛萼香茶菜中黄酮和二萜化合物的分离制备及其抗病毒活性

从毛萼香茶菜中分离制备2种黄酮和2种二萜化合物,并研究其体外抗病毒活性。首先采用硅胶、ODS、制备型HPLC等多种色谱技术和波谱方法,从毛萼香茶菜乙醇提取物中分离制备了4个化合物,分别鉴定为8-羟基蓟黄素(1)、蓟黄素(2)、假细锥甲素(3)、毛萼晶D(4)。然后对毛萼香茶菜乙醇提取物和4个化合物开展了体外抗流感病毒(H1N1,H3N2)和呼吸道合胞病毒(RSV)活性研究。结果显示,毛萼香茶菜乙醇提取物和4个化合物对流感病毒H1N1均有一定的抑制作用,其中化合物1和2的抑制效果较优,半数有效浓度(EC₅₀)分别为(14.45±4.90)和(24.54±3.82)μmol/L。但化合物1和2对H3N2和RSV的抑制作用则相对较弱。以上结果表明,毛萼香茶菜乙醇提取物及化合物1~4有一定的抗病毒作用,尤其是对甲型流感病毒H1N1具有较好的抑制作用,黄酮类化合物可能是其抗病毒作用的有效物质之一,本研究为毛萼香茶菜的临床应用提供了科学依据。     

人VIGILIN基因分段克隆及表达大鼠肾组织干细胞的分离培养与鉴定

目的 探讨人高密度脂蛋白结合蛋白(HDLBP)-VIGILIN蛋白与其他蛋白质相互作用的机制。 方法 根据 VIGILIN基因全长编码区的结构域,将 VIGILIN基因全长编码区分为N端、KH1-7、KH8-12、KH13-14、C端5段,以pDsred2-N1/ VIGILIN为模板分别扩增5个片段及全长cDNA后克隆至pGEX 5X 3原核表达载体, 测序,然后将鉴定后的重组质粒转化到表达宿主菌E.coli BL21中进行诱导表达GST-VIGILIN融合蛋白,并用SDS-PAGE电泳及Western blot检测蛋白表达结果。结果 成功扩增了人 VIGILIN基因编码区分段片段,并且构建到原核表达载体中,经酶切、测序鉴定证实序列完全正确,重组载体构建成功,并且在pGEX原核表达系统中诱导表达GST-VIGILIN融合蛋白,经SDS-PAGE电泳及Western blot检测初步证实表达成功。 结论 本实验首次根据VIGILIN蛋白不同的结构域成功构建了GST-VIGILIN分段克隆原核表达载体,并且对融合蛋白表达条件进行了优化,成功表达了GST 融合蛋白。     

正交设计优选卷柏中总黄酮的提取工艺研究

目的 优选卷柏中总黄酮的提取工艺。方法 采用紫外分光光度法和高效液相色谱法分别测定总黄酮和阿曼托双黄酮。以提取量为考察指标,用正交设计方法优选最佳提取工艺。结果 以总黄酮提取量为考察指标,其优选工艺为A₁B₂C₂D₂;以阿曼托双黄酮提取量为考察指标,其优选工艺为A_1～3B_1～3C₂D₂ 。综合考察采用A₁B₂C₂D₂为最佳提取工艺,即药材加10倍量的95％乙醇,回流提取2次,每次2h。结论 优选得到的工艺稳定可行,可作为卷柏的提取工艺。     

罗布麻叶总黄酮抗抑郁作用及其机制研究

目的 探讨罗布麻叶总黄酮的抗抑郁作用及与多巴胺能系统相关的可能机制。方法 采用经典的小鼠强迫游泳和悬尾抑郁模型,观察罗布麻叶总黄酮的抗抑郁作用。同时观察多巴胺D₁受体阻滞剂SCH23390、D₂受体阻滞剂舒必利对小鼠强迫游泳和悬尾试验中罗布麻叶总黄酮抗抑郁作用的影响,研究罗布麻叶总黄酮抗抑郁的作用机制。结果 罗布麻叶总黄酮具有明确的抗抑郁作用;SCH23390、舒必利与罗布麻叶总黄酮联合ig给药10 d,能明显延长悬尾小鼠累计不动时间（P＜0.05）。结论 罗布麻叶总黄酮的抗抑郁作用与多巴胺能系统有关。     

滇重楼种子层积后脱落酸和赤霉素相关基因表达水平的研究

目的 研究脱落酸（ABA）和赤霉素（GA）相关的6个基因（NCED、CYP707A、ABI2、PP2C、GA20ox2、GA20ox3）在滇重楼种子休眠解除过程中的表达特点。方法 分别选取20 ℃层积和20 ℃转4 ℃层积处理后处于不同休眠解除阶段的滇重楼种子为材料,应用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法分析不同层积处理后6个基因在胚和胚乳中的表达水平。结果 在滇重楼种子层积过程中CYP707A、NCED、GA20ox2、GA20ox3和ABI2基因在胚和胚乳中表达有差异,而PP2C表达水平无明显变化规律;CYP707A在低温层积后表达水平显著高于高温层积,尤其是在胚中,而NCED、GA20ox2、GA20ox3和ABI2在高温和低温层积后均有较高的表达水平,且在胚中的表达水平高于胚乳中。结论 所筛选出的NCED、CYP707A、ABI2、GA20ox2、GA20ox3基因参与滇重楼种子休眠解除过程,可以作为研究滇重楼种子休眠过程的重要基因。