核心结合因子α1、雌激素受体α基因多态性与骨发育的相关性

骨生长因子是由骨细胞产生,并贮存在基质中,具有调节骨生长作用的一类生长因子。骨发育与基因调控有关,目前发现了很多种该类因子,通过自分泌和旁分泌方式在骨的形成和吸收过程中起作用。核心结合因子α1和雌激素受体α的基因是近年来研究与骨生长发育有关的热点因子。基因的多态性属于基因水平上的变异,一般发生在基因序列中不编码蛋白的区域和没有重要调节功能的区域。文章就骨生长因子中的核心结合因子α1和雌激素受体α的基因多态性与骨发育相关性的研究现状进行探讨。     

激素性股骨头坏死模型兔坏死股骨头内核心结合因子α1蛋白表达与普伐他汀的干预*****

背景：洛伐他汀、辛伐他汀等他汀类降脂药可上调核心结合因子α1的蛋白表达,促进骨坏死修复。 目的：观察普伐他汀对激素性股骨头坏死兔模型核心结合因子α1的蛋白表达的影响。 方法：将80只新西兰白兔分为对照组18只,实验组62只。实验组制备兔激素性股骨头缺血坏死模型。造模第5周,将造模成功兔36只分为模型组和他汀组,每组18只。他汀组以普伐他汀(1.2 mg/kg)1次/d灌胃,模型组和对照组以等体积的蒸馏水灌胃。造模后8,12,16周分批处死动物,截取股骨头行免疫组化检测核心结合因子α1的蛋白表达。 结果与结论：对照组不同时相点股骨头核心结合因子α1的蛋白表达均为阳性;模型组造模后8周及12周表达均为阴性,造模后16周表达呈弱阳性;他汀组造模后8,12,16周表达均为阳性,且随着用药时间的延长表达逐渐增强。结果说明普伐他汀可有效促进早期激素性股骨头坏死兔模型坏死股骨头核心结合因子α1的蛋白表达。     

钙黏蛋白11和核心结合因子α1双基因修饰人骨髓间充质干细胞

背景：钙黏蛋白11对骨髓间充质干细胞进行基因修饰,可促进细胞的黏附性能。利用核心结合因子α1对骨髓间充质干细胞进行基因修饰,有望实现多能干细胞的成骨定向分化,并在诱导成骨分化的级联效应中发挥重要的信号作用。 目的：拟采用腺病毒为载体,介导钙黏蛋白11、核心结合因子α1基因修饰骨髓间充质干细胞,观察两基因的表达情况。 设计、时间及地点：细胞-基因学实验,于2008-08在珠江医院中心实验室完成。 材料：人骨髓间充质干细胞来源于1例胸椎骨折男性患者,由珠江医院提供,患者对实验知情同意。钙黏蛋白11全长cDNA质粒由日本神户理研Riken分子生物中心Takeichi教授惠赠,全长核心结合因子α1基因质粒由美国Baylor医学院Ducy博士提供,pAdeasy腺病毒系统由美国约翰霍普金斯遗传所Bert博士馈赠。 方法：Percoll密度梯度离心+贴壁法分离培养人骨髓间充质干细胞。利用PCR技术获得钙黏蛋白11和核心结合因子α1基因,分别构建到腺病毒穿梭载体上,然后分别通过同源重组获得重组腺病毒质粒,再将两病毒质粒包装获得重组病毒液,最后通过病毒将两基因导入骨髓间充质干细胞。 主要观察指标：Western blot法检测钙黏蛋白11、核心结合因子α1基因在人骨髓间充质干细胞中的表达。 结果：获得携带钙黏蛋白11和核心结合因子α1基因的病毒液,将其感染人骨髓间充质干细胞后,以Western blot检测两种基因同时获得高表达。 结论：实验成功构建钙黏蛋白11和核心结合因子α1基因腺病毒载体,通过病毒转染人骨髓间充质干细胞,二者获得高效表达。     

2型糖尿病大鼠骨髓腔内过氧化物酶体增殖物激活受体γ和核心结合因子α1 mRNA表达与骨折的愈合

背景：骨髓间充质干细胞成骨分化与成脂分化方向对骨再生和修复的影响是目前的研究热点,过氧化物酶体增殖物激活受体γ特别是过氧化物酶体增殖物激活受体γ2和核心结合因子α1对骨髓间充质干细胞分化方向有调控作用。 目的：分析2型糖尿病大鼠骨髓腔内过氧化物酶体增殖物激活受体γ和核心结合因子α1的表达变化与骨折愈合障碍的关系。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2007-08/12在中南大学第三附属医院中心实验室完成。 材料：选用雄性SD大鼠30只,按随机数字表法分为2组,对照组10只,实验组20只,分别给予普通饲料、高糖高脂饲料喂养。 方法：大鼠喂养8周后断尾法取血,实验组腹腔注射链脲佐菌素30 mg/kg,对照组注射等量枸橼酸盐缓冲液。注射2周后断尾法取血,建立大鼠左胫骨牵引成骨模型,行左胫骨中上段骨干横行截骨,安置特制延长外固定架,牵引14 d。 主要观察指标：行X射线摄片比较2组大鼠牵引间隙内骨痂的形成;在组织学水平观察牵引骨痂内微骨柱及初始基质前沿形成及骨折两端髓腔内脂肪细胞形成,并计算骨折两端髓腔内脂肪细胞与骨髓腔面积百分比;以反转录-聚合酶链反应法检测双侧股骨骨髓腔内过氧化物酶体增殖物激活受体γ和核心结合因子α1 mRNA的表达。 结果：实验组大鼠高糖高脂饲料喂养8周后,总胆固醇、三酰甘油及空腹胰岛素浓度均高于对照组(P < 0.05~0.01);实验组大鼠腹腔注射链脲佐菌素2周后：空腹血糖、总胆固醇及三酰甘油浓度高于对照组(P < 0.05~0.01),说明2型糖尿病建立成功。X射线摄片显示,实验组大鼠骨折断端之间牵引骨痂形成明显减少,骨痂组织学检查表现为微骨柱基质排列紊乱,初始基质前沿浅染。组织学检查显示,实验组大鼠骨折两端髓腔内脂肪细胞及脂肪细胞占骨髓腔面积百分比高于对照组(P < 0.01)。反转录-聚合酶链反应法检测显示,实验组大鼠双侧股骨骨髓腔内过氧化物酶体增殖物激活受体γ mRNA表达上调(P < 0.05),核心结合因子α1 mRNA表达下调(P < 0.05)。 结论：2型糖尿病大鼠骨折愈合障碍可能与2型糖尿病条件下骨髓腔内过氧化物酶体增殖物激活受体γ mRNA表达增加及核心结合因子α1mRNA的表达受抑制有关。     

不同缺氧方法诱导皮质神经元表达缺氧诱导因子1α及促红素的实验方法比较

目的研究不同缺氧方法刺激皮质神经元后细胞变化及HIF-1α、EPO的表达。方法原代培养皮质神经元,分为正常对照组、环境缺氧组、氯化钴组和去铁敏组4组培养,CCK-8法检测细胞活力。应用western blot方法检测HIF-1α及EPO蛋白的表达,RT-PCR分析其mRNA的表达。结果不同的缺氧条件均能减低细胞活力,其中氯化钴组下降最明显。3组均可诱导HIF-1α及EPO蛋白表达:去铁敏组HIF-1α、EPO蛋白表达均高于氯化钴组(P<0.05)。3组均能上调HIF-1α及EPO mRNA表达:去铁敏组、环境缺氧组与氯化钴组比较有明显升高(P<0.01)。结论不同缺氧方法均可以诱导皮质神经元表达HIF-1α、EPO蛋白和mRNA表达。去铁敏化学缺氧法是更为合适的皮质神经元缺氧研究的方法。     

核因子κBp65特异性小干涉核糖核酸抑制肿瘤坏死因子α及白细胞介素1β诱导的软骨细胞中基质金属蛋白酶9的表达

背景：小干涉核糖核酸是核糖核酸干涉的起始诱导物，在细胞内引起强烈的核糖核酸干涉，降解目的基因的信使核糖核酸，以控制目的基因表达。 目的：利用核因子κBp65特异性小干涉核糖核酸抑制软骨细胞中肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β诱导的核因子κB的活性及其基质金属蛋白酶9的表达，观察在软骨细胞中核因子κBp65与细胞因子的关系。 设计、时间和地点：单一样本观察，细胞学体外实验，于2006-09/2007-09在北京大学医学部中心实验室完成。 材料：SD大鼠关节软骨细胞。 方法：利用质脂体将筛选优化好的核因子κBp65特异性小干涉核糖核酸转染软骨细胞，特异性抑制核因子κBp65的表达，继而抑制肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β诱导的核因子κB的活性及基质金属蛋白酶9的表达。 主要观察指标：利用电泳迁移率试验检测核因子κB的活性，反转录聚合酶链反应和蛋白质免疫印记法分析从信使核糖核酸和蛋白质两水平检测基质金属蛋白酶9的表达。 结果：核因子κBp65特异性小干涉核糖核酸抑制核因子κBp65的表达，降低肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β诱导的核因子κB的转录活性，抑制肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β诱导的基质金属蛋白酶9的表达。 结论：在软骨细胞中核因子κBp65与肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β关系密切。     

转录因子X盒结合蛋白1转染对神经干细胞在缺氧环境下grp78、EDEM表达及抗凋亡能力的影响

目的将X盒结合蛋白1基因以重组腺病毒为载体转染胚鼠海马神经干细胞,观察其在缺氧环境下是否可以使移植后干细胞内grp78、EDEM表达增加以及对干细胞抗凋亡能力的影响。方法取孕16d SD大鼠胚鼠的海马组织进行神经干细胞的分离、克隆、nestin免疫荧光检测,以及传代和扩增。将重组腺病毒Ad-XBP1-EGFP质粒转染胚鼠海马神经干细胞,得到基因修饰后的胚鼠海马神经干细胞。选取未转染的神经干细胞标记为对照组、未转染组;选取转染后的神经干细胞标记为转染组。未转染组和转染组用CoCl2诱导缺氧,24h后WesternBlot检测3组神经干细胞中xbp-1,grp78,EDEM,bcl-2及bax表达,流式细胞术检测NSCs和XBP1-NSCs的凋亡情况。结果在缺氧条件下,与未转染组相比,转染组的grp78表达增加,EDEM表达水平上升,bcl-2水平上升,而bax水平下降(P0.05);转染组神经干细胞凋亡程度较未转染组减轻(P0.05)。结论可以利用重组腺病毒作为载体成功将X盒结合蛋白1基因导入胚鼠海马神经干细胞中;转染后的神经干细胞在缺血缺氧条件下grp78、EDEM水平上升,抗凋亡能力较普通神经干细胞明显增加。     

Insulin-like growth factor binding protein-1-6 expression in activated microglia

In the CNS insulin-like growth factor-1 (IGF-1) enhances survival of neurons, promotes myelin synthesis and acts as a mitogen for microglia. The effects of IGF-1 are regulated by a family of 6 IGF binding proteins (IGFBPs). We investigated mRNA expression patterns of IGFBPs in primary rat microglia under basal conditions and after activation with lipopolysaccharide (LPS). Under basal conditions, microglia expressed IGFBP-2 to -6, whereas, IGFBP-1 could not be detected. Following 2 h treatment with LPS mRNA levels for IGFBP-4 and -6 displayed a down regulation, and IGFBP-5 became undetectable. Levels of IGFBP-2 and -3 remained unaltered. Expression patterns of IGFBPs might play an important role in regulating the autocrine/paracrine IGF-1 actions on microglia under inflammatory conditions.     

肿瘤坏死因子α在肢体缺血再灌注损伤软骨中的表达

背景：肢体缺血再灌注损伤的研究起步相对较晚,且主要集中在对肢体骨骼肌、神经等软组织的研究,对肢体缺血再灌注后关节软骨的损伤目前国内外却较少报道。 目的：观察肿瘤坏死因子α在肢体缺血再灌注损伤时不同时间段内软骨中的表达变化。 方法：将SD大鼠随机分为假手术组、缺血6 h组、缺血6 h再灌注1,3,7,14,30,60 d组。建立大鼠肢体缺血再灌注损伤模型。分别于缺血再灌注后相应时间点处死动物,切取左胫骨平台内侧软骨组织做苏木精-伊红染色观察软骨的组织形态学变化,免疫组织化学检测软骨中肿瘤坏死因子α表达水平的变化。 结果与结论：早期(7 d内)软骨组织学光镜下改变不明显;后期损伤加重,可见软骨变薄,排列紊乱,表面不完整,偶见软骨缺损。假手术组肿瘤坏死因子α阳性表达较弱,缺血6 h组阳性表达开始增强,再灌3,7 d组达到高峰,随后阳性表达下降;再灌60 d组与假手术组相比差异仍有显著意义(P < 0.05)。结果表明,肢体缺血再灌注可导致关节软骨的损伤。肢体缺血再灌注损伤时,关节软骨中肿瘤坏死因子α增加在软骨损伤中发挥重要作用。     

Increased hypoxia-inducible factor 1alpha expression in rat brain tissues in response to aging

The present study observed changes in rat neural cells at various ages (3, 18, 24, and 30 months). With age, neural cells became large and were sparsely arranged, and the number of Nissl bodies decreased. In addition, hypoxia-inducible factor 1α expression increased with increasing age in hippocampal CA1 and CA3 regions, motor cortex, and the first subfolium, especially from 3 to 18 months. In the open-field test, grid crossing decreased with increasing age, especially from 18 months. The number of rearings reached a peak in the 18 months group, and then subsequently decreased. The results suggested that hypoxia-inducible factor 1α played an important role in the nervous system aging process.     

缺氧诱导因子1α小干扰RNA对骨髓间充质干细胞缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子基因表达的影响*

背景：缺氧可以影响骨髓间充质干细胞分泌细胞因子,其机制可能是通过缺氧诱导因子1α起作用的。 目的：观察缺氧诱导因子1α RNA干扰对骨髓间充质干细胞缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子基因表达的影响。 方法：贴壁法培养骨髓间充质干细胞,取第3~5代细胞用于实验,倒置显微镜下观察细胞形态,并用流式细胞仪检测其表面标志物CD34、CD44、CD90表达。将骨髓间充质干细胞分四组：常氧对照组(无干预因素)、缺氧组(缺氧24 h)、脂质体对照组(转染空载脂质体后缺氧24 h)、RNA干扰组(转染脂质体介导的RNA干扰序列后缺氧24 h)。RT-PCR法检测骨髓间充质干细胞的缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子 mRNA表达水平, ELISA检测骨髓间充质干细胞培养上清缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子蛋白表达水平。 结果与结论：同常氧对照组比较,缺氧组缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1 α和血管内皮生长因子基因及蛋白表达增高(P < 0.05);同脂质体对照组比较,RNA干扰组缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子基因及蛋白表达降低(P < 0.05)。证实了缺氧条件可以使骨髓间充质干细胞血管内皮生长因子和基质细胞衍生因子1α的表达增加,抑制缺氧诱导因子1α的表达可以使血管内皮生长因子和基质细胞衍生因子1α的表达减少,缺氧诱导因子1α很可能是干细胞移植细胞因子分泌的调控因素。     

大鼠骨髓细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ和核结合因子α1表达增龄性变化与增龄性骨折愈合障碍

背景：有报道随着年龄的增加,骨折愈合的难度加大,可能是由于骨髓间充质干细胞分化为成脂细胞、成骨细胞等时的基因调控不同,但其具体机制尚不清楚。 目的：观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ以及核结合因子α1在增龄性骨折愈合过程中的表达情况,以探讨过氧化物酶体增殖物激活受体与核结合因子α1基因的增龄性表达变化与增龄性骨折愈合障碍的联系。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2007-10/2008-02在中南大学湘雅三医院完成。 材料：随机选取雄性3月龄及23月龄SD大鼠各6只,分为高龄组(23月龄)和低龄对照组(3月龄),每组各6只。 方法：所有动物左下肢胫骨处安装自制微型外固定延长支架并行中上段横行截骨。术后第2天始每日延长牵引外固定架2次,0.20 mm/次,牵引期为14 d。术后第15天处死大鼠,无菌条件下分离采集左胫骨标本。 主要观察指标：骨折影像学、组织学检查;以反转录-聚合酶链反应检测过氧化物酶体增殖物激活受体与核结合因子α1 mRNA的表达。 结果：所有动物均进入结果分析。骨折断端间影像学检查,低龄对照组骨折断端间大量骨痂产生,成骨显著强于实验组;组织学检查,低龄对照组各实验动物均有大量骨痂生长,膜内成骨显著;而老龄组骨痂生长存在明显减弱,断端间仅为纤维连接;反转录-聚合酶链反应检查,低龄组大鼠骨髓中核结合因子α1 mRNA表达明显强于高龄组,而高龄组过氧化物酶体增殖物激活受体mRNA表达则较为显著,且两组间该两种因子的表达差异有显著性意义。 结论：不同年龄组大鼠骨折愈合情况存在差异,随着年龄的增加,骨折愈合能力下降;大鼠骨髓中过氧化物酶体增殖物激活受体mRNA与核结合因子α1 mRNA表达水平随年龄增加发生相应变化,提示该两种基因表达水平变化与增龄性骨折愈合障碍存在联系。     

Proteinase inhibitor alpha 1-antichymotrypsin has different expression in various forms of neuronal ceroid lipofuscinosis.

Defective proteolytic degradation is most widely maintained as the major pathogenetic factor in neuronal ceroid lipofuscinosis (NCL). The goal of the present study was to examine the expression in NCL brain tissue of one of the serine proteinase inhibitors, alpha 1-antichymotrypsin. Our study was based on previous findings of alpha 1-antichymotrypsin association with CNS amyloidoses related to amyloid beta protein deposits and our previous findings suggesting abnormal processing of amyloid beta-protein precursor (ABPP) in NCL brains. Immunocytochemical study was performed on formalin-fixed brain tissues collected from 15 NCL cases representing four different forms of the disorder and from 16 control cases comprising age-matched controls, older nondemented individuals, and Alzheimer disease cases. Our present study has shown that the expression of alpha 1-antichymotrypsin is generally higher in NCL cases than in control cases; however, it manifests in distinct variations of intensity and proportions of immunostained cells. The strongest immunoreactivity was found in the infantile form of NCL, which is characterized by a rapid clinical course and widespread tissue damage. We found no evidence of direct involvement of alpha 1-antichymotrypsin in either the ceroid lipopigment accumulation or the abnormal processing of ABPP in NCL. However, our findings may reflect the heterogeneity of the pathomechanism underlying this group of disorders and suggest that, similarly to blood circulation, alpha 1-antichymotrypsin can also represent an acute-phase protein in brain tissue.     

骨髓间充质干细胞中突变型人低氧诱导因子1α真核表达载体的表达

背景：转基因小鼠体内实验证实,重组的低氧诱导因子1α可以促进皮肤形态功能正常的血管新生。 目的：构建能够在常氧条件下同时表达突变型低氧诱导因子1α目的蛋白和绿色荧光蛋白报告分子的新型腺病毒真核表达载体,并转染SD大鼠骨髓间充质干细胞,检测该基因在细胞中的表达情况。 方法：利用Lipofectamine 2000介导将构建成功的重组腺病毒真核表达载体pAd-HIF1αmu- IRES-hrGFP-1转染HEK293A细胞,包装病毒,以最佳感染指数=50将重组腺病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞,并设3个对照组,即阳性对照组：转染Ad-CMV-HIF1α-IRES-hrGFP-1;阴性对照组：转染Ad-CMV-IRES-hrGFP-1组;空白组：未转染病毒。 结果与结论：①腺病毒载体成功转染HEK293A细胞,包装成功,细胞内有大量绿色荧光表达。②转染突变型低氧诱导因子1α腺病毒表达载体的细胞在常氧条件下蛋白表达量明显高于转其他3组,3个对照组间差异无显著性意义(P > 0.05)。提示突变型腺病毒真核表达载体Ad-HIF1α-IRES-hrGFP-1在HEK293A内成功包装;突变后低氧诱导因子1α基因能够在常氧条件下大量且高效表达。     

睾酮干预雄兔膝骨关节炎软骨中胰岛素样生长因子1的表达*

背景：睾酮对骨关节炎的作用尚无一致的观点,其调节软骨代谢的作用鲜有文献报道。目的：观察睾酮对膝骨关节炎雄兔关节软骨中胰岛素样生长因子1表达的影响。 方法：24只雄兔随机分成4组,采用改良Hulth法建立右膝骨关节炎模型;假去势组不切除睾丸,其余3组切除双侧睾丸。第8周末处死假去势组和去势8周组兔取材。第9周开始,激素组肌注生理剂量十一酸睾酮(6 mg/kg, 2周1次),去势16周组正常喂养,并于16周末处死并取材。结果与结论：大体和组织学观察显示各组兔膝关节软骨的病变程度为假去势组优于去势8周组,激素组优于去势16周组。免疫组化染色显示胰岛素样生长因子1在所有兔膝关节软骨中均有表达,阳性细胞个数假去势组高于去势8周组(P < 0.05),激素组高于去势16周组(P < 0.05),去势8周组与去势16周组差异无显著性意义(P > 0.05)。说明睾酮可通过上调去势雄兔关节软骨中胰岛素样生长因子1的表达,延缓软骨退变。