PCR-SSCP技术分析线粒体DNA 多态性及其法医学应用

 目的探讨SSCP法在线粒体DNA分析中的应用及其在法医实际检案中的意义。方法利用PCR 方法直接扩增D-
LOOP区的HVI16106-16297 区域192 bp 片段作为目的片段,进行SSCP分型。检验150 例随机个体、10 例正常组织和5例甲醛
固定石蜡包埋的组织。结果在150例随机个体中,SSCP 检测发现9 种单倍型,DP值为0.881。在10例正常组织中,各个组织
的SSCP带型完全相同。5 例包埋组织的SSCP分型与对照组织一致。结论SSCP 技术分析线粒体DNA有较高的鉴别能力,适
用于陈旧降解检材的检验。     

改良一步法从甲醛固定-石蜡包埋组织中提取RNA

作者利用自行改良的一步法(异硫氰酸胍方法),从甲醛固定石蜡包埋组织提取ＲＮＡ并获得成功,现报道如下。一、材料与方法1组织材料及细胞:35例胆囊组织石蜡包埋标本在手术中切下后常规10%甲醛固定2～10ｈ,石蜡包埋。标本在常温下已保存1～7年。ＫＢＶ1细胞株是人类Ｈｅｌａ细胞的子代细胞。从ＫＢＶ1细胞抽提的ＲＮＡ用作逆转录聚合酶链式反应(ＲＴＰＣＲ)实验的对照组。2.从石蜡包埋组织中分离ＲＮＡ:实验过程从一步法[1]中改良得来。根据蜡块中组织块的大小取40～100μｍ组织切片。经脱蜡、离心和梯度乙醇清洗后获取组织。组织干燥后加入0.…     

消除肝组织免疫组化中非特异性显色的探讨

目的:初步研究加热抗原修复对内源性抗生物素蛋白结合物(EABA)的影响,探讨蛋清液在封闭肝组织EABA、消除非特异性显色中的作用.方法:采用免疫组化SP法及蛋清液封闭法,对甲醛固定石蜡包埋的30例肝细胞癌组织,30例门脉性肝硬化组织,10例肝脏海绵状血管瘤之周围正常肝组织进行EABA检查.结果:①经甲醛固定石蜡包埋后肝组织中的EABA被封闭.②加热抗原修复可造成EABA暴露.③EABA在正常肝组织、肝硬化组织及肝癌组织中都有分布,主要以颗粒状形式存在于胞质中,造成非特异性显色.④20%蛋清液可封闭肝组织中的EABA,消除它对正常染色的干扰.结论:加热修复可使甲醛固定石蜡包埋组织中的EABA重新暴露,暴露的EABA见于人体正常肝组织、肝硬化组织和肝癌组织中,因而对正常免疫组化染色可造成干扰;暴露的EABA可被蛋清液封闭,以蛋清液消除肝组织中非特异性显色的方法经济便捷,效果良好.     

多重聚合酶链反应分析石蜡包埋组织多肿瘤抵制基因探讨

目的：建立一种敏感、特异和快速检测石蜡包埋组织中多肿瘤抑制基因（ＭＴＳ１）的方法。方法：利用改良的ＤＮＡ制备方法,成功的从甲醛固定、石蜡包埋组织中提取ＤＮＡ,同时用建立的多重聚合酶合链反应（ＰＣＲ）进行检测。结果：３０例石蜡包埋的正常组织与新鲜组织提取的ＤＮＡ经ＰＣＲ扩增后,电泳图谱都出现５３６ｂｐ和３１０ｂｐ,即结果相同。结论：轵要提取、纯化得当,石蜡包埋组织在分子生物学研究领域中将有重要应用价     

加热抗原修复对乳腺癌组织中内源性抗生物素蛋白结合物的影响及其对策

目的:探讨加热抗原修复对甲醛固定石蜡包埋乳腺癌组织中内源性抗生物素蛋白结合物(EABA)的影响,以及消除EABA对免疫组织化学染色干扰的对策。方法:采用微波加热抗原修复法,免疫组织化学SP染色法,蛋清液封闭法,抗生物素蛋白-生物素封闭法及Envision二步法对10例甲醛固定石蜡包埋乳腺癌标本内的EABA进行检测。结果:1经甲醛固定石蜡包埋的乳腺癌组织中的EABA被封闭;2加热抗原修复可造成EABA暴露,且EABA仅存在于细胞质中;3蛋清液封闭法及抗生物素蛋白-生物素封闭法可封闭暴露的EABA。采用非生物素检测系统也可消除EABA对正常免疫组化染色的干扰。结论:微波加热抗原修复可使甲醛固定石蜡包埋乳腺癌组织中的EABA重新暴露。因而对生物素-抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶检测系统的免疫组织化学染色造成干扰;暴露的EABA可通过蛋清液封闭法、抗生物素蛋白—生物素封闭法封闭,或采用非生物素检测系统,达到避免EABA对正常免疫组化染色干扰的目的。     

石蜡包埋组织的p16基因甲基化特异性PCR技术

目的以石蜡包埋组织为材料进行DNA甲基化特异性PCR(MSP)检测,研究其可行性.方法40例食管组织以中性福尔马林固定、包埋、脱蜡、DNA样品制备和亚硫酸盐修饰后进行PCR测定.2例MSP阳性的冰冻甲状腺组织以70%酒精、丙酮和中性福尔马林分别固定及石蜡包埋后,非甲基化引物PCR扩增,比较不同固定剂的MSP效果.结果石蜡包埋食管组织MSP检出率与文献报道的冰冻组织MSP检出率相同,三种常用方法固定的甲状腺组织均能获得理想的MSP效果.结论MSP通过选择合适的实验条件,可应用于石蜡包埋组织.     

石蜡包埋淋巴瘤组织线粒体DNA的提取及PCR扩增

目的:探讨从石蜡包埋组织标本获取线粒体DNA (mtDNA)并进行PCR扩增的有效方法。方法:选取27例石蜡包埋的淋巴瘤组织,分别使用二甲苯/乙醇和0.5% Tween-20进行脱蜡,改进裂解缓冲液的成分及浓度,酚/氯仿抽提以获取mtDNA并进行电泳和PCR分析。结果:0.5% Tween-20法获取mtDNA纯度及浓度含量明显高于二甲苯/乙醇法(P<0.01);二甲苯/乙醇法和0.5% Tween-20法获取的mtDNA PCR扩增成功率分别为11.1%和40.7%,两者差异有统计学意义(P<0.05)。结论:二甲苯/乙醇和0.5% Tween-20两种方法都可以扩增出mtDNA的目的片段,但0.5% Tween-20法操作简便,PCR扩增成功率高,不用接触二甲苯等有毒化学试剂,是一种较为理想的mtDNA提纯方法。     

不同固定液对大鼠肝脏组织石蜡切片质量的影响

目的 探讨不同固定液对大鼠肝脏组织石蜡切片HE染色效果.方法 应用SD大鼠肝脏组织分别在动物空腹和空腹条件下,选择三种常规的固定液：体积分数10％甲醛固定液、Bouin＇s固定液和改良Davidson＇s固定液,对肝脏组织进行固定、石蜡包埋、切片和HE染色,观察动物空腹与未空腹条件下组织固定对切片质量的影响,以及不同固定液对肝脏组织切片质量的影响.结果 在未空腹的条件下,肝脏组织结构显示不清晰,呈水样变性的形态改变;Bouin＇s固定液和改良Davidson＇s固定液固定的组织结构更清晰,但是切片色泽不如体积分数10％甲醛固定液的鲜亮.结论 大鼠是否处于空腹状态对肝脏组织结构影响很大,三种固定方法对大鼠肝脏组织切片质量影响差异不大.     

石蜡包埋制作猫眼球切片方法的改良

目的 探讨和改良石蜡包埋制作猫眼球切片方法.方法 取健康猫眼球10只,AFA(甲醛-乙醇-冰醋酸)固定液固定,乙醇梯度脱水,氯仿透明,石蜡包埋制作眼球切片,厚度7 μm,HE染色,观察并记录.结果 ①石蜡包埋的猫眼球不变形,外观无明显收缩,结构完整,可获得整个眼球;②HE染色切片观察,眼球壁各层结构清晰,角膜、角膜缘、巩膜静脉窦、睫状肌等组织结构完整,视网膜无明显剥离,层次清楚,各层细胞排列整齐、容易辨认.结论 采用此方法对猫眼球进行石蜡包埋,可获得较满意的眼球组织切片.     

鼻型NK/T细胞淋巴瘤病理诊断相关指标的意义

1 对象和方法 　　1.1 对象鼻型NK/T细胞淋巴瘤石蜡组织20例选自延安大学医学院和北京医科大学病理学系的外检档案及会诊材料,所有标本经40 g/L甲醛固定,石蜡包埋,HE染色及免疫组织化学染色,结合临床表现及组织病理形态特征,诊断为鼻型NK/T细胞淋巴瘤. 　　……     

用Chelex制备DNA模板扩增分析DIS80位点多态性

目的：了解广西汉族人群DIS80位点遗传多态性分布资料。方法：以Chelex制备DNA模板用PCR扩增结合PAG电泳及银染技术对150名汉族无关个体进行扩增分型。结果：检出21个等位基因,63个基因型,汉族人群杂合度,非父排除率,个体识别力及多态信息含量分别为0．873,0．770,0．973,0．879,基因型频率分布均符合Hardy-weinberg平衡,共调查3个家系符合孟德尔遗传定律。结论：广西汉族人群DIS80用Chelex制备DNA模板能快速,简便,可靠地进行PCR扩增分析。     

江苏汉族24个Y-STR基因座遗传多态性及遗传关系研究

目的:分析24个Y染色体短串联重复序列(STR)基因座在江苏汉族群体的基因多态性?基因频率和其他地域人群之间的遗传距离?方法:取2011~2012年来自江苏省的262份无血缘关系的汉族个体,对24个STR位点进行复合扩增,ABI 3130自动基因分析仪进行片段分析并进行基因分型?结果:共发现172个STR等位基因,其中DYS385b?DYS449基因座发现14种等位基因,单倍型共发现262个,单倍型多样性为0.999 9,统计10个群体遗传距离Rst矩阵,提示江苏人群更偏向于以天津(-0.001 8)?河南(-0.001 76)?山西(-0.001 6)为群体的中原人群,而与湖南(0.017 54)和辽宁(0.014 64)人群的遗传距离最远(P < 0.05)?结论:获得具有江苏汉族人群特征的遗传学和法医学客观基础数据,对建立具有江苏地区特点的Y-STR数据库有重要意义?     

河南省汉族人群肿瘤坏死因子α基因启动子区单核苷酸多态性

目的研究河南省汉族人群无关个体217例肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因启动子区的-238G/A、-308G/A、-850C/T、-863C/A共4个单核苷酸多态性(SNPs)位点的遗传多态性。方法采用限制性酶切片段长度多态性(RFLP),结合质量分数6%聚丙烯酰胺凝胶电泳-银染法对SNPs位点进行分型。结果选择的TNF基因上4个SNPs位点等位基因和基因型频率分布在河南省汉族人群均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律,各等位基因频率均大于5%,等位基因最小频率分布在5.8%～14.1%。4个SNPs位点共观察到21种组合基因型,杂合度为0.461。根据SHEsis软件推测出11种单体型,单体型多样性为0.608。结论河南省汉族人群TNF基因4个SNPs位点及其组成的单体型具有较高的多态性,在法医学实践中有一定的应用价值,同时为人类遗传学的研究提供基础资料。     

我国汉族正常人群内皮型一氧化氮合酶基因G894T突变的观察

目的 :探讨我国汉族人群内皮型一氧化氮合酶 (e NOS)基因 G894 T突变的分布特点。方法 :应用聚合酶链反应 -限制性片断长度多态性分析 ,研究了 10 8名我国汉族正常人群 e N OS基因 G894 T突变分布情况。结果 :我国汉族正常人群 e NOS基因 G894 T突变的 GG、GT、TT基因型频率分别为 0 .90 95、0 .0 883和 0 .0 0 2 1;与国外其他种族人群比较 ,我国汉族正常人群 GT+TT基因型频率低于日本人、英国白种人 (P均 <0 .0 5 )。结论 :我国汉族正常人群 e NOS基因 G894 T突变的基因型分布不同于国外其他种族 ,以 GG基因型分布频率较高 ,而 GT+TT基因型低于日本人和英国白种人。     

中国汉族人群21号染色体上3个STR位点的多态性分析

目的：分析中国汉族人群2l号染色体上3个短串联重复序列(slaort tanclem repeat，STR)的等位基因及基因型分布情况。方法：采用PCR扩增技术和聚丙烯酰胺凝胶电泳方法分析100名中国汉族人2l号染色体上D21S11、D21S1435、D21S2055位点的遗传多态性。结果：在中国汉族人群中，D21S11、D21S1435、D21S2055位点分别检出7、6和18个等位基因，18、17和56种基因型，杂合度分别为73％、82％和91％。结论：中国汉族人群中21号染色体的3个STR位点有较好的多态性，其基因型频率分布符合Harcly-Weinberg平衡。     

山东地区汉族人群9个STR基因座遗传多态性分析

目的研究山东地区汉族人群的ProfileplusTM9个STR基因座遗传多态性。方法调查山东地区汉族100个无关个体9个STR基因座的基因和基因型频率分布。采用多色荧光标记引物,复合扩增10个基因座,扩增产物进行GeneScan扫描,Genotype分型。建立山东地区汉族9个STR基因座的基因及基因型频率数据库。结果共检测出83种等位基因,其频率分布0.0050～0.4050;220种基因型,其频率分布0.0100～0.2100;平均杂合度(H)为0.7778,累计个体识别能力(DP)为0.9999,非父排除率(EPP)为0.9999,多态信息总量(PIC)为0.5823～0.8396。结论经χ2检验9个STR基因座的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。     

PCR-SSCP法检测人类补体第八成分C8A DNA多态性研究

目的建立一种检测人类补体C8ADNA多态性的新方法。方法C8A多态性的分子基础是C8A基因在第三外显子碱基发生了C→A的突变,通过特异性扩增C8A基因第三外显子,采用聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR—SSCP）方法结合DNA序列分析检测成都地区98份无血缘关系样本DNAC8A基因型．结果共发现3种基因型,CSA＊AA、CSA＊BB和CSA＊AB,观测到的基因型频率分布符合Hardy—Weinberg平街定律．结论PCR—SSCP检测CgA多态性快速、简便、可靠、成本低,适用于大样本的筛选,在群体遗传学及法医学实践中有较好的府用价信．     

河南汉族人群PentaD和PentaE基因座的遗传多态性

目的调查分析PentaD和PentaE 2个5核苷酸短串联重复序列遗传标记在河南汉族人群中的遗传多态性分布。方法酚氯仿法提取河南汉族群体155名无关个体血样本基因组DNA,PentaD和PentaE用PowerPlexTM16试剂盒进行扩增,AB13130xl全自动遗传分析仪检测聚合酶链反应产物。结果 PentaD和PentaE 2个基因座的等位基因及基因型频率在河南汉族群体中分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。PentaD基因座观察到9个等位基因和29个基因型;PentaE基因座观察到20个等位基因和82个基因型。PentaD、PentaE 2个基因座的杂合度、个体识别率、非父排除概率分别是0.845 2和0.916 1,0.943 0和0.984 0,0.685 0和0.828 0;累积非父排除概率和累积个体识别率分别是0.945 8和0.999 1。结论 PentaD和PentaE在河南汉族群体中具有较高的遗传多态性,在法医学个体识别中具有应用价值。     

汉族人深静脉血栓形成患者FV Leiden突变检测

目的 ;探讨汉族人FV基因 16 91位点多态分布情况及FVLeiden突变与深静脉血栓形成的关系。方法 :利用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性 (PCR RFLP)方法 ,检测 10 3例深静脉血栓形成 (DVT)患者与 10 6例正常对照的FVLeiden突变 ,并进行对比分析。结果 :2组FV基因第 16 91位点的基因型为G/G ,全部为野生型 ,未见突变类型。结论 :FVLeiden突变作为汉族人深静脉血栓形成的主要危险因素的可能性极小