聚合酶链反应技术诊断苯丙酮尿症

为早期确诊，应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）结合限制性内切酶（ＥＣＯＲＩ、ＥＣＯＲＶ）方法，对初筛出具有高度苯丙酮尿症（ＰＫＵ）可能的６例患儿，行苯丙氨酸羟化酶基因分析。结果确诊３例，还为其中１例患儿母亲再次妊娠的胎儿作产前ＰＣＲ检测，鉴定出与ＰＫＵ致病基因相连锁的遗传特异片段，据此诊断出胎儿为杂合子，并经随访证实，应用ＰＣＲ技术对ＰＫＵ患者早期诊断乃至产前诊断是可靠且可行的。     

聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳在苯丙酮尿症产前基因诊断中的应用

苯丙酮尿症 (PKU)是常染色体隐性遗传病 ,因苯丙氨酸羟化酶 (PAH)基因突变致酶活性降低或丧失而造成高苯丙氨酸血症和智力低下。为进一步提高PKU产前基因诊断率 ,我们用s聚合酶链反应 变性梯度凝胶电泳 (PCR DGGE)对PCR短串联重复序列 (PCR STR)连锁分析 ,对家系的PAH基因的相对突变热点区域外显子 6 (e6 )、e7和e12作突变检测 ,以探讨其在PKU产前基因诊断的应用价值。一、对象和方法1.对象 :4个经典型PKU家系及其成员的外周血标本由中国医科大学第二临床医院提供。2 .DNA提取 :PKU家系父母外周血各 3ml,羊水 (妊娠16～ 2 …     

聚合酶链反应检测尿内人巨细胞病毒

２７例尿标本同时采用超速离心法，酚氯仿法抽提法、及原尿直接法，然后分别用于人类巨细胞病毒的聚合酶链反应检测。其阳性检出率分别为８５．１９％，５１．８５％和４８．１５％。经配比资料统计学分析表明，超速离心处理的阳性检出率显善高于抽提法和直接法。实验表明，原尿直接法的假阴性十分明显；而酚氯仿抽提处理亦无实际应用价值。唯有超速离心处理法可显著地提高尿巨细胞病毒的检测敏感性。     

聚合酶链反应技术诊断淋病的体会

2009年1月至2011年1月,我科采用聚合酶链反应技术(PCR)检测淋病标本1568份,现将检测结果报告如下. 1 材料与方法 1.1 研究对象 本组泌尿生殖器分泌物采集标本共1568例,均来自于我院泌尿外科和妇科门诊病例.其中男性标本656例,女性标本912例.年龄18～60岁,其中18～30岁526例(33.55％);31～40岁437例(27.87％),41～50岁386例(24.62％),51岁以上者219例(13.97％),本组均为有淋病症状的疑似病人.     

聚合酶链反应检测尿内人巨细胞病毒

２７例尿标本同时采用超速离心法，酚氯仿法抽提法、及原尿直接法、然后分别用于人类巨细胞病毒的聚合酶链反应检测。其阳性检出率分别为８５．１９％，５１．８５％和４８．１５％。经配比资料统计学分析表明，超速离心处理的阳性检出率显著高于抽提法和直接法。实验表明，原尿直接法的假阴性十分明显；而酚氯仿抽提处理亦无实际应用价值。唯有超速离心处理法可显著地提高尿巨细胞病毒的检测敏感性。     

聚合酶链反应在肺结核诊断中的作用

肺结核的诊断，很大程度上依赖细菌学上的检测，通常有疾涂片及培养，但二者的阳性率偏低，且后者较费时，常延误治疗时机。聚合酶链反应（PCR）技术的出现，为快速检测结核杆菌提供了方法。为探讨PCR在肺结核诊断中的作用，本文分析了59例肺结核病人及22例非肺结核病人疾PCR与常规涂片及培养检测结核杆菌的结果，并进行对比观察，现报告如下。1材料与方法1．l一般资料：59例肺结核经临床、胸部X线、CT、纤维支气管镜、细菌学检查及治疗效果观察，诊断明确。22例非肺结核病人包括慢支炎、肺气肿、肺部感染、支扩咯血、肺癌、气陶等，均…     

套式聚合酶链反应检测巨细胞病毒的初步研究

目的建立套式聚合酶链反应（ＰＣＲ）加限制性酶切分析方法检测人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）。方法在ＨＣＭＶ直接早期蛋白ＥｃｏＲＩＪＤＮＡ片段内，自行设计两对引物，建立套式ＰＣＲ检测ＨＣＭＶＤＮＡ，同时结合病毒分离检测临床标本。结果２３例新生儿肝炎综合征患儿中，１０例病毒分离及套式ＰＣＲ均阳性；１例病毒分离阴性，但套式ＰＣＲ阳性。对５８例妊娠早期孕妇血标本进行检测，套式ＰＣＲ阳性率为９％，病毒分离阳性率则为７％。结论套式ＰＣＲ加限制性酶切分析是一种临床检测ＨＣＭＶ的快速有效手段，值得临床推广。     

聚合酶链反应检测肺炎衣原体方法的建立与初步应用

目的探讨聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术在肺炎衣原体检测中的应用。方法参照Ｃａｍｐｂｅｌ报道的肺炎衣原体全基因序列、Ｇ＋Ｃ比例和次级结构设计一对引物，采用ＰＣＲ法检测肺炎衣原体ＤＮＡ及临床标本中的肺炎衣原体感染。结果经对肺炎衣原体、沙眼衣原体、大肠埃希菌、溶血性链球菌、白色念珠菌和结核分枝杆菌培养物进行ＰＣＲ扩增，结果只有肺炎衣原体出现单一４３７ｂｐ的扩增区带；敏感性试验可检测出１０ｆｇ的肺炎衣原体ＤＮＡ；１０份模拟标本均扩增出４３７ｂｐ区带；２２份小儿肺部感染的咽拭子标本中有５份为阳性，阳性率为２２．７％，而显微镜检查只有２例可见包涵体；１２份正常小儿咽拭子标本均为阴性。结论ＰＣＲ法检测肺炎衣原体，具有特异、敏感、快速、准确的特点，为肺炎衣原体感染的临床诊断提供了科学的依据     

聚合酶链反应检测SEN病毒的方法学探讨

目的探讨聚合酶链反应(PCR)扩增SEN病毒(SENV)核酸的优化条件。方法将标本分别以Acupure DNA／RNA提取法(方法1)、SDS-蛋白酶K方法(方法2)及裂解液提取’兀V核酸法(方法3)抽提SENV DNA模板，并用3组针对SENV DNA不同区的引物进行扩增，比较不同模板提取方法、不同扩增引物及不同体积标本对SENV DNA检出率的影响。结果在191份血清中，方法1、方法2和方法3提取核酸后可分别检测出15份、9份和7份。采用方法1提取SENV DNA的基础上，采用2组套式引物分别扩增出15份和11份，一次PCR引物仅检出2份SENV DNA阳性标本；应用引物2扩增至少需要50μl血清。结论不同引物扩增方法和不同模板提取方法可能是影响SENV DNA检出率重要因素。     

应用聚合酶链反应检测真菌性角膜炎

目的:探讨应用聚合酶链反应(PCR)快速检测临床疑似真菌性角膜炎(FK)的方法。方法:以源于医学机会性致病性真菌18srDNA保守区的一对寡核苷酸序列B2F(5'-ACTTTCGTAGGATAG-3')和B4R(5'-TGATCGTCTTCGATAAATA-3')为通用引物,对临床疑似FK的标本进行PCR,并与培养进行对比。结果:在687bp处出现DNA扩增带者为阳性。30份临床标本的真菌培养率为23.3%,而经扩增阳性率为50%。结论:真菌通用引物PCR反应检测真菌性角膜溃疡有较好的敏感性和特异性。     

荧光定量聚合酶链反应检测细胞角蛋白19在乳腺癌诊疗中的应用

目的　探讨荧光定量聚合酶链反应 (FQ PCR)技术检测细胞角蛋白 19(CK19)基因表达在乳腺癌诊疗中的应用价值。方法　采用FQ PCR法 ,以甘油醛 3 磷酸脱氢酶 (GAPDH)为内对照 ,测定 15名健康女性体检者、2 5例良性乳腺疾病和 76例乳腺癌患者外周血中CK19的表达量。结果　CK19和CK19/GAPDH在正常对照组和良性乳腺疾病组间的差异无显著意义 (P >0 0 5 ) ,而乳腺癌组则显著高于前两组 (P <0 0 5 ) ,GAPDH在三组间的差异均无显著意义 (P >0 0 5 )。乳腺癌组的CK19和CK19/GAPDH阳性率为 5 3 9% (41/ 76 ) ,而另两组均为阴性。 2 7例乳腺癌患者术前 ,化疗后 1、2 8和5 6dCK19和CK19/GAPDH均呈下降趋势 ,但化疗后 1和 2 8d与术前比较 ,差异无显著意义 (P >0 0 5 ) ,化疗后 5 6d则显著低于术前 (P <0 0 5 )。结论　FQ PCR技术是较灵敏和特异的快速定量检测CK19方法 ,可用于乳腺癌的诊断和疗效监测。     

聚合酶链反应检测SEN病毒D亚型方法的建立

目的：研究建立SEN病毒D亚型（SENV－D）聚合酶链反应（PCR）检测方法。方法：选择SENV－D开放读码框1高度保守序列，设计合成2对特异性引物，建立检测SENV－D感染的套式PCR方法。对327例无偿献血和职业献血者进行SENV感染的检测，并对部分PCR阳性产物进行克隆测序，结果：该方法特异性和灵敏度均较高，检测结果显示无偿献血人群SENV－D感染率为5．5％，职业献血人群为6．7％，两者无统计学差异，结论：我国广东部分地区无偿献血和职业献血人群中存在SENV－D亚型感染；建立的该方法适用于SENV感染的检测。     

磁捕法对传染性非典型肺炎冠状病毒RNA富集体系的初步研究

目的 初步研究建立磁捕法对传染性非典型肺炎又称严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒RNA的富集、纯化体系,以提高逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测SARS冠状病毒RNA的敏感性。方法 根据国际基因库公布的SARS冠状病毒基因序列,自行设计引物、探针,体外克隆目的RNA片段作为标准物质;利用标准RNA以及模拟SARS血清标本的RNA,评价自行设计的SARS冠状病毒巢式RT-PCR检测体系和磁捕法SARS冠状病毒RNA富集检测体系的检测效果。结果SARS冠状病毒巢式RT-PCR检测体系,对于模拟血清SARS标本RNA的最低检测样本浓度为20拷贝/μl,而磁捕法SARS冠状病毒RNA富集检测体系的最低检测样本浓度为1拷贝/μl。结论 初步建立的磁捕法SARS冠状病毒RNA富集检测体系,可有效地对低浓度的RNA样本进行浓缩、纯化,有效提高SARS RT-PCR检测方法的敏感性。     

应用PCR—SSP技术对粒细胞抗原NA进行基因分型

根据ＮＡ基因序列,合成ＮＡ特异性引物,通过ＰＣＲ－ＳＳＰ技术,特异性地扩增ＮＡ１和ＮＡ２,建立ＮＡ基因分型方法,同时对１２０例浙江汉族人群进行ＮＡ基因型的检测。结果表明ＰＣＲ－ＳＳＰ技术对ＮＡ的基因分型方法简单、翰林折汉族人群的ＮＡ基因型ＮＡ１为０．５２５,ＮＡ２为０．４７５。     

多重聚合酶链反应检测生殖支原体感染

目的建立一种敏感快速的多重聚合酶链反应（ＰＣＲ）用于检测生殖支原体（Ｍｇ）。方法性病门诊患者５１１例，正常对照５６人。分泌物（女性为宫颈、男性为尿道拭子）标本用ＮＰ－４０裂解液一步法制备模板ＤＮＡ。设计Ｍｇ种属特异性引物及功能性结蛋白基因引物，先进行标准株的特异性与敏感性试验，然后进行临床标本的ＰＣＲ扩增反应。结果两对引物有良好的特异性，对Ｍｇ标准株模板敏感性可达１０－６μｇ。临床标本检测，广东地区２６１例性病门诊患者的Ｍｇ－ＤＮＡ阳性率（５４／２６１，２０．７％）高于上海（９／８４，１０．７％）、常州（８／７０，１１．４％）及南京地区（１１／９６，１１．５％；χ２＝１６．１，Ｐ＜０．０１），后三者的感染率互相间比较，差异无显著性（χ２＝０．０５６，Ｐ＞０．０５）。性病门诊患者５１１例的Ｍｇ－ＤＮＡ总阳性率（８２／５１１，１６．１％）与５６例正常对照者（１／５６，１．８％）比较，差异有非常显著性（χ２＝７．８８２，Ｐ＜０．０１）。结论建立的ＰＣＲ技术检测Ｍｇ具有敏感、快速、特异的特点，是一种可靠的实验诊断手段。     

Evaluation of 4 polymerase chain reaction protocols for cultured Leishmania spp. typing

Leishmaniasis is a disease caused by the protozoan Leishmania resulting in a variety of clinical manifestations, from self-healing skin lesions to fatal visceral disease. The development of polymerase chain reaction (PCR)-based techniques has made species identification easier, faster, and less labor intensive. The main targets for PCR amplification include kinetoplastid DNA (kDNA), miniexon, and conserved regions such as the internal transcribed spacer. The objective of this work was to evaluate 4 different PCR techniques designed to type Leishmania using laboratory strains. Parasites were subjected to 4 PCR procedures using specific Leishmania primers for miniexon (designated A1 and A2) and kDNA (designated B1 and B2, C1 and C2, and D1, D2 and D3). Discrimination between some species and the 2 main subgenera Leishmania and Viannia was achieved. Unweighted pair group method analysis resulted in the expected clustering of the 2 species from the subgenus Leishmania. However, some species in the subgenus Viannia could not be distinguished, representing a continued challenge for PCR-based protocols. Results are discussed in terms of advantages, limitations, and reproducibility of these 4 PCR-based techniques in the taxonomy of Leishmania.