大鼠胚胎卯巢冷冻保存和异体无血管皮下移植的生长

背景：胚胎卵巢组织免疫原性低，不易引起宿主的免疫排斥反应，是卵巢异体移植的理想供体。但由于获取胎儿卵巢的不随意性和来源限制。标本的冷冻显得至关重要，成功的冷冻保存和复苏技术是建立胎儿卵巢库的关键。 目的：通过对大鼠新鲜或冻融胚胎卵巢组织异体无血管移植后的组织形态和功能的观察，探讨胚胎卵巢组织异体移植和超速冷冻保存的可行性。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2006—03／05在云南省第一人民医院生殖遗传科进行课题设计，于2006—05／2007-02在云南大学单克隆抗体研究中心完成实验。 材料：卵巢来源于孕龄为18—20dSD大鼠胚胎。取阴道脱落细胞涂片证实有正常动情周期未交配过的SD成年雌性大鼠作为移植对象，分4组：正常对照组（n=10）、去势对照组（n=-10）、新鲜胚胎卵巢移植组（n=25）、冷冻胚胎卵巢移植组（n=25）。 方法：正常对照组仅行皮肤筋膜肌肉切开缝合术，去势对照组切除双侧卵巢组织。将孕龄为18-20d的新鲜或经超速冷冻法冷冻复苏的大鼠胚胎卵巢植入去势后4周的大鼠颈部皮下作为实验组，分别为新鲜移植组和冷冻移植组。 主要观察指标：通过阴道脱落细胞的观察和血清雌二醇、孕酮的测定了解大鼠内分泌恢复情况，并对移植卵巢进行组织学观察。 结果：新鲜移植组和冷冻移植组分别有52．17％和38．01％大鼠恢复了动情周期，两组血清雌二醇和孕酮在分别在35和49d恢复到正常，且动情周期天数与正常对照组比较，差异无显著性意义。冷冻移植组大鼠恢复动情周期虽稍短于新鲜移植组，但差异并无统计学意义。63d后取出移植物观察，见移植物色泽红润，表面有丰富的血管形成，镜下见卵巢内有大量的小动脉和小静脉：移植物组织学检查发现卵泡的发育，光镜下可见不同发育阶段的卵泡，有成熟卵泡和黄体形成，形态与正常卵巢无明显差别。 结论：大鼠胚胎卵巢异体异位无血管皮下移植后能存活、生长发育并具有与正常卵巢相似的内分泌功能；超速冷冻法能较好的保存胚胎卵巢的活性，复苏后与新鲜胚胎卵巢组织具有相同的生理活性。     

大鼠卵巢组织的冷冻移植

背景:玻璃化冷冻是应用高浓度的冷冻保护液结合极快的制冷速度,使细胞快速冷冻,避免细胞内外冰晶形成对细胞的破坏作用,是一种比较新的冷冻方法,具有操作简单、冷冻效率高等特点.目的:采用玻璃化冷冻技术冷冻大鼠卵巢组织,比较4种冷冻保护剂对大鼠卵巢组织学和功能的影响.方法:将大鼠随机数字表法分为6组,每组6只:二甲基亚砜+乙二醇组、二甲基亚砜+乙二醇+蔗糖组、二甲基亚砜+乙二醇+蔗糖+乙酰胺组、乙二醇+蔗糖+乙酰胺组、去势组、正常对照组.4冷冻组摘除卵巢后应用相应的冷冻保护液冻存,去势组仅摘除卵巢不冻存、不移植,正常对照组不作处理.冻存2周后解冻复苏行同体异位移植,将卵巢组织植入大鼠后肢大腿内侧.移植后30 d,观察阴道上皮类型及动情周期;移植后3个月,经腹主动脉采血检测血清雌二醇水平;回收卵巢组织做组织学检查.结果与结论:4冷冻组均可见卵巢组织结构受损表现,原始卵泡的形态正常率分别为67.9%,71.6%,80.5%,59.4%,初级卵泡形态正常率分别是41.6%,52.3%,55.9%,36.7%.二甲基亚砜+乙二醇+蔗糖+乙酰胺组卵泡正常率较二甲基亚砜+乙二醇组、乙二醇+蔗糖+乙酰胺组高(P<0.05);不同发育阶段卵泡构成比差异无显著性意义,均未见典型的次级卵泡.受损的卵细胞主要表现为体积变小、胞浆内出现空泡、核皱缩等.4冷冻组未出现典型动情周期的细胞类型.移植物自周围组织获得可见的血管供应,将卵巢组织块连接形成网络.移植物内毛细血管丰富,皮质中可见成群的原始卵泡,初级卵泡、次级卵泡所占比例低于原始卵泡,形态与正常者相似.4种冷冻方法冻存卵巢组织血清雌二醇水平较正常对照组明显降低(P<0.01),二甲基亚砜+乙二醇+蔗糖+乙酰胺组高于其他冷冻组(P<0.05).结果提示4种冷冻方法均对大鼠卵巢组织有一定程度破坏,初级卵泡的损伤大于原始卵泡.冻存复苏后,卵巢功能恢复,但并不完全,二甲基亚砜+乙二醇+蔗糖+乙酰胺组效果优于另外3组,但移植后动物没有出现规律的动情周期,提示冷冻方法尚需进一步完善.     

枸杞多糖对胎儿卵巢组织冷冻保存的影响◆

背景:抗氧化剂的应用对于提高卵巢组织冻存后的活力起着很重要的作用.目的:通过观察冷冻保存的胎儿卵巢组织异种移植到裸鼠肾被膜下的发育情况,探索枸杞多糖在卵巢组织冷冻保存中的作用.方法:实验分为4组.①新鲜移植组:取材后的新鲜胎儿卵巢组织直接进行移植.②冻存对照组:冷冻保护液为基液.③β-巯基乙醇组:冷冻保护液为基液添加100μmol/L β-巯基乙醇.④枸杞多糖组:冷冻保护液为基液添加400 mg/L枸杞多糖.对冷冻复温后的胎儿卵巢皮质块进行祼鼠的肾被膜下移植,并于移植后12周取材.结果与结论:各组在移植物的存活率上差异无显著性意义(P >0.05).在卵泡计数上冷冻对照组最低(P <0.05).在卵泡的存活率上,各组间差异均有显著性意义,其中以冷冻对照组最低,枸杞多糖组最高.β-巯基乙醇组和枸杞多糖组卵巢超微结构较冷冻对照组保存的好.提示400 mg/L的枸杞多糖和100μmol/L的β-巯基乙醇有利于卵巢组织的冷冻保存,并可显著提高冷冻卵巢组织移植后的存活率.     

冻存卵巢组织移植后抗损伤处理对移植结局的影响

背景:卵巢组织移植是无血管吻合移植,改善卵巢组织对移植后损伤的耐受力是提高冻存后移植卵巢组织卵泡存活和发挥功能的关键环节.目的:比较冻存后卵巢组织自体异位移植后,应用血管内皮生长因子、维生素E、黄芪抗损伤处理对卵巢组织形态和功能恢复的影响.方法:将成年雌性Wistar大鼠随机数字表法分为4组:正常对照组、去势组、自体新鲜卵巢组织移植组(卵巢组织未冻存,直接移植)、冷冻保存卵巢组织移植组.冷冻保存卵巢组织移植组移植后分3组干预:未经抗损伤处理组,血管内皮生长因子、维生素E、黄芪联合抗损伤组,血管内皮生长因子、维生素E联合抗损伤组.移植2个月后检测血清雌二醇水平,苏木精-伊红染色后观察卵泡的形态及正常卵泡数量.结果与结论:应用血管内皮生长因子、维生素E、黄芪联合抗损伤组较未用药物组血清雌二醇水平升高,初级卵泡数量增加,且差异显著(P＜0.05),即抗损伤药物对卵巢形态和功能的恢复有作用.血管内皮生长因子、维生素E、黄芪联合抗损伤组血清雌二醇水平、初级卵泡数量略高于血管内皮生长因子、维生素E联合抗损伤组,但差异无显著性意义.尚不能认为加用黄芪抗损伤处理效果更佳.提示自体异位移植后应用血管内皮生长因子、维生素E、黄芪抗损伤处理对卵巢形态和I功能的恢复均有作用.     

枸杞多糖对胎儿卵巢组织冷冻保存的影响

背景：抗氧化剂的应用对于提高卵巢组织冻存后的活力起着很重要的作用。目的：通过观察冷冻保存的胎儿卵巢组织异种移植到裸鼠肾被膜下的发育情况,探索枸杞多糖在卵巢组织冷冻保存中的作用。方法：实验分为4组。①新鲜移植组：取材后的新鲜胎儿卵巢组织直接进行移植。②冻存对照组：冷冻保护液为基液。③β-巯基乙醇组：冷冻保护液为基液添加100μmol/Lβ-巯基乙醇。④枸杞多糖组：冷冻保护液为基液添加400mg/L枸杞多糖。对冷冻复温后的胎儿卵巢皮质块进行祼鼠的肾被膜下移植,并于移植后12周取材。结果与结论：各组在移植物的存活率上差异无显著性意义（P〉0.05）。在卵泡计数上冷冻对照组最低（P〈0.05）。在卵泡的存活率上,各组间差异均有显著性意义,其中以冷冻对照组最低,枸杞多糖组最高。β-巯基乙醇组和枸杞多糖组卵巢超微结构较冷冻对照组保存的好。提示400mg/L的枸杞多糖和100μmol/L的β-巯基乙醇有利于卵巢组织的冷冻保存,并可显著提高冷冻卵巢组织移植后的存活率。     

不同冷冻方案保存人类卵巢组织的活性比较

背景：卵巢组织冷冻保存被认为是保存女性生殖内分泌功能安全、有效的方法,但目前尚无统一确定的方案。 目的：探讨3种冷冻方案对人类卵巢组织保存冷冻效果及卵泡活性的影响。方法：采用丙二醇慢速程序冷冻法、二甲基亚砜玻璃化冷冻法、液氮直投法对20例人类卵巢组织进行冷冻保存,复苏后采用细胞存活/死亡荧光分析法计数有活性的细胞,体外培养测定培养液雌二醇浓度及各级卵泡计数,判断3种不同冷冻方案对人类卵巢组织活性的影响。结果与结论：不同冷冻方案冻融后卵巢组织块的活性卵泡率均低于新鲜卵巢组（P 〈 0.05）,二甲基亚砜组最低,液氮直投法组与慢速程序冷冻法组差异无显著性意义。体外培养各冷冻组分泌的雌二醇水平比较,第4天时二甲基亚砜组低于液氮直投法组和慢速程序冷冻法组（P 〈 0.05）,至第8天时各冷冻组雌二醇水平与新鲜卵巢组一致。培养14 d组织学观察,各组卵巢组织内生长期卵泡比例增多,始基卵泡仍然占最主要的。新鲜卵巢组织正常卵泡的总数高于冷冻组（P 〈 0.05）,二甲基亚砜组的正常卵泡数低于液氮直投法组和慢速程序冷冻法组（P 〈 0.05）。提示冷冻保存对卵巢组织卵泡有一定的损伤,但仍能保存大部分始基卵泡的活性,经体外培养后可进一步发育并具有分泌功能,在3种冷冻方案中,慢速程序冷冻法和液氮直投法的冷冻效果优于二甲基亚砜玻璃化冷冻法,液氮直投法操作简便,冷冻效果稳定。     

促卵泡刺激素干预改善绵羊卵巢组织玻璃化冻存后异种移植的效果研究

背景:卵巢皮质片移植是无血管吻合移植,因此,提高卵巢组织对冻存-解冻和移植后缺血的耐受力是提高冻存后移植物卵泡存活和延长功能寿命的关键环节.目的:观察促卵泡刺激素在玻璃化冻存过程中对绵羊卵巢组织形态和功能的保存效果,为成人卵巢组织的冻存提供技术方法.方法:BALB/c品系雌性裸鼠随机分为3组.均行羊卵巢皮质片裸鼠异位移植:①新鲜移植对照组,取材后即移植.②玻璃化冻存移植组,采用玻璃化冻存解冻后移植,所用液体均未添加促卵泡刺激素.③添加促卵泡刺激素的玻璃化冻存移植组,采用冷冻液、解冻液和培养液均添加促卵泡刺激素的玻璃化冻存后移植.移植后检测受体鼠动情周期恢复率、恢复时间、卵泡数和发育状况,于移植后4周取移植卵巢进行组织学观察、并行血清雌二醇水平分析.结果与结论:含促卵泡刺激素的玻璃化冻存移植组与新鲜移植组相比动情周期恢复率、每高倍视野卵泡计数差异均无显著性意义(P>0.05),卵泡计数高于未添加促卵泡刺激素的玻璃化冻存移植组(P<0.05);动情周期恢复需要的天数接近于新鲜移植组,明显短于未添加促卵泡刺激素的玻璃化冻存移植组(P<0.05).移植后4周,含促卵泡刺激素的玻璃化冻存移植组组织学观察见卵泡发育,未添加促卵泡刺激素的玻璃化冻存移植组仅偶见原始卵泡.含促卵泡刺激素的玻璃化冻存移植组与新鲜移植组相比血清雌二醇水平差异无显著性意义(P>0.05),显著高于未添加促卵泡刺激素的玻璃化冻存移植组(P< 0.05).结果提示,在玻璃化液中加入促卵泡刺激素可提高冻存绵羊卵巢组织移植后卵泡存活率.     

海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊化大鼠卵巢细胞腹腔异体移植以及对肾上腺的影响

背景:应用海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊技术包裹细胞进行异体移植,被证明是一种可避免受体产生免疫排异的有效方法.目的:观察海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊化卵巢细胞种植于去卵巢大鼠腹腔后对受体大鼠肾上腺的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-03/2008-09在首都医科大学生殖医学研究中心完成.材料:取Wistar大鼠卵巢分离培养卵巢细胞,进行微囊化处理,制备包裹卵巢细胞的海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊.方法:将40只雌性Wistar大鼠随机分为4组:去势组于无菌条件下切除双侧卵巢;微囊移植组手术摘除双侧卵巢后腹腔移植包裹卵巢细胞的海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊;雌激素替代治疗组手术摘除双侧卵巢后腹腔注射乙烯雌酚 0.2 mg/kg,每3 d注射1次.正常对照组不进行任何处理.主要观察指标:干预后30 d放射免疫法检测大鼠血清中雌激素水平,观察肾上腺切片的形态学特点,并利用免疫组织化学SP法检测各组大鼠肾上腺皮质各层增殖细胞核抗原表达变化.结果:①放射免疫法检测正常对照组,雌激素替代治疗组以及微囊移植组雌激素水平明显高于去势组,而正常对照组,微囊移植组,雌激素替代治疗组之间雌激素水平差异无显著性意义.②去势组肾上腺皮质网状带增厚,网状带与球束状带比值增大,束状带和网状带增殖细胞核抗原阳性表达都增加;而微囊移植组及雌激素替代治疗组增殖细胞核抗原阳性细胞明显低于去势组,差异具有显著性意义.结论:微囊化大鼠卵巢细胞异体移植后,可在受体大鼠体内继续合成和分泌雌二醇,所分泌的雌激素可以纠正肾上腺皮质因卵巢摘除而导致的形态改变,并与雌激素替代治疗疗效相近.     

长期力竭运动动情周期抑制模型大鼠卵巢组织形态和超微结构的变化

背景:研究运动性月经失调女性性腺和卵巢的功能,以及形态学的改变对于探讨运动性月经失调的发生机制具有重要意义。目的:通过建立长期力竭运动致动情周期抑制大鼠模型,观察卵巢的组织形态和细胞超微结构的变化。方法:正常3月龄SD雌性大鼠随机分成对照组和模型组,其中模型组大鼠每日进行一次力竭游泳运动直至其动情周期紊乱,取卵巢组织,苏木精-伊红染色,光镜下观察卵巢组织形态变化,电镜下观察卵巢细胞超微结构的变化。结果与结论:与对照组相比,模型组大鼠卵巢典型生长卵泡和新鲜黄体明显减少,原始卵泡、闭锁卵泡则相对增加,其颗粒细胞、黄体细胞内细胞器明显减少而含有大量的脂滴。提示长期力竭运动可抑制大鼠卵巢卵泡的发育、成熟、排卵与黄体形成,并使卵巢细胞的超微结构发生抑制性改变。     

宿主自身卵巢对移植胚鼠卵巢生长发育影响的实验研究

目的:探讨宿主自身卵巢与移植胚鼠卵巢的生长发育是否存在相互影响的关系.方法:将胚鼠卵巢分别移植至单侧卵巢摘除及去势雌鼠皮下,观察同时存在的自身卵巢对移植卵巢生长发育有无影响,以及自身卵巢是否受移植卵巢影响.结果:单侧卵巢摘除宿主卵巢黄体总体均数较高,差异有统计学意义(F=11.611.P=0.001).去势宿主体内移植的胚胎卵巢中的原始卵泡会继续生长发育出各阶段卵泡,而单侧卵巢摘除者体内的移植停止发育,抑或纤维化吸收.结论:宿主体内卵巢与移植胚鼠卵巢卵泡存在相互竞争关系,自身卵巢较移植物卵泡更具优势.