人端粒酶反转录酶对人胚胎皮质神经元损伤的保护**

背景：端粒酶可维持端粒长度，避免细胞复制性衰老和凋亡，其催化亚基端粒酶反转录酶还具有抗凋亡和调节细胞生存的作用。目的：观察人端粒酶反转录酶对β淀粉样蛋白1-40引起的人胚胎皮质神经元损伤的影响。方法：分离和培养12-16周龄人胚胎皮质神经元，将人端粒酶反转录酶基因重组腺病毒转染至神经元。免疫细胞化学法检测人端粒酶反转录酶基的表达，端粒重复序列扩增酶联免疫吸附法检测端粒酶活性。转染后第3天，给予10μmol/L β淀粉样蛋白1-40作用24 h 后，应用 MTT 检测细胞活力。荧光探针2’7’-二乙酰二氯荧光素标记检测细胞内活性氧水平，比色法测定细胞匀浆中谷胱甘肽含量。结果与结论：转染后第3天，人端粒酶反转录酶的表达最高，并重建了其端粒酶活性；10μmol/L β淀粉样蛋白1-40显著降低神经元的细胞活力和谷胱甘肽的含量(P <0.05和 P <0.01)，升高活性氧水平(P <0.05)。转染了人端粒酶反转录酶基因的神经元能显著对抗β淀粉样蛋白1-40的毒性作用，增加细胞的活力和谷胱甘肽含量(P <0.05和 P <0.01)，降低活性氧水平(P <0.05)。结果表明，人端粒酶反转录酶对β淀粉样蛋白1-40引起的人胚胎皮质神经元的损伤有明显保护作用。     

淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞凋亡与奥氮平的保护作用

背景：在阿尔茨海默病中起着重要作用的淀粉样β蛋白能够诱导细胞凋亡。目的：探讨奥氮平对淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞凋亡的机制及其保护作用。单位：解放军总医院南楼神经科。设计：随机设计。材料：实验于2002-05／2003-03在加拿大萨斯卡彻温大学医学院神经精神研究所完成。方法：P12细胞在RPMI1640培养液中培养。在96孔板每孔中接种100μL细胞悬液，在胶原被覆的25cm^2培养瓶中接种5mL细胞悬液，培养24h后，分别加50μmol／L、100μmol／L奥氮平培养24h，再加不同浓度的淀粉样β蛋白25～35（0．01μmol／L．2μmol／L、20μmol／L）培养24h。将收获好的96孔板以淀粉样β蛋白25～35诱导PC12细胞凋亡，采用MTT比色分析测定细胞存活率。收获25cm^2培养瓶中的PC12细胞，应用Western blot检测奥氮平对PC12细胞Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响。主要观察指标：细胞存活率的测定，PC12细胞中Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达水平。结果：①细胞存活率比较：淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞的细胞活性从75％降低到35％；50μmol／L、100μmol／L奥氮平预处理组PC12细胞的活性明显提高。②奥氮平对淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞凋亡中Bax表达的影响：0．01μmol／L，2μmol／L,20μmol／L淀粉样β蛋白25～35处理的PC12细胞Bax的表达增加，50μmol／L奥氮平预处理使淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞Bax的表达减低。③奥氮平对Aβ25～35诱导的PC12细胞凋亡中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响：0．001μmol／L、0．01μmol／L淀粉样β蛋白处理的PC12无变化，50μmol／L奥氮平预处理对PC12细胞表达亦无影响；2μmol／L、20μmol／L淀粉样β蛋白25～35处理的PC12细胞表达增高，50μmol／L奥氮平预处理能抑制其表达升高。结论：①淀粉样β蛋白25～35能够诱发与细胞凋亡密切相关的Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3在培养的PC12细胞中高表达。②奥氮平具有降低其表达，提高PC12细胞存活的保护作用。     

右美托米啶对β-淀粉样肽引起的SH-SY5Y细胞凋亡的影响

目的:探讨右美托米啶(dexmedetomidine,Dex)对β-淀粉样肽(amyloid-βpeptide,Aβ)引起的SH-SY5Y细胞(神经母细胞瘤细胞)凋亡的影响作用。方法:体外培养SH-SY5Y细胞,随机分为4组:阴性对照组,不同浓度Aβ25-35组(2.5、5.0、10.0μmol/L组),观察不同浓度的Aβ25-35对SH-SY5Y细胞的作用。同时进一步观察Dex与Aβ联合应用对SH-SY5Y细胞的作用,实验随机分为5组:阴性对照组,Aβ组(10.0μmol/L Aβ25-35),Aβ+Dex 0.1组(10.0μmol/L Aβ25-35+0.1μmol/L Dex),Aβ+Dex 1.0组(10.0μmol/L Aβ25-35+1.0μmol/LDex)和Aβ+Dex 10.0组(10.0μmol/L Aβ25-35+10.0μmol/L Dex),分别处理24 h后,采用DAPI荧光染色法计数凋亡细胞数,计算凋亡率。结果:Aβ25-35可以促进SH-SY5Y细胞的凋亡,且呈时间和浓度依赖性;而在Aβ25-35中同时加入Dex作用后,细胞凋亡明显受到抑制,细胞凋亡率明显下降(P<0.05),但仍明显高于阴性对照组。结论:Dex可以有效的抑制Aβ25-35引起的SH-SY5Y细胞的凋亡。     

淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞凋亡与奥氮平的保护作用

背景:在阿尔茨海默病中起着重要作用的淀粉样β蛋白能够诱导细胞凋亡。目的:探讨奥氮平对淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞凋亡的机制及其保护作用。单位:解放军总医院南楼神经科。设计:随机设计。材料:实验于2002-05/2003-03在加拿大萨斯卡彻温大学医学院神经精神研究所完成。方法:P12细胞在RPMI1640培养液中培养。在96孔板每孔中接种100μL细胞悬液,在胶原被覆的25cm2培养瓶中接种5mL细胞悬液,培养24h后,分别加50μmol/L、100μmol/L奥氮平培养24h,再加不同浓度的淀粉样β蛋白25～35(0.01μmol/L、2μmol/L、20μmol/L)培养24h。将收获好的96孔板以淀粉样β蛋白25～35诱导PC12细胞凋亡,采用MTT比色分析测定细胞存活率。收获25cm2培养瓶中的PC12细胞,应用Westernblot检测奥氮平对PC12细胞Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响。主要观察指标:细胞存活率的测定,PC12细胞中Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达水平。结果:①细胞存活率比较:淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞的细胞活性从75%降低到35%;50μmol/L、100μmol/L奥氮平预处理组PC12细胞的活性明显提高。②奥氮平对淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞凋亡中Bax表达的影响:0.01μmol/L,2μmol/L,20μmol/L淀粉样β蛋白25～35处理的PC12细胞Bax的表达增加,50μmol/L奥氮平预处理使淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞Bax的表达减低。③奥氮平对Aβ25～35诱导的PC12细胞凋亡中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响:0.001μmol/L、0.01μmol/L淀粉样β蛋白处理的PC12无变化,50μmol/L奥氮平预处理对PC12细胞表达亦无影响;2μmol/L、20μmol/L淀粉样β蛋白25～35处理的PC12细胞表达增高,50μmol/L奥氮平预处理能抑制其表达升高。结论:①淀粉样β蛋白25～35能够诱发与细胞凋亡密切相关的Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3在培养的PC12细胞中高表达。②奥氮平具有降低其表达,提高PC12细胞存活的保护作用。     

人端粒酶核糖核酸反义寡核苷酸可增强顺铂诱导原代白血病细胞凋亡的作用

目的:探讨人端粒酶核糖核酸(human telomerase ribonucleic acid,hTR)反义寡核苷酸(an-tisense oligodeoxynucleotides,ASODN)对顺铂诱导原代白血病细胞凋亡的影响.方法:采用与hTR模板互补的硫代ASODN处理原代白血病细胞,采用端粒酶重复扩增分析-聚合酶链反应-酶联免疫分析法检测端粒酶活性的变化;采用苔盼蓝拒染法观察经hTR ASODN处理的原代白血病细胞对顺铂的反应:采用An-nexin V与碘化丙啶双染色观察凋亡细胞形态及用流式细胞仪检测凋亡细胞率.结果:经hTR ASODN作用后,原代白血病细胞端粒酶活性明显下降.ASODN作用24小时,再加入顺铂作用48小时,明显抑制原代白血病细胞,并使原代白血病细胞凋亡明显增加.ASODN作用24小时后再加入5 μmol/L顺铂作用72小时的原代白血病细胞凋亡率为(41±9)%,分别高于正义寡核苷酸加顺铂组[(15±5)%]及单用顺铂组[(13±3)%],差异有统计学意义(均为P＜0.01).结论:hTR ASODN可明显抑制原代白血病细胞端粒酶活性,并增强顺铂诱导原代白血病细胞的凋亡,人端粒酶有可能成为白血病基因治疗的新靶点.     

人胚胎脑组织蛋白提取物诱导人胎盘间充质干细胞向神经细胞的分化

背景：选择合适的诱导方法诱导人胎盘间充质干细胞分化为神经元样细胞是临床治疗神经损伤的关键。目的：在人胎盘间充质干细胞中加入商品化的人胚胎脑组织蛋白提取物,观察其诱导分化为神经元样细胞的可行性。方法：采用酶消化法分离培养人胎盘间充质干细胞,传至第3代,将人早期胚胎脑组织蛋白提取物加入诱导培养基培养6 d,加入浓度为20 nmol/L全反式维甲酸和500μg/L音猬因子培养3 d,换新的培养液,包含体积分数为10%胎牛血清,10μg/L脑源性神经营养因子,20μg/L神经胶质细胞源性神经营养因子,50μg/L胰岛素样生长因子Ⅱ型继续培养3 d。结果与结论：胎盘组织经酶消化后获得贴壁细胞,传至第2代细胞形态为梭形,成漩涡样生长,传至第3代细胞形态较均一。诱导后细胞经免疫细胞化学法检测均表达神经元特异性烯醇化酶、巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白、神经丝蛋白、神经生长相关蛋白43;ELISA法检测细胞培养上清脑源性神经营养因子、神经营养因子3、神经营养因子4为阳性表达;RT-PCR检测细胞微管相关蛋白、神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白、神经生长相关蛋白43均为阳性表达。结果表明人胚胎脑组织蛋白提取物使人胎盘间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞。     

不同发育阶段人表皮干细胞端粒酶反转录酶表达的比较

目的:目前已知端粒酶活性的丧失及其增殖相关基因表达的改变是造成多种成体干细胞体外复制和扩增受限的主要原因,而端粒酶反转录酶对端粒酶活性起关键作用。体外分离培养人胚胎、少儿、成人3种不同皮肤来源的表皮干细胞,对比观察不同发育阶段端粒酶反转录酶表达的差异。方法:实验于2005-09/2007-04在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成。①对象:因创伤等原因致意外流产的妊娠24～26周龄胎儿皮肤标本,4～12周岁少儿及25～45岁成年人烧伤整形植皮手术剩余皮片标本,分别由南昌大学第一附属医院产科、烧伤科提供,产妇与烧伤患者对治疗及实验均知情同意,实验经医院医学伦理委员会批准。②实验方法:取胎儿、少儿和成年人的全层皮肤,用胰蛋白酶和EDTA联合消化法分离表皮,胶原快速贴附法纯化人表皮干细胞,用未黏附的角质细胞作为对照,以含表皮生长因子、角质细胞无血清培养液组成的表皮干细胞培养基进行体外培养。③实验评估:通过β_1整合素、角蛋白19、p63免疫细胞化学染色对培养细胞进行鉴定,计算克隆形成率。以免疫细胞化学染色法和图像定量分析法检测3种不同皮肤来源的表皮干细胞端粒酶反转录酶的表达差异。结果:①细胞生长特征:分离培养的人表皮干细胞呈明显克隆性生长,克隆形成率高于角质细胞对照组(P<0.05)。②表皮干细胞的鉴定:细胞克隆经免疫细胞化学染色后,β_1整合素、角蛋白19、p63均呈阳性表达。③端粒酶反转录酶免疫细胞化学染色及定量表达:不同皮肤来源的表皮干细胞端粒酶反转录酶均呈阳性,但表达强度不同,人胚胎>少儿>成人。3种皮肤来源的表皮干细胞平均吸光度值和阳性面积值均随年龄增加而逐渐降低,人胚胎>少儿>成人(P<0.05)。结论:人胚胎、少儿、成人皮肤来源的表皮干细胞均有端粒酶反转录酶表达,其表达强度依次减弱。提示诱导和增强端粒酶反转录酶的表达对维持表皮干细胞在体外自我更新和增殖能力可能具有重要意义。     

晚期糖基化终产物在β样淀粉蛋白25-35诱导PC12细胞氧化损伤中的作用

目的探讨晚期糖基化终产物(AGEs)在β样淀粉蛋白25-35(Aβ25-35)诱导PC12细胞氧化损伤中的作用。方法将实验对象分为五组:10、20、304、0μmol/L四种浓度的Aβ25-35干预组和正常对照组。采用MTT法测定细胞生存率,采用ELISA法测定AGEs的含量。结果Aβ25-35诱导PC12细胞,细胞生存率为50%时,Aβ25-35浓度约为30μmol/L;与正常对照组相比,30μmol/L Aβ25-35干预组细胞生存率明显降低(P<0.001)、细胞内AGEs含量明显升高(P<0.05)。结论AGEs参与了β样淀粉蛋白25-35诱导PC12细胞氧化损伤的过程。     

β-淀粉样蛋白诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化过程中Tau蛋白的过度磷酸化

背景：大多数学者认为β-淀粉样蛋白是阿尔茨海默病发病的始动因素,而Tau蛋白过度磷酸化可能是阿尔茨海默病最重要的分子病理变化之一。目的：观察β-淀粉样蛋白25~35对大鼠骨髓间充质干细胞分化的神经元样细胞Tau蛋白磷酸化的影响。方法：体外分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,将第4代骨髓间充质干细胞分为两组：实验组中加入预诱导培养基和20μmol/Lβ-淀粉样蛋白25~35,24h后用含2%二甲基亚砜和200μmol/L丁羟茴醚的DMEM诱导其向神经细胞分化,5h后收取细胞。对照组诱导方法同实验组,但在诱导过程中未加入β-淀粉样蛋白25~35。结果与结论：光镜下可见纺锤状的骨髓间充质干细胞诱导后出现长突起,呈现神经细胞样形态,但实验组突起数量和长度均少于对照组;免疫细胞化学法检测两组诱导后的神经元样细胞为神经元特异性烯醇化酶阳性;免疫蛋白印记法证明实验组的GSK-3β、Tau[pSer262]和Tau[pSer396]表达均显著高于对照组。结果提示β-淀粉样蛋白25~35能够通过GSK-3β途径诱导骨髓间充质干细胞分化的神经元样细胞Tau蛋白过度磷酸化。     

人胚胎神经干细胞分离、培养、纯化及增殖潜能的特点

目的：探讨获取和培养人胚胎神经干细胞的方法。方法：实验于2003-09／2004—12在重庆医科大学基础研究所完成。人胚胎来源为7-12周人工药物流产胎儿，由重庆医科大学附属第二医院及重庆市妇幼保健院提供，征得产妇本人同意。①从人胚胎大脑皮质中分离、培养、纯化原代神经干细胞，经体外反复传代培养以获得能在体外长期生存的神经干细胞。②免疫细胞化学鉴定神经干细胞特异性表达抗原。⑧观察不同种植细胞密度对神经干细胞增殖的影响，分析其生长特点并绘制生长曲线。④采用悬浮细胞培养法扩增细胞，冷冻复苏后观察细胞的生物学特性。结果：①人胚胎神经干细胞体外生长特点：从7～12周流产胎儿大脑皮质中获得了能在体外长期生存的神经干细胞。经体外传至15代，神经干细胞细胞数量扩增至200倍。②神经干细胞接种密度对增生的影响：当种植细胞的密度为1&;#215;10^5L^-1,1&;#215;10^7L^-1时，体外培养30d后仍呈单细胞贴壁状态。以1&;#215;10^9L^-1细胞密度接种时，12h后即见多个单细胞聚成的小球，悬浮生长。③神经干细胞自我更新能力的检测结果：多数单个细胞在培养后24～48h分裂为2-4个细胞的小克隆，7～10d均发展为上百个细胞的较大的克隆。④nestin抗原的表达：培养的神经干细胞神经球nestin免疫细胞染色均呈阳性。⑤神经干细胞多向分化能力检测：NSE和GFAP免疫细胞化学染色显示，被测细胞胞浆有棕黄色颗粒沉着，呈阳性表达。⑥神经干细胞复苏后的存活率：冻存1，4，8，12周的神经干细胞存活率基本相似[（80．2&;#177;1．8）％，（80．1&;#177;1．2）％，（79．9&;#177;0．8）％，（80．1&;#177;2．1）％，P〉0．05]。结论：成功地从人胚胎大脑皮质中分离得到了神经干细胞。经体外培养证明：人胚胎神经干细胞具有自我更新增殖能力和向神经元样细胞、星形胶质样细胞分化的潜能。     

构建人端粒酶反转录酶基因腺相关病毒2载体在人髓核细胞的表达

背景：动物研究显示,自体髓核细胞移植能有效修复椎间盘退变。然而髓核细胞体外增殖能力差,这就限制了其作为种子细胞在椎间盘退变性疾病治疗中的研究及应用。 目的：构建包含外源性人端粒酶反转录酶基因的腺相关病毒2载体,观察其转染人髓核细胞后人端粒酶反转录酶基因的表达。 方法：构建pSNAV2.0-pRSV-hTERT质粒并鉴定,采用AAVMaxTM包装系统进行重组腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体的构建,以 PCR 及酶切方法验证构建的质粒,构建成功后扩增,并纯化。利用腺相关病毒2-增强型绿色荧光蛋白载体转染第1代人髓核细胞,测定最佳感染复数。参照此感染复数值,确定腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶对人髓核细胞转染的相关感染复数;对照组采用不含外源性人端粒酶反转录酶基因的腺相关病毒2进行转染。转染后1,2,4周分别采用RT-PCR对人端粒酶反转录酶基因mRNA水平进行半定量检测。 结果与结论：实验成功构建了腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体;并获得了滴度达2×1011 v·g/mL的腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体。测得腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体对人髓核细胞的最佳感染复数为5×104 v·g/cel。在以1×104,5×104,1×105 v·g/cel 转染人髓核后,均可检测到人端粒酶反转录酶基因mRNA的高量表达。采用RT-PCR半定量检测方法,发现以转染后2周时人端粒酶反转录酶 mRNA表达量相对最高（P 〈0.05）,4周时仍可见人端粒酶反转录酶基因mRNA的稳定表达。而对照组无论在何时间点均未能检测到人端粒酶反转录酶mRNA的表达。提示利用腺相关病毒2可以成功构建包含外源性人端粒酶反转录酶基因的病毒载体,腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶能有效转染人髓核细胞并稳定表达人端粒酶反转录酶基因mRNA,此结果可能为增强髓核细胞性能提供新的策略。     

高糖介导入牙周膜细胞凋亡中bcl-2、bax的作用及机制（英文）

背景：高糖环境下人牙周膜细胞会发生凋亡,其中bcl-2,bax是否启动？如何发挥作用？此方面尚未见有文献报道。目的：应用不同浓度葡萄糖影响人牙周膜细胞,观察细胞凋亡及bcl-2、bax基因表达的变化。方法：原代培养并鉴定人牙周膜细胞,取5-8代细胞用于实验。采用5.5 mmol/L葡萄糖（生理对照组）和25 mmol/L葡萄糖（高糖组）作用细胞24 h和48 h;以Hoechst 33258免疫荧光染色观察人牙周膜细胞凋亡;以Real-time PCR检测bcl-2、bax表达。结果与结论：25 mmol/L葡萄糖促进人牙周膜细胞凋亡,bcl-2、bax表达显著高于对照组（P〈0.05）;bcl-2/bax比值显著低于对照组（P〈0.05）。结果说明高糖可增加人牙周膜细胞凋亡,Bcl-2家族发挥了重要作用。     

人端粒酶反转录酶936-1132氨基真核表达载体的构建及在293T细胞中表达

背景:人端粒酶反转录酶是端粒酶的重要组成之一,可使端粒酶表现活性从而拮抗端粒缩短或细胞衰老。目的:构建人端粒酶反转录酶C端936-1132氨基真核表达载体,并在人胚肾细胞293T表达,为其在细胞内定位研究奠定基础。方法:以人端粒酶反转录酶cDNA为模板,PCR扩增出带有酶切位点其C端936-1132氨基序列片段,并与真核表达载体pcDNA3.1-HisA连接,构建出重组质粒pcDNA3.1-HisA-hTERT aa936-1132,将重组质粒转染入人胚肾细胞293T中,使蛋白表达,并对蛋白进行免疫印迹鉴定。结果与结论:经双酶切和基因测序等方法证实,人端粒酶反转录酶C端936-1132氨基重组质粒pcDNA3.1-HisA-hTERT aa936-1132构建成功,经免疫印迹鉴定可检出融合蛋白。     

人端粒酶反转录酶重组绿色荧光表达载体转染椎间盘正常髓核细胞

背景：椎间盘髓核细胞分离培养困难,老化较快,迫切需要一种标准细胞株用于实验研究。目的：探讨人端粒酶反转录酶重组绿色荧光表达载体的构建及其转染正常髓核细胞构建永生化细胞的可行性研究。方法：通过目的基因克隆、真核表达质粒中目的基因序列测定、目的基因真核表达质粒的构建、转染人端粒酶反转录酶表达检测等步骤进行实验。结果与结论：构建出人端粒酶反转录酶重组绿色荧光表达载体,成功转染正常髓核细胞并在细胞中稳定表达。结果表明运用人端粒酶反转录酶转染椎间盘髓核细胞构建永生化细胞是一种可行的方法。     

灯盏花素干预体外培养大鼠脑皮质神经元的存活与生长

背景：神经生长因子在维持中枢神经系统神经细胞的存活、分化,促进其生长、发育,维持其功能方面具有不可替代的作用。 目的：观察灯盏花素对SD大鼠大脑皮质体外培养神经元生长的影响,并初步探讨其机制。 方法：取新生SD大鼠胚胎,取其大脑皮质后,对神经元进行原代培养,随机分为3组,其中灯盏花素组加入10 g/L灯盏花素,对照组加入等量生理盐水,正常组不作任何处理,各组又分为24 h、48 h亚组。对24孔板中各组细胞各时间点采集图像,之后采用RT-PCR技术检测神经生长因子、酪氨酸激酶A mRNA的表达变化。对96孔板中各组细胞不同时间点采用MTT检测神经元生长活力。 结果与结论：正常组和对照组在各时间点细胞数、胞体面积、突起长度及细胞活力无明显差异（P〉0.05）,但正常组及对照组均有随时间点延长,3个指标均上调（P0.05）,灯盏花素组各时间点较正常组和对照组上调（P〈0.05）。提示灯盏花素促进SD大鼠脑源性神经元的存活、生长,其机制可能是通过上调神经生长因子及其受体TrkA的表达发挥作用。     

DNA去甲基化对大鼠骨髓间充质干细胞端粒酶反转录酶的调节

背景：DNA去甲基化是一种重要的表观遗传修饰,对肿瘤细胞的端粒酶具有重要调节作用,而对骨髓间充质干细胞端粒酶活性有何影响尚不清楚。目的：观察DNA去甲基化对骨髓间充质干细胞增殖及端粒酶反转录酶蛋白表达的影响。方法：全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞;按照下列分组加入5-杂氮胞苷,使各组5-杂氮胞苷终浓度分别为0,3,6,12,24μmol/L。加入5-杂氮胞苷后第1,2,3,5,7天进行指标检测。结果与结论：与对照组相比,5-杂氮胞苷干预24h,各浓度组均显著促进细胞增殖活性（P〈0.05）;干预48h,6,12,24μmol/L组显著促进细胞增殖活性（P〈0.05）;干预72h,12,24μmol/L组显著抑制细胞增殖活性（P〈0.05）;干预120,168h,对照组与各浓度组间差异均无显著性意义（P〉0.05）。5-杂氮胞苷干预48h,6,12,24μmol/L组端粒酶反转录酶蛋白IA值较对照组显著增加（P〈0.05）。提示在一定浓度范围及一定作用时间内,5-杂氮胞苷可以促进骨髓间充质干细胞增殖与端粒酶反转录酶蛋白的表达。     

脑微血管内皮细胞缺氧模型转化生长因子β1表达与脑溢安的干预

背景：临床及动物实验证实脑溢安能促进脑出血急性期血肿吸收及神经功能恢复,提高生活质量。目的：观察脑溢安血清对体外缺氧培养的大鼠脑微血管内皮细胞转化生长因子β1mRNA表达的影响。方法：用分离培养的大鼠脑微血管内皮细胞移入厌氧培养箱培养18h建立缺氧损伤模型,并随机分为正常组、模型组、正常血清组及含脑溢安血清组。正常组为同一批正常培养的脑微血管内皮细胞;模型组将正常培养的细胞放入厌氧培养箱内培养18h;正常血清对照组细胞在培养液中加5%正常血清后,放入厌氧培养箱中培养18h;脑溢安血清组细胞在培养液中加5%脑溢安血清后,放入厌氧培养箱内培养18h。结果与结论：缺氧培养使脑微血管内皮细胞存活数量减少,其表达的转化生长因子β1mRNA增强,而脑溢安血清能明显增加脑微血管内皮细胞存活数量,降低转化生长因子β1mRNA表达水平（P〈0.05）。说明脑溢安血清下调转化生长因子β1mRNA的表达可能是其抑制脑微血管内皮细胞的凋亡对缺氧损伤脑微血管内皮细胞的保护作用机制之一。     

人胚神经干细胞植入脑出血大鼠的存活和分化状态（英文）

背景：研究证实外源性神经干细胞能修复神经,促进脑出血后神经功能障碍的恢复。然而,脑出血后局部内环境对移植神经干细胞存活分化的影响是一个复杂多变的过程。目的：观察人胚神经干细胞植入脑出血大鼠脑内的存活和分化状态。设计、时间及地点：免疫组织化学水平的开放性实验,于2007-05/2008-04在泸州医学院附属医院分子生物实验室完成。材料：纳入40只SD雌性大鼠,由中国医学科学院实验动物研究所提供;8周龄流产胚胎大脑由德阳市人民医院医院妇产科提供。方法：取8周龄流产人胚胎大脑皮质细胞,体外培养获得人胚神经干细胞。通过注射自体动脉血到尾状核制作大鼠脑出血模型,出血后2d将标有5＇-溴脱氧尿嘧啶的人胚神经干细胞悬液移植到血肿腔周围的4点,1,2周后处死大鼠,相邻脑组织切片行5＇-溴脱氧尿嘧啶/微管相关蛋白2和5＇-溴脱氧尿嘧啶/胶质纤维酸性蛋白免疫组织化学双染。主要观察指标：应用免疫组织化学及免疫荧光染色方法观察移植入脑出血大鼠脑内的人胚神经干细胞存活、分化状态和迁徙情况。结果：5＇-溴脱氧尿嘧啶阳性细胞为椭圆形棕褐色,移植后1周及2周均可见其存活并向周围迁移,且移植后2周迁移的范围广。移植后1周,脑组织切片见5＇-溴脱氧尿嘧啶/微管相关蛋白2和5＇-溴脱氧尿嘧啶/胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞,且5＇-溴脱氧尿嘧啶/微管相关蛋白2双阳性细胞多于5＇-溴脱氧尿嘧啶/胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞。移植后2周,5＇-溴脱氧尿嘧啶阳性细胞数明显减少,在脉络丛和微血管中可见,且5＇-溴脱氧尿嘧啶/胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞多于5＇-溴脱氧尿嘧啶/微管相关蛋白2双阳性细胞。结论：人胚神经干细胞移植入脑出血大鼠脑内能够存活,移植后逐渐分化为神经细胞和星形胶质细胞。     

辛伐他汀抑制高糖诱导人脐静脉内皮细胞的凋亡

背景：他汀类药物对血管内皮细胞的凋亡是否有影响目前尚不明确。目的：探讨辛伐他汀对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响。方法：用DMEM细胞培养液培养人脐静脉内皮细胞,将细胞分成空白对照组、高糖组和高糖＋辛伐他汀组,用四甲基偶氮唑蓝比色法测定人脐静脉内皮细胞的存活率,流式细胞仪和Westernblot分别检测细胞早期凋亡率及P53蛋白表达。结果与结论：高糖组及高糖＋辛伐他汀组细胞增殖率较空白对照组明显降低（P〈0.01）,而高糖组细胞增殖率较高糖＋辛伐他汀组亦降低（P〈0.01）;高糖组P53蛋白表达量及凋亡率较空白对照组及高糖＋辛伐他汀组明显增加（P〈0.01）,高糖＋辛伐他汀组P53蛋白表达及凋亡率亦明显高于空白对照组（P〈0.01）。表明高糖可通过促进促凋亡蛋白P53的表达进而促进人脐静脉内皮细胞的凋亡,而辛伐他汀可抑制此作用。     

人端粒酶反转录酶小发夹RNA质粒表达载体的构建及鉴定

背景:端粒酶反转录酶是端粒酶的活性亚基,已成为肿瘤研究的热点。RNA干扰技术作为一种基因沉默方法,具有高效、特异等优点,现已广泛应用于肿瘤、病毒等研究领域。目的:构建针对人端粒酶反转录酶的小发夹RNA质粒表达载体,并观察其对乳腺癌T47D细胞人端粒酶反转录酶基因的表达和端粒酶活性的影响。方法:以Genbank中人端粒酶反转录酶基因的mRNA序列为基础,设计人端粒酶反转录酶基因的小干扰RNA序列,将其连接到具有G418抗性的质粒pBAsi-hU6-Neo(BamHⅠ/HindⅢ)中,应用基因测序加以验证,扩增提取质粒,以脂质体转染表达小发夹RNA的质粒到乳腺癌T47D细胞,抗生素G418筛选出转染成功的各组细胞。结果与结论:实验所构建的人端粒酶反转录酶的小发夹RNA质粒表达载体,经测序验证无误。将pBAsi-hU6-Neo重组质粒转染入T47D细胞,经G418筛选获得了转染成功的细胞。经RT-PCR和Western blot检测,转染后的人端粒酶反转录酶基因在mRNA和蛋白水平的表达均明显降低(P<0.01),经TRAP-ELISA法检测实验组细胞端粒酶活性出现显著下降(P<0.01)。结果证实,实验成功构建人端粒酶反转录酶的小发夹RNA质粒表达载体,实验所设计的小干扰RNA能有效抑制肿瘤细胞人端粒酶反转录酶基因的表达,进而降低细胞的端粒酶活性。