超声破坏微泡介导骨髓间充质干细胞移植的实验研究

目的 初步探讨超声破坏微泡介导骨髓间充质干细胞(MSCs)移植的可行性.方法 21只Wister大鼠分为3组:干细胞静脉移植组(MSCs-iv)、超声+干细胞组(US+MSCs-iv)、超声+微泡+干细胞组(US+MB+MSCs-iv).各组分别取1只大鼠的骨骼肌行HE染色观察显微结构.移植后7 d取各组剩余大鼠下肢股薄肌、半膜肌行免疫组化检测,观察MSCs移植数量;另外US+MB+MSCs-iv组同时取重要脏器行免疫组化检测,评估靶向性.结果 US+MB+MSCs-iv组大鼠股薄肌、半膜肌染色可见红细胞外溢到组织间隙,同时免疫组化结果显示股薄肌、半膜肌及脾脏可见较多移植的MSCs.而其他组骨骼肌未观察到阳性细胞.结论 超声靶向破坏微泡有可能成为提高干细胞移植效率的新方法.     

评价超声破坏微泡联合骨髓间充质干细胞移植的靶向性

目的 评价超声破坏微泡联合骨髓间充质干细胞移植的靶向性。方法 Wister大鼠10只,离断右侧股动脉后7d,经颈静脉输入白蛋白微泡和骨髓间充质干细胞(MSCs,6×106/ml～7×106/ml)的混悬液2 ml的同时用参数为1.9 W/cm2的超声间断作用大鼠右侧缺血下肢骨骼肌180s.处理后第7d,取右侧缺血下肢骨骼肌及各重要脏器,用免疫组化的方法检测移植的MSCs。结果 免疫组化结果显示大鼠下肢缺血骨骼肌及脾脏均可见较多移植的MSCs,而在心脏、肝脏、肾脏组织未检测到移植的MSCs。结论 利用超声破坏微泡技术联合MSCs移植具有较好的靶向性,有希望成为一种介导干细胞移植的新方法。     

HIF-1α在骨髓间充质干细胞治疗大鼠急性心肌梗死中的作用

目的 观察低氧诱导因子-1α(HIF-1α)在骨髓间充质干细胞(BMMSCs)治疗大鼠急性心肌梗死中的作用,并与单纯BMMSCs移植作比较.方法 ① BMMSCs的提取、培养、标记.② 建立急性心肌梗死模型.将大鼠随机分为4组,对照组、单纯BMMSCs组、HIF-1α反义寡核苷酸组、HIF-1α错义寡核苷酸组.术后4周...     

骨髓间充质干细胞移植对大鼠脑梗死的治疗作用

目的 观察大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)对缺血性脑损伤的保护和修复作用,探讨不同时间点移植BMSCs对大鼠脑梗死治疗效果的差异. 方法 建立大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)再灌注模型,在MCAO术后3、6、12、24、72 h这5个时间点经尾静脉移植BMSCs到脑梗死大鼠,并与PBS移植组和空白对照组进行脑梗死体积和神经损伤严重程度评分(NSS)比较. 结果 MCAO术后28 d,TTC染色显示:与PBS移植组和空白对照组比较,BMSCs移植组的脑梗死体积明显减小(P＜0.05);随着细胞移植时间推后,梗死体积逐渐增大,BMSCs 3、6、12、24、72 h移植组脑梗死体积分别为(40±27)、(80±25) 、(123±21)、(161±19)和(202±27) mm3.BMSCs移植组大鼠NSS明显低于PBS移植组和空白对照组(P＜0.05),并且BMSCs移植越早,NSS越低. 结论 在MCAO术后3～72 h移植BMSCs对大鼠脑梗死都有治疗效果,并且移植越早,治疗效果越好.     

骨髓间充质干细胞移植对大鼠脑梗死的治疗作用

目的观察大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)对缺血性脑损伤的保护和修复作用,探讨不同时间点移植BMSCs对大鼠脑梗死治疗效果的差异。方法建立大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)再灌注模型,在MCAO术后3、6、12、24、72 h这5个时间点经尾静脉移植BMSCs到脑梗死大鼠,并与PBS移植组和空白对照组进行脑梗死体积和神经损伤严重程度评分(NSS)比较。结果MCAO术后28 d,TTC染色显示:与PBS移植组和空白对照组比较,BMSCs移植组的脑梗死体积明显减小(P<0.05);随着细胞移植时间推后,梗死体积逐渐增大,BMSCs 3、6、12、24、72 h移植组脑梗死体积分别为(40±27)、(80±25)、(123±21)、(161±19)和(202±27)mm3。BMSCs移植组大鼠NSS明显低于PBS移植组和空白对照组(P<0.05),并且BMSCs移植越早,NSS越低。结论在MCAO术后3~72 h移植BMSCs对大鼠脑梗死都有治疗效果,并且移植越早,治疗效果越好。     

骨髓间充质干细胞移植对急性期脑梗死大鼠的干预作用

目的观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对急性期脑梗死大鼠的干预作用。方法按随机化原则将50只脑梗死大鼠模型随机分为BMSCs移植组、上清液移植组各22只及对照组6只。BMSCs组在脑梗死大鼠模型成功后3 h经静脉注入BMSCs 1 ml,上清液组注入上清液1 ml,对照组注入磷酸盐缓冲液(PBS)1 ml。术后28 d检测PBMSc在脑内的存活转化情况。分别于0、7、14及28 d观察记录各组大鼠的神经损伤严重程度评分(NSS)。结果 28 d后,BMSCs脑梗死灶边缘可见少量BrdU阳性细胞表达神经元特异性烯醇化酶(NSE),而上清液组及对照组病灶边缘则无NSE;细胞移植后,各组神经功能均有不同程度的恢复;从第7天起,BMSCs移植组NSS评分明显低于上清液组及对照组(P<0.05),而后2组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论骨髓间充质干细胞移植入急性脑梗死大鼠体内后,可存活、移行至梗死灶周围,并分化为神经元细胞,而且能够减轻脑梗死大鼠的神经损伤程度。     

骨髓间充质干细胞不同时相干预对SD大鼠急性肺损伤的修复作用

目的 探究骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)不同时间干预对以静脉注射脂多糖(LPS)构建大鼠急性肺损伤(ALI)模型的修复作用.方法 体外分离、培养并鉴定大鼠BM-MSCs.将120只雄性SD大鼠纳入研究,分成对照组、LPS组和LPS+ BM-MSCs组,上述3组因BM-MSCs处理时间差异分成2、8、24、48、96 h共5个亚组(n=8).LPS组以5 mg/kg尾静脉注射LPS,LPS+ BM-MSCs组在注射LPS后分别在上述不同时间点尾静脉注射1 mL的BM-MSCs(1×106·mL-1);对照组则在上述时相点注射等剂量的生理盐水.检测各组肺泡灌洗液肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1α等炎症因子浓度、肺湿干比及肺损伤病理评分.结果 成功分离、培养、纯化BM-MSCs,并诱导向成骨、成软骨、成脂细胞分化;流式细胞术鉴定所培养细胞系CD90、CD105、CD45、CD34阳性率分别为98.89％、97.37％、3.17％及1.41％.在LPS诱导·的ALI中,TNF-α、IL-1α、IL-10在8h亚组中测得最高值[分别为(364.911±32.182) pg/mL、(286.316±18.567) pg/mL、(162.037±22.377) pg/mL],随着时间延长逐渐下降;肺湿干比在2h亚组中测得最高值(6.361 ±0.265);肺水肿及组织损伤程度在2h亚组中最严重,病理评分也测得最高值(0.462±0.048),随着时间延长逐渐下降.在LPS+ BM-MSCs组中,2、8、24 h的炎症因子、湿干比及病理评分均有显著改变(P＜0.05),随着时间延长,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 早期应用BM-MSCs可减少TNF-α、IL-1α等炎症因子,从而减轻肺组织损伤及肺泡水肿.     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养

目的 观察体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的生物学特性。方法 通过贴壁法培养、鉴定大鼠骨髓MSCs，观察其生长规律及光镜结构特点。结果 大鼠MSCs 7代以前增殖速度较快，细胞接种后1～2d为滞留期，3d后达对数生长期，第6天进入平台期。免疫组织化学染色显示MSCs表达CI）44，不表达CD45；光镜下可见MSCs呈梭形、纺锤形和多角形，核居中，有1～2个核仁。结论 培养的细胞为骨髓MSCs；在体外培养条件下细胞生长性状稳定，可作为组织工程的种子细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞的超微结构观察

目的 研究体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的生物学特性。方法 通过贴壁法培养、鉴定大鼠骨髓MSCs,观察其生长规律及光、电镜结构特点。结果 大鼠MSCs 7代以前增殖速度较快,细胞接种后1～2d为滞留期,3d后达对数生长期,第6天进入平台期。免疫组织化学染色显示MSCs表达CD44,不表达CD45;光镜下可见MSCs呈梭形、纺锤形和多角形,核居中,有1～2个核仁;透射电镜下可见MSCs胞质较丰富,有线粒体、粗面内质网和高尔基复合体等细胞器,核呈圆形或椭圆形,有明显核仁。结论 培养的骨髓MSCs有独特的超微结构特点;在体外培养条件下细胞生长性状稳定,可作为组织工程的种子细胞。     

黏附分子在骨髓间充质干细胞的表达及向心肌梗死区归巢的作用

目的探讨炎性因子对骨髓间充质干细胞(BMMSCs)黏附分子表达及对其向心肌梗死区归巢的作用。方法采用全骨髓直接贴壁法获取大鼠原代BMMSCs,体外培养至第3代用于以下实验:①将培养的BMMSCs用浓度为10μg/L的IL-1β刺激24 h,采用流式细胞术检测血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、细胞间黏附分子-l(ICAM-1)的表达率;②开胸结扎雄性SD大鼠左冠状动脉前降支,于心肌梗死后24 h,经尾静脉输注经Brdu标记、10μg/L IL-1β预刺激的BMMSCs;输注BMMSCs 24 h后取心肌组织,做冰冻切片,荧光显微镜下计数组织中的BMMSCs数目。以上实验以设不加IL-1β刺激作空白对照组,另在刺激组加抗VCAM-1单克隆抗体作为实验对照。结果生理状态下,大鼠BMMSCs表面黏附分子ICAM-1表达较高,而VCAM-1表达较低;而IL-1β刺激后,黏附分子VCAM-1表达升高;浓度为10μg/L的IL-1β刺激BMMSCs,输注到大鼠体内,心肌梗死区组织的BMMSCs数目明显高于对照组及IL-1β+抗VCAM-1单克隆抗体组。结论炎性因子IL-1β能够增强大鼠BMMSCs表面VCAM-1的表达,但对大鼠BMMSCs表面ICAM-1的表达无影响;其可以有效促进BMMSCs与血管内皮细胞的黏附,提高BMMSCs向心肌梗死区域迁移,其机制可能与BMMSCs表面VCAM-1表达升高有关。     

大鼠骨髓间充质干细胞分离和培养方法的研究

目的研究在体外培养和纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法。方法采用改良全骨髓贴壁方法,分离和纯化3～4周的大鼠BMSCs,镜下连续观察细胞的形态变化。流式细胞仪鉴定其表面抗原CD45和CD29的表达情况。结果原代培养的细胞呈圆形和梭形等,24 h后大部分细胞均贴壁。8～10 d可达80%～90%融合,纯化后传代周期为6～8 d。流式细胞术鉴定表明CD45阴性,CD29阳性。结论改良全骨髓贴壁法可有效分离培养大鼠的骨髓间充质干细胞,是一种比较理想的分离培养方法。     

大鼠骨髓间质干细胞的分离培养及生物学特性研究

目的建立大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)最佳的体外分离培养方法,并研究其基本的生物学特性。方法采用密度梯度离心和贴壁培养两种方法分离大鼠的MSCs,进行形态学观察及增殖生长方面的测定;免疫细胞化学染色鉴定表面标志。结果大鼠MSCs体外培养呈梭形;细胞生长曲线为“S”型;密度梯度离心法原代培养15d达到80%～90%的融合,而改良的直接贴壁法只需要5d;细胞周期显示G0/G1期88.29%;免疫细胞化学染色显示CD44表达阳性,CD34、CD45为阴性。结论两种方法均可获得骨髓间质干细胞,但贴壁培养法操作更简便、快速,具有对细胞活性影响较小,更利于其贴壁和增殖的优点。MSCs体外培养条件下生长性状稳定,适于做组织工程的种子细胞。     

骨髓间充质干细胞的免疫调节活性

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一种多潜能的非造血干细胞,可以向多系分化,如骨、脂肪和软骨,并优先归巢于损伤组织,有利于组织修复。体外研究显示它们不诱导免疫应答,对识别、清除同种异体抗原的免疫细胞具有抑制作用。在动物实验中,骨髓间充质干细胞可以诱导外周免疫耐受并向损伤处迁移,抑制致炎细胞因子的释放,促进损伤组织修复。这种独特作用说明它们在细胞治疗和自身免疫性疾病治疗中发挥了积极作用。     

人胎盘来源间充质干细胞和大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特征比较

目的:从人足月的胎盘羊膜中和Wistar 大鼠股骨及胫骨骨髓中分离、培养间充质干细胞（MSCs）,研究人胎盘来源MSCs（HPMSCs）和大鼠骨髓来源MSCs（BMSCs）的分离培养方法和生物学特征、表面标志及其多分化潜能。方法:将人足月胎盘组织通过胶原酶Ⅱ消化培养获取HPMSCs,采用全骨髓贴壁法从4周龄Wistar大鼠双侧股骨及胫骨中分离、纯化大鼠BMSCs,运用活细胞计数法检测其增殖能力,采用流式细胞术检测2种细胞表面标志物的表阳性率;
用地塞米松、维生素C和β磷酸甘油诱导其向成骨细胞分化,用茜素红染色鉴定;用胰岛素、地塞米松、IBMX和吲哚美辛诱导其向脂肪细胞分化,以油红O染色鉴定。结果:HPMSCs为梭形贴壁细胞,增殖能力较强,CD44和CD34表达阳性率分别为94.45%和1.67%;BMSCs为圆形、梭形和多角形,增殖能力强,CD44和CD34表达阳性率分别为93.11%和2.68%。2种细胞经过成脂诱导液和成骨诱导液诱导后,茜素红和油红O染色结果均为阳性,表明2种细胞均可向脂肪细胞和成骨细胞分化。结论:HPMSCs与大鼠BMSCs的生物学特征相似,同样具有多分化潜能,HPMSCs具有更强的增殖能力。     

大鼠骨髓间充质干细胞诱导为胰岛样细胞体外实验

目的：探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）在不同葡萄糖浓度培养基中诱导效果的差异.方法：采用电镜观察细胞形态学变化、双硫腙（DTZ）染色鉴定胰岛素分泌细胞的存在;放射免疫分析法观察诱导后BMSCs细胞对葡萄糖刺激试验的反应;免疫细胞化学分析鉴定细胞内胰岛素分泌以及Real-timePCR鉴定胰岛β细胞相关基因mRNA表达水平.结果：电镜观察可见诱导后的细胞具备典型分泌细胞特点,DTZ染色显示各诱导组细胞团为棕红色,细胞浆中富含锌离子,而对照组则无染色,表明胰岛素分泌样细胞的存在.经不同浓度葡萄糖诱导后其吸光度值A值：低糖5.5mmol/L诱导组（4.75±1.87）,中糖11.1mmol/L诱导组（10.96±2.06）,高糖25mmol/L诱导组（12.53±2.04）,且各诱导组吸光度值A值随着培养基葡萄糖浓度的不断增加,A值也在不断增高.Real-timePCR定量分析结果显示,诱导后胰岛β细胞相关基因GK,PDX-1,ngn3,GLP-1mRNA的表达水平变化显著,差异具有统计学意义（P〈0.01）.胰岛素分泌量高糖25mmol/L诱导组（6.64±0.46）IU/L高于其他各组,差异具显著性（P〈0.01）.结论：培养基葡萄糖浓度对大鼠BMSCs诱导为胰岛样细胞具有一定影响,以高糖培养基的诱导效果较好.     

deltex-1腺病毒载体的构建及其在大鼠bMSCs中的表达

目的构建deltex-1基因腺病毒载体并研究其在大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells,bMSCs)中的表达。方法采用高保真酶PCR扩增deltex-1基因并测序,亚克隆至pAdTrack-CMV腺病毒穿梭载体后在BJ5183细菌中进行重组,挑选正确的重组子在FT293细胞中包装成病毒。以CsCl2方法纯化病毒,并进行滴度测定。将目的基因病毒感染bMSCs细胞后收集总RNA及蛋白,用PCR及Western blot方法检测目的基因表达水平。结果①成功扩增了大小为1 883 bp的大鼠deltex-1,并成功构建了大小为4.5 kb的同源重组腺病毒穿梭载体,滴度为1.23×1011 IU/ml;②对培养的大鼠bMSCs进行流式检测,结果为CD90、CD44阳性表达,分别为99.57%和85.66%,而CD45表达阴性,阳性率为0.35%;③荧光显微镜观察deltex-1转染效率为60%～70%,RT-PCR及Western blot检测结果显示转染后deltex-1表达明显增强,说明转染成功。结论成功构建deltex-1基因腺病毒载体并能在bMSCs中高表达。     

IL-10基因修饰对骨髓间充质干细胞体外免疫效应的影响

目的：研究IL-10基因修饰的骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）体外免疫效应。方法:RT-PCR克隆大鼠IL-10基因并构建逆转录病毒pLNCX-IL-10,转染大鼠BM-MSCs;流式细胞术检测IL-10基因修饰的BM-MSCs（BM-MSCsIL-10）体外对T淋巴细胞亚群的影响,CCK-8法检测BM-MSCsIL-10及其培养上清液对体外混合淋巴细胞增殖的影响。结果:BM-MSCsIL-10能明显减少CD4 T,降低CD4 /CD8 比值,比BM-MSCs作用明显（P<0.05）;BM-MSCsIL-10及其培养上清液比BM-MSCs更能明显抑制T淋巴细胞增殖反应（P<0.05）。结论:IL-10基因修饰能增强BM-MSCs的体外免疫抑制作用。     

Biological features of mesenchymal stem cells from human bone marrow

Objective To study the biological characteristics of mesenchymal stem cells (MSCs) from human bone marrow. Methods A culture of mesenchymal stem cells was initiated from bone marrow low-density mononuclear cells separated by Percoll Centrifugation and maintained in low-glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) with 10% selected fetal calf serum. Cell growth pattern and its responses to cytokines were evaluated by trypan blue exclusion and MTT test, respectively. Cell cycle and surface antigenic features were analyzed by flow cytometry technique. Cytochemistry characteristics of MSCs were determined.Results Easy-handling methods to isolate and culture expand MSCs were developed in this study. MSCs were unique in their phenotypes. They were positive for CD29, CD44, CD166, and negative for CD34, CD45, HLA-DR and Ulex europaeus. Cytochemistry evaluation showed that MSCs were homogeneously positive for acid α-naphthl acetate esterase (ANAE), glycogen (periodic acid Schiff reaction, PAS), and negative for acid phosphatase (ACP) and the Sudan black reaction (SB). Around 5% of them were positive for alkaline phosphatase (ALP). The cells had a population doubling time of 30 hours and cell cycle analysis showed that approximately 10% of them were in S phase. MSCs grew at significantly different rates when incubated in the presence of various recombinant human cytokines, of which interferon γ, tumor necrosis factor α, stem cell factor and insulin-like growth factor promoted the proliferation of MSCs dramatically, while others tested had no effects on cell growth. Conclusions MSCs are a homogenous population of cells that have unique growth, phenotypical and cytochemical characteristics. Furthermore, the diverse responses of MSCs to different cytokines provide a clue for the selection of optimal expansion and maintenance of MSCs.