人血清中甘露聚糖结合凝集素的检测及意义

建立检测甘露聚糖结合凝集素 (MBL )的酶联免疫法 ,检测 2 2 6例不同性别、年龄正常人和 115例病人血清中的MBL水平。结果发现儿童组显著低于成人组。术后、烧 (烫 )伤和支原体肺炎患者的血清MBL水平 ( x±s)分别为 (6 73± 3 2 9)mg/L、 (5 86± 3 37)mg/L和 (5 18± 3 4 3)mg/L ,较正常对照组 (2 6 5± 1 5 6 )mg/L显著增高 ,而慢性肾脏病患者的血清MBL水平 (1 0 4± 0 4 8)mg/L显著降低。结果提示血清MBL水平可作为监测个体天然免疫功能的一项指标     

甘露聚糖结合凝集素与妊娠期糖尿病的研究进展

甘露聚糖结合凝集素(mannose binding lectin,MBL)也曾称为甘露聚糖结合蛋白(mannan binding protein)是一种钙离子依赖的(C型)血清凝集素蛋白,也是第一个被发现的具有防御功能的C型凝集素。MBL作一种急性时相蛋白由肝脏合成分泌,是宿主体内非特异免疫最重要的免疫分子。一直以     

联合应用配体和单克隆抗体亲和层析纯化人血浆天然MBL蛋白

目的优化从人血浆分离纯化天然甘露聚糖结合凝集素（MBL）的方法。方法联合应用甘露聚糖-Sepharose 4B层析柱和抗人MBL-CRD单克隆抗体-Sepharose 4B层析柱，3次上柱亲和层析分离，分别用EDTA、D-甘露糖、Gly-HCl（pH2．4）溶液洗脱结合蛋白。以SDS-PAGE、Western blot和ELISA等技术鉴定纯化产物。结果所获纯化MBL为Mr28000和Mr32000肽链构成的功能性寡聚体，其纯度较高，可与配体甘露聚糖结合并有效凝集酵母菌，还能与U937细胞胶凝素受体结合。结论联合使用配体亲和层析和单克隆抗体亲和层析从血浆中分离纯化MBL，获得高纯度、高活性的天然MBL蛋白。     

甘露聚糖结合凝集素基因启动子区多态性及其意义

甘露聚糖结合凝集素是机体重要的天然免疫防御分子 ,其血清水平主要受结构基因点突变的影响和启动子区多态性的调控。本文简介其启动子区基因结构、多态性及生物学意义。     

甘露聚糖结合凝集素的分离纯化及其与单糖配体的结合活性鉴定

从羊血清中分离纯化甘露聚糖结合凝集素 (MBL ) ,并研究其与单糖配体的结合活性 ,为进一步研究MBL与病原微生物的识别结合活性提供研究基础。用甘露聚糖 Sepharose 4B亲和柱行亲和层析 ,从羊血清中分离纯化出MBL分子 ,行还原性SDS PAGE测定其分子量。用VII型胶原酶鉴定其胶原样结构。用酶联凝集素试验 (ELLA)鉴定其与单糖配体的结合活性。得到纯化的羊血清MBL分子有两种单体 ,相对分子质量分别为 2 90 0 0和 330 0 0。羊血清MBL具有胶原样结构 ,可以被胶原酶消化。羊血清MBL与辣根过氧化物酶表面糖链中甘露糖的结合受N 乙酰葡糖胺、L 岩藻糖、D 氨基葡糖、N 乙酰氨基半乳糖不同程度的抑制。MBL与单糖配体的结合活性预示了其潜在的与表面富含这些糖基结构的病原微生物的识别结合能力。     

甘露聚糖结合凝集素缺损与自身免疫性疾病

甘露聚糖结合凝集素(MBL)系胶原凝集素家族成员,是天然免疫系统中的重要分子。血清MBL浓度受其结构基因第一外显子几个点突变的影响和启动子区多态性的调控。MBL基因突变使其血清浓度降低,除导致调理吞噬缺损外,还与自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、干燥综合征、皮肌炎、克隆病、动脉炎等有关。     

甘露聚糖结合凝集素与临床疾病的研究进展

甘露聚糖结合凝集素(MBL)是天然免疫补体系统中的一员,主要由肝细胞合成,作为急性期反应蛋白分泌入血清。血清MBL的水平主要由MBL2基因启动子区及外显子1区的基因多态性决定。MBL可选择性的与病原微生物(如G+/G-细菌、病毒、真菌、原生物等)、坏死损伤细胞、凋亡细胞以及肿瘤细胞等表面的相应配体结合,通过激活补体系统、调理吞噬、调节炎症反应等保护人体。血清MBL的水平对人体影响较大:当血清MBL缺乏时,机体易患某些疾病,如感染性疾病、自身免疫性疾病;但如果血清MBL水平过高,又会对自身组织造成损伤,如在心肌梗死及器官移植中,引起机体的缺血再灌注损伤;此外,MBL基因型及血清MBL水平与肿瘤的易感性可能也存在一定关系。     

甘露聚糖结合凝集素突变型等位基因与SLE关联的研究

收集系统性红斑狼疮(SLE)患者和普通人群血标本,提取白细胞基因组DNA,以多聚酶链反应扩增目的基因片段,应用荧光探针杂交技术检测甘露聚糖结合凝集素(MBL)基因GGC54GAC、GGA57GAA和CGT52TGT点突变(分别称为等位基因B、C、D,所有突变型统称为O,野生型即A),分析MBL突变型等位基因与SLE及其严重程度的关系。74例SLE患者中,检出等位基因型A/B24例(32.4%)、B/B5例(6.8%)、A/C2例(2.7%)、A/D1例(1.4%)和B/C2例(2.7%),B、C、D的频率为0.250、0.028和0.007,突变型等位基因O的频率为0.285;95例对照组中,检出A/B22例(23.2%)、B/B2例(2.1%)和A/C1例(1.1%),B、C的频率分别为0.137和0.005,O的频率为0.142;两者比较,其突变等位基因的分布有显著差异(P<0.05)。等位基因型O/O纯合子SLE患者肾脏损害的发生率达100%,而A/A或A/O型病人分别为35.0%和37.0%,存在非常显著差异(P<0.01)。因此,MBL突变型等位基因是SLE的易感因素并与肾脏累及有关。     

096 甘露聚糖结合凝集素基因启动子区多态性及其意义

甘露聚糖结合凝集素是机体重要的天然免疫防御分子，其血清水平主要受结构基因点突变的影响和启动子区多态性的调控。本文简介其启动子区基因结构、多态性及生物学意义。     

儿童巨细胞病毒感染与甘露聚糖结合凝集素表达相关性研究

目的探讨甘露聚糖结合凝集素（MBL）基因多态性及血浆蛋白水平与儿童巨细胞病毒（HCMV）感染的相关性。方法收集2007年3～11月在浙江大学医学院附属儿童医院诊断为HCMV感染的患儿作为HCMV感染组,选择同期行健康体检的儿童作为对照组。对两组行MBL基因检测和分型,并对HCMV感染组进行随访,分别测定其急性期和恢复期血浆MBL蛋白水平。分别比较两组基因变异频率和血浆MBL蛋白水平。结果HCMV感染组纳入104例,对照组纳入105例;HCMV感染组有50例患儿进行随访,HCMV感染组MBL基因启动子区-550位点的L型变异频率明显高于对照组（56.7%vs34.3%,P=0.001）,野生单体基因型HYPA的频率明显低于对照组（47.6%vs62.8%,P=0.002）,完整基因型中高水平表达基因型（YA/YA）的频率低于对照组（41.3%vs60.0%,P=0.007）,而低水平表达基因型（YA/XA,YA/YB,XA/XA）的频率高于对照组（52.9%vs29.5%,P=0.001）。HCMV感染组急性期和恢复期血浆MBL蛋白水平均低于对照组（P=0.019和0.000）。HCMV感染组急性期血浆MBL蛋白水平高于恢复期（P=0.000）。结论MBL基因多态性导致的血浆MBL蛋白水平低下与儿童HCMV感染相关,提示MBL可能对儿童HCMV感染具有保护作用。     

抗孕酮单克隆抗体的制备与鉴定及其初步应用

目的:获得一株特异性强,灵敏度高的抗孕酮单克隆抗体,用辣根过氧化物酶标记孕酮-11α-羟基孕酮半琥珀酸酯制成酶标记物,建立酶联免疫分析(ELISA)方法,用于检测人血清中孕酮含量。方法:用免疫原11α-OH-孕酮-BSA免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术,得到14株抗孕酮单克隆抗体;用反射免疫分析(RIA)方法测定抗孕酮单克隆抗体的亲和常数和交叉反应率。结果:获得的14株抗孕酮单克隆抗体具有较高的亲和性和较小的价差反应率;建立ELISA方法学的灵敏度为0.12 ng/ml;批内变异系数为7.5%～11.4%;批间变异系数为:8.2%～12.1%;回收率93.8%～124.7%;高值临床样品系列倍比稀释后,测定值与稀释度呈线性相关,相关系数为r=0.995 7;与全自动化学发光测定的临床样品值比对结果较好,线性方程为y=0.789 4x+0.760 0,r=0.912 6。结论:方法学鉴定结果符合免疫分析的基本要求。     

人组织激肽释放酶单克隆抗体的制备及其ELISA检测试剂盒的建立

目的 制备人组织激肽释放酶(human tissue kallikrein,HK)单克隆抗体(McAb),并研制检测人尿中HK含量的ELISA试剂盒.方法 以一段HK特异多肽和血蓝蛋白(KLH)的耦联物作为抗原免疫BALB/c小鼠,并采用杂交瘤技术制备抗HK的单克隆抗体.然后建立快速检测HK含量的间接竞争ELISA试剂盒.结果 获得了8株可分泌抗HK的杂交瘤细胞株,其产生的抗体效价为1:25 600;经1:1600倍稀释后的竞争抑制率为0.88;经纯化后的纯度为100%,其标准曲线对线良好(r=0.990).结论 成功制备了高效价、高特异性和高纯度的抗HK的单克隆抗体.同时建立了一种可以快速检测人尿中HK含量的ELISA试剂盒.

Abstract：

Objective To prepare monoclonal antibody(McAb) against human tissue kallikrein (HK) and develop an ELISA kit allows for the in vitro quantitative determination of human tissue kallikrein in urine. Methods To generate a monoclonal antibody specific for TK, the synthetic TK peptide consisting of 12 amine acids(12P), was fused to keyhole limpet hemocyanin(KLH) and used for immunization. Using hybridoma screening, monoclonal secreting cell lines were identified and used to generate ascites in BALB/c mouse. Antibody was purified by affinity column chromatography. 12% SDS-PAGE and Western blot were used to visualize the purified antibody. This kit employs indirect competitive ELISA technique and BiotinAvidin System. 12P was fused to bovine serum albumin(BSA) and has been pre-coated onto a microplate at first. Standards and samples were added to the appropriate microplate wells with a biotin-conjugated McAb croplate well. A TMB substrate solution is added to each well. The enzyme-substrate reaction is terminating by the addition of a sulphuric acid solution and the color change is measured spectrotometrically at a wavelength of 450 nm. The concentration of tissue kallikrein in the samples is then determined by comparing the O.D. of the samples to the standard curve. Results 8 hybridoma cell lines secreting mAbs special to HK,SDS-PAGE and Western blot demonstrated successful preparing and purification of McAb( 100% ). The linearity of this ELISA kit is demonstrated(r =0. 990). The range of detection of the assay is 0.008 μg/ml to 0. 5 μg/ml. The assay remained stable, with no change in the values measured, over five cycles of freezing and thawing. Conclusion 8 McAbs against HK have been prepared successfully and possess high titer and specificity. The development of an ELISA kit for detecting HK can meet the needs of detection of HK in urine samples.     

抗人白细胞单克隆抗体的特异性及其特性鉴定

目的制备抗人白细胞单克隆抗体（ｍＡｂ），并对其识别抗原及组织的特异性进行鉴定。方法采用分离的人全白细胞悬液免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，取脾细胞与Ｓｐ２／０细胞常规融合，用间接ＥＬＩＳＡ筛选ｍＡｂ，流式细胞仪及免疫组化染色ＳＰ法鉴定其组织特异性。　结果成功地制备１株抗人白细胞　ｍＡｂ，命名为ＳＺ－１０５。ＥＬＩＳＡ法测定其腹水效价为１×１０－５。琼脂糖双扩散鉴定为ＩｇＧ１类。流式细胞仪间接免疫荧光技术及免疫组化ＳＰ法测定表明，ｍＡｂ　ＳＺ－１０５可选择性地与外周血液的粒细胞、单核细胞和淋巴细胞呈强阳性反应，而与红细胞及血小板不出现反应。该ｍＡｂ还可与正常人骨髓的白细胞前体起反应。另外，在肝、肺、脾、胸腺及淋巴结正常组织中的巨噬细胞表面，也有ＳＺ－１０５抗原表达。ＳＺ－１０５抗原经亲和层析纯化，再经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　和Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ证实，ｍＡｂ　ＳＺ－１０５识别的抗原是相对分子质量（Ｍｒ）为７５　０００左右的单链蛋白多肽。结论　获得１株具有高度免疫学活性和组织特异性的抗人白细胞ｍＡｂ　ＳＺ－１０５，其对研究白细胞的分化、免疫功能，以及隐匿性急、慢性炎症疾病的放免显像诊断都具有一定的临床意义。     

抗人LSECtin单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的:制备抗肝脏、淋巴结窦内皮细胞C型凝集素(LSECtin)单克隆抗体(mAb),并进行特性鉴定。方法:采用原核表达的LSECtin免疫BALB/c小鼠,以间接ELISA法筛选分泌特异性mAb的杂交瘤细胞,采用蛋白印迹、间接免疫荧光、流式细胞术和免疫组化染色法鉴定mAb的特异性。结果:共获得8株可稳定分泌mAb的杂交瘤细胞株。mAb的Ig亚类均为IgG,效价达1∶106~1∶107。这些mAb均可识别转染3T3细胞膜上的人LSECtin,6株mAb可特异识别肝脏窦内皮细胞。结论:成功地制备8株抗LSECtin的mAb,经免疫印迹、流式细胞术和免疫组化染色检测,这些mAb的特异性良好,为研究LSECtin的功能提供了有力的试剂。     

Pfs25蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA的建立

目的:制备恶性疟原虫子孢子囊表面膜蛋白Pfs25的单克隆抗体( mAb),建立检测Pfs25蛋白的双抗体夹心ELISA方法.方法:纯化毕赤酵母表达的重组Pfs25蛋白,并免疫BALB/c小鼠,采用骨髓瘤细胞Sp2/0与免疫BALB/c鼠脾细胞杂交的细胞融合技术,通过间接ELISA检测获得分泌抗Pfs25抗体的阳性杂交瘤细胞株,通过免疫F1鼠诱生腹水,纯化腹水,并进行mAb的各项生物学鉴定.辣根过氧化物酶(HRP)标记纯化后的抗体,以4B7为包被抗体,1B4为酶标抗体,建立了双抗体夹心ELISA法.结果:获得3株抗Pfs25的杂交瘤细胞株,其中2株有良好的稳定性和特异性.并建立了双抗体夹心ELISA检测法,检测有效范围在0.07～1 mg/mL,其检测灵敏度为41.6 ng/mL.结论:成功制备抗Pfs25蛋白的单克隆抗体,并建立了一种可用于Pfs25蛋白检测的双抗体夹心ELISA法,为Pfs25蛋白制备传播阻断型疟疾疫苗奠定了基础.     

抗人羧酸酯酶-Ⅱ单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备鼠抗人羧酸酯酶-Ⅱ(humancarboxyles-terases-Ⅱ,hCE-Ⅱ)单克隆抗体(mAb)并对其特性进行鉴定。方法以含hCE-Ⅱ的人肝脏微粒体蛋白混合抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备鼠抗hCE-Ⅱ的mAb,并用Protein-G亲和层析法纯化mAb。用间接ELISA法测定mAb的效价,以Westernblot鉴定mAb的特异性、免疫组化染色法对mAb相应的抗原进行组织定位。用免疫沉淀和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry,MALDI-TOF-MS)得到相应的肽质量指纹谱(peptidemassfingerprint,PMF),再通过Mascot在人类蛋白质数据库中分析比对鉴定mAb对应的抗原。结果获得1株可持续、稳定分泌抗hCE-Ⅱ的mAb的杂交瘤细胞系。杂交瘤细胞分泌的mAbIg的亚类(型)为IgG1(κ),腹水mAb的效价达1×10-7。Westernblot分析显示,在Mr为62000处有1条清晰的带。免疫组化染色显示,该mAb可与肝细胞的浆蛋白结合(hCE-Ⅱ存在于肝细胞浆内微粒体),而不与血管平滑肌细胞内的蛋白结合。该mAb免疫沉淀物的Mr为62000,与hCE-Ⅱ的Mr相符。对免疫沉淀的蛋白质进行质谱鉴定证实,该mAb对应的抗原为hCE-Ⅱ。结论制备出的鼠抗hCE-Ⅱ的mAb效价高、特异性良好,为进一步研究hCE-Ⅱ的功能及其在肝癌等癌症的诊断和治疗中的作用提供了工具。     

鼠抗人c-Kit单克隆抗体的制备及其特性鉴定

目的:鼠抗人c-Kit单克隆抗体(mAb)的研制及其生物学特性的鉴定.方法:利用PCR技术获得人c-Kit的胞外免疫球蛋白区编码序列, 并将其亚克隆至原核表达载体pQE30, 构建出重组表达质粒pQE30-hKitD4-5.测序鉴定正确后转化M15, 经IPTG37℃诱导4 h后, SDS-PAGE显示融合蛋白(表达产物)以包涵体形式存在.用镍柱对融合蛋白进行纯化, 将纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠, 采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合, 经流式细胞术(FCM)分析和多次克隆化培养, 筛选出特异分泌鼠抗人c-Kit分子mAb的杂交瘤细胞株.采用Western blot、 Ig亚型快速定性试纸法、 FCM等对mAb的生物学特性进行鉴定.结果:成功表达及纯化了人c-Kit重组蛋白, 并获得1株持续、稳定分泌鼠抗人c-Kit mAb的杂交瘤细胞株, 命名为SRJ1.ELISA和Western blot、 FCM结果显示了该株mAb 能够识别Kasumi白血病细胞株表面表达的天然的c-Kit分子, 并与人正常外周血细胞无交叉反应.值得注意的是, Kasumi细胞含有一个不被SRJ1识别的亚群, 虽然其表达c-Kit(Ab81 mAb的结合正常).结论:成功构建了原核表达载体pQE30-Kit4-5, 并获得高纯度的人pQE30-Kit4-5重组蛋白;成功制备了1株特异性的鼠抗人c-Kit mAb杂交瘤.其所分泌的抗体能特异地识别人c-Kit分子, 并且可能成为区分细胞表面表达不同c-Kit分子的潜在检测工具.     

人卵泡刺激素β亚基单克隆抗体的制备及鉴定

目的　建立分泌抗人卵泡刺激素 (FSH) β亚基 5 1～ 6 0片段单克隆抗体细胞株 ,并对单抗进行免疫学鉴定。 方法　以人工合成的FSHβ蛋白抗原决定簇多肽为免疫原 ,采用脾内包埋法免疫Balb c小鼠 ,取其脾细胞与SP2 0小鼠骨髓瘤细胞融合 ,杂交瘤细胞用人工合成的人FSHβ亚基 5 1～ 6 0片段包被、间接ELISA法筛选。结果　获得稳定分泌抗人FSHβ片段单抗细胞 1株 (F1C)。ELISA检测腹水效价为 1∶1.6× 10 4 ,与黄体生成素 (LH)、促甲状腺素 (TSH)、人绒毛膜促性腺激素 (hCG)等无交叉反应 ,免疫印迹 (Westernblot)显示该单抗特异性强。结论　本实验所制备的单抗具有良好的灵敏性、特异性和实用性 ,可用于酶免疫检测方法的建立 ,为检测试剂盒的研制及其临床应用提供了有力的依据     

抗人IL—2单克隆抗体的制备及其特征

用基因重组人IL—2(rIL—2)免疫的BALB/C小鼠脾细胞与NS—1细胞株杂交,经3～5次克隆获得9株分泌抗IL—2单克隆抗体杂交瘤,所分泌抗体均为IgG_1。其中3B5杂交瘤诱生的腹水中抗体效价达10万倍稀释度。它既能中和用于免疫的rIL—2活性,也可中和其它来源的基因重组人rIL—2,但与天然rIL—2反应弱。rIL—2可与4C3抗体包被的Sepharose 4B组合,並能用1.5%醋酸洗脱。因此它可做为基因工程制备rIL—2的辅助试剂及用于与rIL—2相关的研究。     

抗青霉素单克隆抗体的制备及初步应用

目的:制备抗青霉素的单克隆抗体(mAb)并建立双抗体夹心ELISA检测方法,对临床上引起青霉素过敏反应的过敏原青霉噻唑蛋白进行研究。方法:将半抗原青霉素和载体蛋白偶联后免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术建立稳定分泌抗青霉素mAb的杂交瘤细胞株。常规制备腹水,用辛酸-硫酸铵法纯化,并对纯化的mAb进行特异性鉴定。通过对不同抗体组合的分析和条件的优化,建立检测过敏原的双抗体夹心ELISA方法。结果:经细胞融合、筛选及克隆化,共获得9株稳定分泌抗青霉素mAb的杂交瘤细胞株,其中5株亲和力较高。建立了双抗体夹心ELISA相对定量检测方法,该方法灵敏度达到870 U/L,平均回收率为107.81%,批内变异系数平均为6.7%,批间变异系数平均为9.3%,可用于A群链球菌制剂中青霉噻唑蛋白的检测。结论:成功地制备了抗青霉素的mAb,并建立了相对定量检测青霉噻唑蛋白的双抗体夹心ELISA法。