神经胶质细胞对小鼠骨髓血管内皮前体细胞迁移的作用

目的 探讨视网膜神经胶质细胞对小鼠骨髓血管内皮前体细胞(EPCs)迁移的作用及可能机制.方法 荧光免疫激活流式细胞仪分选获得小鼠骨髓血管内皮前体细胞,分别用神经胶质细胞或对照组成纤维细胞作为条件共培养细胞与EPCs细胞共培养24 h后,检测内皮前体细胞通过孔隙的迁移数量;并用ELISA法检测培养液内VEGF及SDF一1的含量.结果 CD34/VEGFR2双标阳性的细胞为富含骨髓血管内皮前体细胞的细胞群,约占全部骨髓细胞的0.2%;当EPCs神经胶质细胞共培养24h后,EPCs通过孔隙的数量显著高于对照组与成纤维细胞共培养时通过的数量(上层存留细胞(20±16)个、vs(170±55)个,P<0.01).与神经胶质细胞共培养系统细胞培养液中VEGF及SDF～1含量显著高于对照组[VEGF:(230.28±27.37)pg/mL vs(89.22±11.23)pg/mL,P<0.01;SDF-1:(328.34±57.42)pg/mL vs(62.44±34.35)pg/mL,P<0.01].结论 神经胶质细胞可能通过细胞因子的分泌作用增强EPCs的移行,在EPCs参与的新生血管形成中可能有重要的介导作用.     

神经前体细胞移植Aβ损伤大鼠海马后分化神经元的形态学观察

目的 观察小鼠胚胎干细胞来源的神经前体细胞移植Aβ损伤大鼠海马后新生神经元的分化情况.方法 将表达绿色荧光蛋白的小鼠胚胎干细胞采用无血清方法定向诱导为神经前体细胞,移植至Aβ1-40损伤的大鼠海马齿回,免疫荧光染色观察分化神经元的递质表型、受体表达以及与受者神经元的突触性接触.结果 小鼠胚胎干细胞来源的神经前体细胞移植后能长时间存活并分化为谷氨酸能、γ-氨基丁酸能神经元,表达NMDA受体和GABAA受体;发出类似神经元的长突起伸入到受者脑组织中去,并且在其胞膜和突起周围可观察到大量受者神经元来源的突触素阳性颗粒.结论 神经前体细胞移植Aβ损伤大鼠海马后能分化为不同类型的神经元,与受者神经元之间可能存在突触结构.     

少突胶质细胞前体细胞移植治疗中枢神经系统脱髓鞘疾病的研究进展

脱髓鞘疾病是一类以髓鞘脱失为主要特征的神经系统疾病.脱髓鞘疾病可严重影响患者生活质量,并且目前鲜有令人满意的治疗方法.少突胶质细胞前体细胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)是存在于中枢神经系统(central nervous system,CNS)中,具有迁移、增殖及分化为成熟少突胶质细胞(oligodendrocytes,OLs)能力的前体细胞.OLs是CNS中的成髓鞘细胞,因此OPCs与CNS中髓鞘的发生和损伤后再生都密切相关.近些年对OPCs发育和分化分子基础研究的深入直接推动了利用多能干细胞定向分化以及体细胞谱系重编程等手段获得OPCs的进步,使OPCs移植成为可能治疗CNS脱髓鞘疾病的新方法.本文对近些年的相关研究进行了综述.     

人类神经前体细胞大鼠胎脑内移植研究

目的探讨人类神经前体细胞大鼠胎脑侧脑室内移植后的移行和分布。方法采用机械方法从胎脑中分离神经细胞,应用N2培养基进行培养,细胞用携带LacZ基因的腺病毒或BrdU标记,移植到孕期为16~18d的胎鼠侧脑室内,检查出生后不同时期脑组织中移植细胞的分布和移行。结果成功培养出人类的神经干细胞,细胞聚集形成神经球,呈悬浮状态,大部分细胞表达神经前体细胞的标志物巢蛋白,这种细胞能够分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞。神经干细胞在体内和体外可以稳定表达外源性基因,移植到胎鼠脑内,人类胚胎神经前体细胞广泛移行并分布于宿主的脑组织中,结合到大鼠的前脑、中脑和后脑,形成广泛的嵌合现象。结论神经干细胞可以稳定表达外源性基因,移植到发育期的脑内,能够整合到脑组织中,形成广泛的嵌合现象。     

小鼠胚胎干细胞分化为肝前体细胞及其脾内移植的实验研究

目的将体外小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导为肝前体细胞(HPCs)并移植到预处理的C57/BL6小鼠脾脏,检测HPCs在小鼠脾脏内分化和移植细胞的功能及其在脾脏组织中的整合情况,探讨肝细胞合适的替换治疗细胞来源.方法体外培养ESC并制备拟胚体(EBs),体外诱导EBs 18 d后得到HPCs,然后用Hochest 3342荧光标记HPCs并制备成6.0×107/ml细胞悬液.移植受体小鼠用2-乙酰氨基芴(2-AAF)处理,移植前受体鼠经过7 Gy 60 Coγ全身辐照和50%肝脏切除,造成小鼠体内对肝细胞的极大需求;然后将0.1 ml含6.0×106 HPCs细胞悬液经尾静脉注射移植入脾脏,细胞移植4周后,检测移植细胞在小鼠脾脏整合分化情况.结果体外培养ESC并制备出EBs,EBs经体外诱导为HPCs,并将HPCs移植到小鼠脾脏,4周后观察到移植细胞能够嵌合到受体脾脏组织,在脾脏组织中未形成畸胎瘤,并且移植细胞能表达肝细胞较特异标志物白蛋白、CK19和糖原PAS染色呈阳性反应.结论本实验建立一种将体外ESC诱导的HPCs移植并整合到脾脏的细胞移植技术,为研究肝细胞分化的分子机制和肝病的细胞替换治疗提供基础.     

新生大鼠少突胶质前体细胞的培养与鉴定

目的 在体外培养条件下获取纯度较高的少突胶质前体细胞(oligodendrocyte progenitor cells,OPCs).方法 原代混合胶质培养,利用振荡法和差速贴壁法分离纯化少突胶质前体细胞,再用无血清化学条件培养基培养.免疫荧光法及膜片钳记录细胞电生理特性进行鉴定.结果 振荡分离后超过90%细胞为NG2阳性OPCs:OPCs电生理特性:输入阻抗Ra相对较高;电压依赖的K 电流具有外向整流特性;对河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)敏感的小的内向Na 流,不能产生动作电位.结论 振荡法结合差速贴壁可以获得纯度较高的OPCs;OPCs具有区别于神经元、星型胶质细胞、小胶质细胞的独有电生理特性.     

帕金森病大鼠模型的改进及神经前体细胞移植治疗的行为学研究

目的探讨提高6-羟多巴胺(6-OHDA)帕金森病大鼠模型成功率的技术改进方法,并对改进模型进行行为学评价.观察神经前体细胞定点移植对改进型PD大鼠模型行为学的影响.方法 6-OHDA双点微量注射于大鼠左侧大脑制备PD大鼠模型并观察其行为学变化.小鼠胚胎干细胞的培养和无血清神经诱导,神经前体细胞脑内移植,移植后PD大鼠行为变化.结果改进注射方法后PD大鼠模型制备成功率为73.3%,较常规制备方法明显提高;神经前体细胞脑内移植后的PD大鼠的旋转次数明显减少;结论使用6-OHDA双点注射选择性破坏大鼠多巴胺能神经元,可建立较稳定的且成功率较高的PD模型.小鼠ES细胞诱导的神经前体细胞脑内移植后PD大鼠旋转次数明显减少.     

帕金森病大鼠模型的改进及神经前体细胞移植治疗的行为学研究

目的 探讨提高6-羟多巴胺(6-OHDA)帕金森病大鼠模型成功率的技术改进方法，并对改进模型进行行为学评价?观察神经前体细胞定点移植对改进型PD大鼠模型行为学的影响。方法 6-0HDA双点微量注射于大鼠左侧大脑制备PD大鼠模型并观察其行为学变化。小鼠胚胎干细胞的培养和无血清神经诱导，神经前体细胞恼内移植，移植后PD大鼠行为变化。结果 改进注射方法后PD大鼠模型制备成功率为73.3％，较常规制备方法明显提高；神经前体细胞脑内移植后的PD大鼠的旋转次数明显减少；结论 使用6-OHDA双点注射选择性破坏大鼠多巴胺能神经元，可建立较稳定的且成功率较高的PD模型。小鼠ES细胞诱导的神经前体细胞脑内移植后PD大鼠旋转次数明显减少。     

多巴胺D2受体正电子发射计算机断层显像示踪兔脊髓内移植的神经前体细胞

目的探索脊髓内移植神经前体细胞的无创性活体示踪方法。方法培养人神经前体细胞系hNPC-TERT,采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫荧光染色、放射性配基结合实验检测hNPC-TERT多巴胺D2受体在体内外的表达,移植于兔正常脊髓后,以D2受体拮抗剂^11C-raclopride作为示踪剂,正电子发射计算机断层成像（PET）显像示踪兔活体脊髓和离体脊髓内移植的hNPC-TERT。HeLa细胞移植于脊髓作为对照组。结果体外培养和脊髓内移植第2天的hNPC-TERT表达D2受体。静脉注射^11C-raclopride后PET显像,兔活体脊髓和离体脊髓内hNPC-TERT移植部位放射性积聚,对照组仅见本底影像。PET图像中,hNPC-TERT移植部位标准化摄取值明显高于Hela细胞移植部位（P〈0．05）。离体脊髓放射性剖面曲线分析及脊髓切片免疫荧光染色进一步证实了PET显像结果。结论以^11-raclopride为示踪剂,PET显像可以示踪到脊髓内移植第2天的人神经前体细胞系HNPC-TERT。提供了一种以特异性表面标志为靶点进行PET显像的移植干细胞活体示踪方法。     

人胚胎皮层神经前体细胞的分离培养及鉴定

目的 从20周人胚皮层中分离神经前体细胞并鉴定其增殖及分化能力。方法 应用包含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)和表皮细胞生长因子（EGF）的无血清限制培养基从20周自然流产人胚胎皮层组织中分离神经前体细胞,通过神经球形成法使其不断增殖,利用BrdU检测细胞的增殖能力,去除生长因子后诱导神经前体细胞分化。利用流式细胞仪检测神经球内细胞的增殖细胞周期。结果 人胚胎皮层存在神经前体细胞,这些细胞于EGF及bFGF作用下可不断增殖形成神经球,并能自我更新和结合BrdU,于生长因子去除后能够分化成熟的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。反复传代后这些细胞可保持其增殖及分化能力。细胞周期结果显示神经球内细胞增殖较为活跃。结论 从人胚胎中分离的细胞能于体外自我更新和分化为成熟的细胞,证实为神经前体细胞。     

神经干细胞联合胶质细胞源性神经营养因子脑内移植治疗帕金森病的实验研究

目的：探讨胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF）对脑内移植神经干细胞（neural stem cells,NSCs）的存活、分化及对帕金森病（Parkinson＇s disease,PD）模型大鼠的治疗作用.方法：采用原代培养胚胎14.5天的胎鼠腹侧中脑NSCs,单独或经GDNF预处理后移植入PD模型大鼠的纹状体,观察NSCs在纹状体的分化情况,以及PD模型大鼠旋转行为的变化.结果：联合GDNF移植NSCs比单纯移植的NSCs较多的转化为多巴胺能神经元,并能够改善PD模型大鼠的旋转行为.结论：GDNF可以促进中脑来源的NSCs向多巴胺能神经元转化,并对PD模型大鼠有较好的治疗作用.     

神经干细胞移植对大鼠脊髓损伤后GDNF基因表达的影响及意义

目的:探讨神经干细胞(NSC)移植对大鼠脊髓损伤后胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)表达的影响及其意义。方法:NSC提取自新生Wistar大鼠的海马区,经培养、鉴定。制作大鼠脊髓损伤(SCI)模型,于伤后第7d移植NSC。实验分为3组:NSC移植组(A组)、DMEM填充组(B组)、正常对照组(C组)。应用RT-PCR法和免疫组化法观察细胞移植后不同时间点GDNF基因的表达变化。结果:RT-PCR结果分析,移植术后第1,3,5d,A组GDNF mRNA的表达量明显高于B组,差别有显著性意义(P<0.05)。组化结果分析,移植术后第7,14,28d GDNF的表达量明显高于B组,差别有显著性意义(P<0.05)。结论:NSC在移植后可上调神经营养因子GDNF基因的表达,是修复脊髓损伤的机制之一。     

不同浓度GDNF诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化研究

目的观察不同浓度胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对神经干细胞(NSCs)向多巴胺(DA)能神经元分化的影响。方法取新生鼠脑组织体外分离培养NSCs,第2代NSCs诱导培养基中分别加入0、5、10、20 ng/mL GDNF进行诱导。用逆转录-聚合酶链反应检测诱导后细胞酪氨酸羟化酶(TH)mRNA的表达,免疫细胞化学染色鉴定NSCs,检测NSCs向DA能神经元分化率。结果各诱导组均表达TH mRNA。神经球具有自我更新和表达巢蛋白的能力,诱导分化后的细胞能表达神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞特异性抗原。与空白对照组比较,GDNF诱导组TH阳性细胞率均明显升高(P<0.05);且10、20ng/mL GDNF诱导组升高幅度明显高于5 ng/mL GDNF诱导组(P<0.05),10、20 ng/mL GDNF诱导组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论从新生鼠脑组织分离出NSCs。不同浓度的GDNF均能促进NSCs向DA能神经元分化,GDNF浓度从10ng/mL提高到20 ng/mL时TH阳性细胞率无明显变化。     

Monitoring the source of mesenchymal stem cells in patients after transplantation of mismatched-sex hematopoietic stem cells plus third-party cells

Background In bone marrow transplant patients, the microenvironment in bone marrow is damaged after chemotherapy or radiotherapy. Subsequent to allogenic hematopoietic stem cell transplantation in patients with clinically successful engraftments, the source of mesenchymal stem cells （MSCs） remains controversial. To further verify the stimulatory effect of the simultaneous transplantation of cells from second donors on engraftment success for hematopoietic stem cell transplantation in support of donor MSCs engraftments, the aim of this study is to monitor the dynamics of the engraftment of bone marrow-derived MSCs in patients after transplantation with mismatched-sex hematopoietic stem and third-party cells. Methods In this study, the hematopoietic stem cells from 32 clinical donors of different sexes that resulted in successful engraftments were selected for transplantation and were classified into three groups for research purposes： group A consisted of 14 cases of transplantation with bone marrow and recruited peripheral hematopoietic stem cell transplantation, group B contained 8 cases of simultaneous re-transfusion of MSCs from the second donor, and group C contained 10 cases of simultaneous re-transfusion of umbilical blood from the second donor. The bone marrow from 32 patients with successful engraftments of hematopoietic transplantation were selected and sub-cultured with MSCs. Flow cytometry （FCM） was used to measure the expression of surface antigens on MSCs. Denaturing high-performance liquid chromatography （DHPLC） in combination with polymerase chain reaction amplification of short tandem repeats （STR- PCR） was used to measure the engraftment status of fifth-generation MSCs in patients. Fluorescence in situ hybridization （FISH） revealed the sex origin of the fifth-generation MSCs in 32 patients. Dynamic examinations were performed on patients receiving donor transplantations. Results The progenies of fifth-generation MSCs were successfully cultured in 32 cases. The results of FCM demonstrated that the expression levels of CD14＋ and CD45＋ cells were lower than 0.04% in the fifth-generation MSCs. The analysis using DHPLC and FISH showed similar results. One patient from group B also received a temporary transplantation of MSCs from the donor. The MSCs in the remaining 31 patients all originated from the patients themselves. Conclusions After transplantation, the MSCs present in patients originated from the host. In patients transplanted with MSCs from a second donor, the phenomenon of temporary chimerization of MSCs was observed.     

神经干细胞移植对局灶性脑缺血大鼠神经功能的影响

目的探讨神经干细胞移植对局灶性脑缺血大鼠神经功能的影响。方法分离培养新生大鼠海马神经干细胞,BrdU进行标记。采用大脑中动脉阻塞法复制脑缺血模型,动物于造模3d后侧脑室注射标记细胞,分别于1、7、14和28d处死动物,观察动物神经功能和移植细胞存活情况。结果神经干细胞能移行至缺血部位并存活,移植后缺血大鼠神经功能明显得到恢复,在14、28d与模型组差异有显著性。结论神经干细胞移植能促进局灶性脑缺血大鼠神经功能的恢复,是中风治疗的有效方法。     

Transplantation of neural stem cells overexpressing glial cell line-derived neurotrophic factor enhances Akt and Erk1/2 signaling and neurogenesis in rats after stroke

Background Our previous studies have indicated that the beneficial effects of grafting neural stem cells (NSCs) overexpressing glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) in rats after stroke.However,the underlying mechanisms are highly debatable.In this study,we investigated whether neurogenesis,Akt,and extracellular signalregulated kinase 1/2 (Erk1/2) signaling were involved in this process.Methods Transient ischemic stroke were induced by occluding middle cerebral artery for 2 hours and reperfusion.At 3 days after reperfusion,GDNF/NSCs,NSCs,and vehicle were administered.Immunohistochemical staining was used to evaluate neurogenesis by nestin antibody; phosphorylation of Akt and Erk1/2 was investigated by Western blotting analysis.Results Transplantation of GDNF/NSCs and NSCs significantly increased nestin-positive cells compared to control group (vehicle) from 1 to 7 weeks after reperfusion,and GDNF/NSCs showed stronger effect than NSCs at 2 and 3 weeks after reperfusion.Meanwhile,enhanced phosphorylation level of Erk1/2 was observed in the GDNF/NSCs and NSCs groups compared with control group,and phosphorylation level of Erk1/2 in GDNF/NSCs group was remarkably higher than that of NSCs group at any given time.In contrast,expression of mitogen-activated protein kinase phosphatase-1 (MKP-1),known as inhibitor of Erk1/2 signaling,was significantly decreased in the GDNF/NSCs and NSCs groups compared with the control group.Moreover,much enhanced and prolonged phosphorylation level of Akt of GDNF/NSCs group was detected compared with control and NSCs group.Conclusion Grafting GDNF/NSCs enhances neurogenesis and activates Akt and Erk1/2 signaling,that may provide the potential for GDNF/NSCs in stroke treatment.     

人胚胎海马神经干细胞体外培养方法的建立

为建立人胚胎海马神经干细胞的体外培养方法 ,防止神经干细胞在培养过程中的分化 ,确立最佳的传代时机和方法 ,分离 1 6周人胚海马组织 ,采用无血清培养基对所分离的神经干细胞进行体外培养 ,比较不同培养条件与方法所获得的神经球数量的差异。结果 :建立了人胚胎海马神经干细胞体外培养的优化条件 ,确立了最佳传代方法与时机。提示 :人胚胎海马神经干细胞在体外抑制分化的条件下可以长期处于未分化状态增生 ,并且可多次传代。     

大鼠脑皮层星形胶质细胞培养与鉴定

目的：介绍一种新的脑组织星形胶质细胞培养方法，为进一步研究奠定基础。方法：常规分离纯化星形胶质细胞，将其低密度种植，维持在含10％新生牛血清DMEM培养基中培养，并在长时期内不给予更换或补加培养液。利用GFAP—FITC免疫荧光法对所获细胞进行鉴定。结果：经原代及传代培养，获得大量几乎为单一种类细胞，其特点为细胞突起细长、胞体明显缩小、形态多样，最后细胞突起之间相互连接形成星形胶质细胞网络，并在相当长的时间内保持不变。GFAP—FITC免疫荧光染色为强阳性。结论：在限制细胞种植密度和限制给予培养液的培养条件下星形胶质细胞的体外形态发育与在体的情形基本一致，提示该细胞培养方法可能有助于研究中枢神经系统中星形胶质细胞的生理功能。     

芬戈莫德对神经干细胞和星形胶质细胞增殖及迁移的影响及其对小鼠脊髓损伤的保护机制

目的：探讨芬戈莫德（FTY720）对神经干细胞（NSCs）和星形胶质细胞迁移及增殖的影响,阐明FTY720对小鼠脊髓损伤（SCI）的保护作用及其机制。方法：体外培养NSCs和星形胶质细胞,每种细胞随机分为对照组（采用PBS进行处理）和实验组（采用0.1μmol·L^-1FTY720进行处理）。SCI小鼠随机分为对照组（口服PBS）和实验组（口服1 mg·kg^-1·d^-1 FTY720）,每组10只。采用Transwell实验检测2组NSCs和星形胶质细胞的迁移细胞数,免疫荧光染色检测NSCs的迁移细胞数和增殖神经球数,HE染色检测2组小鼠SCI空洞面积,Basso Mouse Scale （BMS）评分评估小鼠运动能力恢复情况。结果：Transwell检测,与对照组比较,实验组NSCs迁移细胞数增多（P<0.05）,星形胶质细胞迁移细胞数减少（P<0.05）。免疫荧光检测,与对照组比较,实验组NSCs增殖神经球数增多（P<0.05）,实验组小鼠SCI震中星形胶质细胞数减少（P<0.05）。HE染色检测,与对照组比较,SCI空洞面积缩小（P<0.05）。BMS评分,与对照组比较,实验组小鼠BMS评分升高（P<0.05）。结论：FTY720可以促进NSCs增殖和迁移,抑制星形胶质细胞迁移,减少SCI后胶质疤痕形成,促进小鼠运动功能恢复。