CpG ODN对日本血吸虫感染小鼠Th1/Th2细胞因子表达水平的影响

目的　观察CpGODN对日本血吸虫感染小鼠后不同时期Th1/Th2细胞因子表达水平的影响 ,探讨CpGODN介导Th1/Th2免疫偏移对控制血吸虫虫卵肉芽肿的作用。方法　取小鼠感染后 4、8、12和 16周的脾淋巴细胞经CpGODN和N CpGODN处理后 ,培养 72h ,用ELISA双抗体夹心法测定培养上清中IFNγ和IL - 4表达水平的动态变化。结果　CpGODN能显著上调IFNγ的表达水平 ,下调IL - 4的表达水平 ,而N -CpGODN对IFNγ及IL - 4表达水平无显著影响。CpGODN处理后小鼠脾淋巴细胞Th2分化指数明显减小。结论　CpGODN可以调节Th1/Th2细胞因子的表达水平 ,显著上调Th1型细胞因子水平和下调Th2型细胞因子水平 ,介导小鼠Th1型细胞免疫优势应答 ,为控制日本血吸虫慢性肉芽肿病变提供了一种新途径。     

日本血吸虫不同免疫原对小鼠Th1/Th2免疫偏移的影响

目的　观察单、双性日本血吸虫感染小鼠后Th1/Th2细胞因子水平的动态变化 ,探讨日本血吸虫不同免疫原对Th1/Th2免疫偏移的影响及与虫卵肉芽肿形成的相关性。方法　用ELISA夹心法检测单、双性日本血吸虫感染小鼠及单性感染 8w双性再感染 0～ 12w ,小鼠脾淋巴细胞培养上清Th1细胞因子IL - 2、IFN -γ和Th2细胞因子IL - 4表达水平。结果　单性感染小鼠 6～ 12w在脾淋巴细胞培养上清中可测出一定量的IL - 2和IFN -γ ,但无明显动态变化 ,而IL - 4未能测出 ;双性感染小鼠IL - 2和IFN -γ在感染后 4～ 6w开始上升 ,8w达高峰 ,随后下降 ,IL - 4则在感染后 8w时迅速上升且随着感染时间延长而明显升高 ,单性感染 8w双性再感染 4w时 ,小鼠脾淋巴细胞培养上清IL - 2、IFN -γ和IL - 4表达水平即迅速升高且在双性再感染 8～ 12w逐渐增强。结论　日本血吸虫不同免疫原对Th1/Th2免疫偏移的影响作用不同 ,Th1优势应答可能主要由虫体抗原诱导 ,Th2优势应答可能主要由虫卵抗原 (SEA)所诱导 ,后者是诱导宿主产生免疫病理反应的主要因素     

细胞信号转导抑制剂对日本血吸虫感染小鼠Th1/Th2免疫偏移的调控

目的　观察酪氨酸蛋白激酶 (TPK)、蛋白激酶 C(PKC)和磷酯酰肌醇 - 3-激酶 (PI- 3K)特异性抑制剂(Tyrphostin- 2 5、D- sphingosine和 Wortmannin)分别特异性抑制 TPK、PKC和 PI- 3K后 ,对小鼠脾 CD4 + T淋巴细胞经虫卵可溶性抗原 (SEA)诱生 IFN- γ和 IL- 4的表达水平及对 Th1/Th2免疫偏移的影响。　方法　分别于小鼠感染日本血吸虫后 0、4、8和 12周 ,用单克隆抗体分离脾 CD4 + T淋巴细胞体外培养 ,并进行细胞信号转导抑制试验 ,用 EL ISA夹心法和硝酸还原酶法分别测定小鼠脾 CD4 + T淋巴细胞体外培养上清 IFN-γ、IL - 4和一氧化氮 (NO)表达水平。　结果　Tyrphostin- 2 5对 IFN-γ和 IL - 4水平的抑制作用均非常显著 (P<0 .0 1) ,D- sphingosine主要影响 IL - 4的表达 (P<0 .0 1) ,而 Wortmannin则主要影响 IFN-γ的表达 (P<0 .0 1) ,对反映 Th1/Th2免疫平衡的 Th2分化指数分析表明 ,D-sphingosine可使 Th2免疫应答优势减弱 ,而 Wortmannin则可使 Th2免疫应答优势增强。对脾 CD4 + T淋巴细胞培养上清 NO水平检测结果显示 ,NO水平动态与 IFN-γ相一致 ,NO水平主要受 TPK抑制剂 Tyrphostin- 2 5和 PI- 3K抑制剂Wortmaninn的影响 ,结合该两种信号分子抑制剂对 Th1/Th2细胞因子表达水平的作用结果分析 ,     

NO介导Th1/Th2免疫偏移与日本血吸虫感染小鼠肝肉芽肿病变的作用

目的　观察日本血吸虫感染小鼠肝肉芽肿病变与一氧化氮 (NO)、Th1/Th2细胞因子水平的动态变化 ,探讨NO介导Th1/Th2免疫偏移在血吸虫卵肉芽肿病变中的作用。方法　采用石蜡切片 ,HE染色后观察感染小鼠肉芽肿病变。用硝酸还原酶法和ELISA夹心法分别检测日本血吸虫感染小鼠 0～ 12周血清及脾CD+ 4 T淋巴细胞培养上清NO、IFNγ和IL - 4表达水平 ,并进行相关分析。结果　感染小鼠 0～ 12周血清和脾CD+ 4 T淋巴细胞培养上清NO表达水平与小鼠肝肉芽肿病变动态相一致 ,并呈显著正相关 ,与IFNγ表达水平呈显著正相关 ,而与IL - 4在小鼠感染慢性期 (12周 )呈显著负相关。结论　NO在日本血吸虫感染小鼠肝肉芽肿病变过程中可能是一种与Th1/Th2细胞因子具有同样重要作用的调节因子 ,并可能是通过调节Th1/Th2细胞因子而发挥作用的 ,通过调控NO合成介导Th1/Th2免疫偏移可能是控制血吸虫卵肉芽肿病变的新途径     

细胞信号转导抑制剂介导Th1/Th2免疫偏移对血吸虫虫卵肉芽肿的影响

目的 观察酪氨酸蛋白激酶(TPK)、蛋白激酶C(PKC)和磷酯酰肌醇-3-激酶(P13-K)特异性抑制剂(分别为tyrphostin-25、D-sphingosine和wortmannin)对日本血吸虫感染小鼠虫卵肉芽肿病变的影响,并探讨其作用机制。 方法 于小鼠感染日本血吸虫后第35天起,经尾静脉分别注射3种信号转导分子抑制剂,连续5 d。在小鼠感染后6和8wk,观察小鼠肝肉芽肿病变,并用ELISA夹心法和硝酸还原酶法分别测定小鼠血清IFN-γ、IL-4和一氧化氮(NO)水平。结果 感染小鼠应用TPK和PKC抑制剂后均可显著抑制肝肉芽肿病变,PKC抑制剂可使肉芽肿减少率达56.2％～63.4％(P<0.01)。PKC抑制剂主要抑制Th2细胞因子IL-4的表达,其抑制率为34.1％和65.6％(P<0.01),而对NO水平的检测结果进一步证明了PKC抑制剂对IL-4表达的抑制作用。 结论 在日本血吸虫感染早期应用PKC抑制剂干预T淋巴细胞信号转导可显著抑制小鼠肝肉芽肿病变,其机制可能是由于抑制了Th2优势应答并介导Th2向Th1免疫反应偏移。     

NO介导Th1／Th2免疫偏移与日本血吸虫感染小鼠肝肉芽肝病变的作用

目的：观察日本血吸虫感染小鼠肝肉芽肿病变为一氧化氮（NO）、Th1/Th2细胞因子水平的动态变化，探讨NO介导Th1/Th2免疫偏移在血吸虫卵肉芽肿病变中的作用。方法：采用石蜡切片，HE染色后观察感染小鼠肉芽肿病变。用硝酸还原酶法和ELISA夹心法分别检测日本血吸虫感染小鼠0－12周血清及脾CD4^ T淋巴细胞培养上清NO、IFNγ和IL－4表达水平，并进行相关分析。结果：感染小鼠0－12周血清和脾CD4^ T淋巴细胞培养上清NO表达水平与小鼠肝肉芽肿病变动态相一致，并呈显著正相关，与IFNγ表达水平呈显著正相关，而与IL－4在小鼠感染慢性期（12周）呈显著负相关。结论：NO在日本血吸虫感染小鼠肝肉芽肿病变过程中可能是一种与Th1/Th2细胞因子具有同样重要作用的调节因子，并可能是通过调节Th1/Th2细胞因子而发挥作用的，通过调控NO合成介导Th1/Th2免疫偏移可能是控制血吸虫卵肉芽肿病变的新途径。     

TIGIT信号在日本血吸虫感染小鼠Th1/Th2 反应平衡中的作用研究

目的 研究TIGIT信号在日本血吸虫感染过程中Th1/Th2反应平衡中的作用。方法 C57BL/6小鼠感染日本血吸虫尾蚴,并以未感染小鼠作为正常对照。感染0、3、5、8、13周时取小鼠脾脏,采用流式细胞术检测小鼠脾脏淋巴细胞中TIGIT阳性细胞比例,以及TIGIT阴性和TIGIT阳性细胞上Ki67、IFN?γ、IL?4表达水平。结果 日本血吸虫感染组小鼠脾脏中TIGIT+细胞占CD4+ T细胞的比例显著高于正常对照组（29.30%±0.70% vs. 3.09%±0.50%;t = 29.09,P < 0.01）,但感染组和对照组小鼠脾脏中TIGIT+细胞占CD8+ T细胞的比例差异无统计学意义（3.61%±0.26% vs. 3.58%±0.16%;t = 0.108,P > 0.05）,且感染组和对照组小鼠脾脏中TIGIT+细胞占非T细胞的比例差异亦无统计学意义（1.86%±0.19% vs. 1.37%±0.17%;t = 1.931,P > 0.05）。进一步分析发现,Ki67在TIGIT+细胞上的表达比例（17.03%±0.64%）较其在TIGIT?细胞上表达的比例（6.59%±0.37%）显著升高（t = 14.09,P < 0.01）,而CD4+ TIGIT+细胞中Th2/Th1比值显著高于CD4+ TIGIT?细胞（39.28%±3.75% vs. 11.79%±1.64%;t = 6.721,P < 0.01）。结论 感染日本血吸虫后,CD4+ T细胞上TIGIT表达增加,且可能通过诱导Th2细胞增殖进而促进Th2细胞比例增加。     

血吸虫感染致Th1/Th2效应选择及其抗感染作用的分子机制

血吸虫感染导致宿主体内CD4 + T细胞的高度极化反应 ,产生优势的Th1或Th2功能亚群 ,分泌不同的细胞因子 ,分别介导细胞免疫和体液免疫 ,在宿主的抗感染保护性免疫中发挥重要作用 ,这对血吸虫疫苗的研制具有重要的指导意义。而血吸虫感染动物模型为Th1和Th2极化的免疫效应研究提供了特异而有效的研究工具。     

日本血吸虫感染小鼠CD_4~+ T淋巴细胞协同刺激分子表达谱及其在介导Th1/Th2极化中的作用

目的观察日本血吸虫感染小鼠不同病期体内及体外培养后脾CD4+T淋巴细胞表面的协同刺激分子表达谱,探讨协同刺激分子介导Th1/Th2极化的作用。方法收集血吸虫感染后4w、7w、12w、16w和20w小鼠及正常小鼠脾CD4+T淋巴细胞,以及上述不同病期经SEA诱导72h后脾淋巴细胞培养上清,用流式细胞术检测细胞表面协同刺激分子CD80、CD86、ICOS、CD40、OX40、4-1BB及PD1表达水平,用ELISA法检测培养上清中的Th1细胞因子IFN-γ,Th2细胞因子IL-4、IL-5、IL-10、IL-13。结果血吸虫感染后小鼠脾CD4+T淋巴细胞表面CD86、ICOS、CD40和OX40的表达均随感染时间延长而上调,其中ICOS和CD86表达上调最为显著;经SEA诱导培养72h后CD86、ICOS亦显著上调表达;培养上清检测发现IFN-γ在4w时呈高表达,7w开始随感染时间延长呈下调表达;IL-4、IL-5、IL-10和IL-13的表达水平则从7w开始明显升高,IL-5的峰值出现在12w,其余均16w达高峰,致20w仍维持在较高水平。结论日本血吸虫感染小鼠CD4+T淋巴细胞协同刺激分子表达水平与Th1/Th2免疫偏移密切相关,其中ICOS、CD86在介导Th2极化中可能具有重要作用。     

TARC和MDC在日本血吸虫感染小鼠Th2应答及肝纤维化中的作用

目的 探讨胸腺活化调节趋化因子(thymus activation regulated chemokine,TARC)和巨噬细胞来源的趋化因子(macrophage-derived chemokine,MDC)对日本血吸虫感染宿主Th2应答及肝脏纤维化的影响.方法 建立日本血吸虫感染小鼠模型,取肠系膜淋巴结及肝脏,胞内细胞因子染色法和ELISA法检测Th2应答;实时荧光定量RT-PCR法检测TARC和MDC的mRNA表达;通过测定肝脏羟脯氨酸含量以反映其纤维化水平.结果 宿主肝脏Th2应答趋势与肠系膜淋巴结一致,但感染7周时肝脏局部浸润T细胞中IL-13+Th2约为5.3％,高于肠系膜淋巴结T细胞中IL-13+Th2水平(3％);肝脏羟脯氨酸含量在感染第5、7、10周分别为2.9μg/mg、5.1μg/mg和8.3μg/mg,随感染进程呈进行性加剧.感染第7周时宿主肠系膜淋巴结中的TARC和MDC的表达分别为对照组的0.5倍和0.4倍,而此时宿主肝脏中TARC和MDC的表达则显著增高,分别为对照组的12.8倍和8.2倍,并且在感染进入慢性期时仍维持较高水平,分别为对照组的3.8倍和4.4倍.结论 血吸虫感染刺激宿主肝脏产生Th2类趋化因子TARC和MDC,促进Th2从外周淋巴器官向肝脏局部募集从而参与肝脏病理变化.     

慢性日本血吸虫感染C57BL／6小鼠体内Th1／Th2细胞凋亡的检测

目的 观察日本血吸虫感染晚期C57BL／6小鼠体内Th1、Th2细胞凋亡水平的变化。方法运用流式细胞技术，采用表面分子、胞内因子同时染色的三色标记和间接标记的方法，对日本血吸虫感染13周的C57BL／6小鼠脾脏、淋巴结中的Th1、Th2细胞的凋亡水平进行观察。结果日本血吸虫感染晚期C57BL／6小鼠与正常小鼠相比，Th1、Th2细胞凋亡均显著增加，但Th1细胞凋亡较多而Th2细胞凋亡较少。此阶段Th1细胞凋亡比Th2细胞更加易感。结论Th1、Th2细胞凋亡易感性的不同可能是导致血吸虫感染晚期Th2极化的原因之一，此为血吸虫感染过程中Th极化研究提供了新的证据。     

重组日本血吸虫铁蛋白的表达纯化及诱导小鼠保护性免疫研究

目的　表达、纯化重组日本血吸虫铁蛋白 ,观察其免疫小鼠后抗日本血吸虫的免疫保护作用。方法　用基因重组技术 ,将日本血吸虫铁蛋白基因亚克隆至表达载体 pGMC上 ;在IPTG诱导下 ,重组日本血吸虫铁蛋白得到高效表达 ;用电泳层析法分离纯化日本血吸虫铁蛋白 ;用SDS -PAGE和Western -blot鉴定表达纯化产物 ;用纯化的重组铁蛋白免疫小鼠三次 ,分别在 0、2、4周进行。第 6周每鼠经腹部感染 4 0± 1条日本血吸虫尾蚴。 4 2天后剖杀冲虫 ,计数虫数及肝卵数。结果　纯化的重组铁蛋白分子量为 4 0kD ,具有较好的免疫原性 ,能被日本血吸虫感染兔血清识别。与对照组相比 ,纯化重组铁蛋白免疫小鼠组的减虫率为 2 4 5 % ,减卵率为 4 5 8%。结论　重组日本血吸虫铁蛋白不仅在大肠杆菌中得到高效表达 ,而且纯化的铁蛋白分子能诱导抗日本血吸虫病的保护性免疫。     

日本血吸虫22.6kDa膜相关蛋白Th1型表位的免疫学鉴定

目的鉴定日本血吸虫22.6 kDa膜蛋白（Sj22.6）的Th1型表位,为构建短肽疫苗奠定基础。方法采用合成肽Sj22.6-P4、无关肽（对照）及PBS免疫C57BL/6小鼠2次（间隔7 d）,末次免疫后7～10 d取脾分离单个核细胞,用合成肽Sj22.6-P4、无关肽及PBS刺激培养,3H-TdR掺入法检测淋巴细胞的增殖效果,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测其细胞培养上清中IFNγ-、IL-4及IL-2水平。运用流式细胞技术三色标记法检测经合成肽Sj22.6-P4、无关肽及PBS免疫2次的C57BL/6小鼠脾淋巴细胞内的Th1、Th2细胞因子。结果合成肽Sj22.6-P4可刺激经该抗原肽免疫2次的C57BL/6小鼠淋巴细胞增殖,与PBS组相比,增殖指数（SI）均〉2。与无关肽对照组相比,细胞培养上清中IL-2、IFN-γ分泌水平增高,其中IL-2分泌水平差异有统计学意义（P〈0.05）,IFN-γ差异无统计学意义（P〉0.05）,而IL-4分泌水平明显降低（P〈0.05）。合成肽Sj22.6-P4免疫组小鼠脾脏CD4＋T细胞中分泌IFN-γ细胞的百分比显著增高,分泌IL-4细胞的百分比显著降低（P均〈0.05）。结论合成肽Sj22.6-P4是C57BL/6小鼠特异的Th1型表位。     

Characterization of murine Th1 clones specific to egg antigen of Schistosoma japonicum and their interaction with cytokines

T cell clones (B1, B21, B7, A25) specific to the soluble egg antigen (SEA) of Schistosoma japonicum were established from C3H/He mice immunized with SEA. These clones belonged to CD3+, CD4+ and CD8-Th1 cells, showing TCR-gamma delta-, TCR-alpha beta+ and Vbeta10b+. The molecular weights of target antigens recognized by the clones ranged from 51 to 80 kDa. Interleukin-2 (IL-2) and IL-12 could vigorously increase the proliferation response of the T clones to SEA; while IL-10 and transforming growth factor-beta1 (TGF-beta1) strongly inhibited the response. IL-12 activity was detected in the culture supernatant of T clones stimulated with SEA in the presence of APC (antigen presenting cells). This stimulation also upregulated the expression of the IL-12 receptor on the T clones. IL-12 from APC served as a costimulatory factor for the SEA induced proliferation of the T clone cells. Clone B1 was able to induce granuloma formation both in vivo and in vitro. These data provide further insight into the complicated interaction among SEA, T cell and cytokine at a clonal level in S. japonicum infection.     

日本血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗免疫小鼠保护力的观察

目的探讨日本血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗免疫鼠后对尾蚴攻击感染的保护作用。方法采用10^6和10^8CFU疫苗皮下接种免疫BALB／C鼠，免疫后8周用日本血吸虫尾蚴进行攻击感染，感染后6周剖杀小鼠，计算减虫率和减卵率，观察肝脏病理变化，测量虫卵肉芽肿周长和面积，测定血清中CAg、IgG及其亚类水平，同时设有PBS和BCG对照。结果疫苗接种组的减虫率为16．64％-46．20％，减卵率为55．75％-60．50％，肝组织病变明显减轻，虫卵肉芽肿的平均周长和平均面积显著减少，血清IgG和IgG2a水平明显升高，10^8CFU组CAg升高。结论日本血吸虫重组BCG-Sj26GST疫苗是一种新型比较理想的疫苗，值得进一步深入研究。