DNA去甲基化对大鼠骨髓间充质干细胞增殖细胞核抗原的调节

背景：DNA去甲基化是一种重要的表观遗传修饰。 目的：观察DNA去甲基化对骨髓间充质干细胞增殖及增殖细胞核抗原蛋白表达的影响。 方法：全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,免疫组化法鉴定骨髓间充质干细胞CD44和CD45蛋白的表达,MTT法检测5-杂氮胞苷对骨髓间充质干细胞增殖的影响,免疫组化法检测5-杂氮胞苷对骨髓间充质干细胞增殖细胞核抗原蛋白表达的影响。 结果与结论：①第3代骨髓间充质干细胞不表达或低表达CD45,高表达CD44。②与未加入5-杂氮胞苷组比较,5-杂氮胞苷干预48 h,6,12,24 μmol/L组显著促进细胞增殖活性(P < 0.05),无浓度依赖性。③与未加入5-杂氮胞苷组比较,5-杂氮胞苷干预48 h,6,12,24 μmol/L 组增殖细胞核抗原蛋白积分吸光度值显著增加 (P < 0.05),组间差异无显著性意义。结果显示在一定浓度范围内,5-杂氮胞苷发挥去甲基化作用,激活增殖细胞核抗原蛋白表达,从而促进骨髓间充质干细胞增殖。     

体外模拟心肌环境诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化★

目的：以往研究将长有一层心肌细胞的半透膜放于骨髓间充质干细胞培养皿中，或用培养过心肌细胞的培养基来培养骨髓间充质干细胞，均未发现心肌细胞特异蛋白表达。为此体外模拟心肌微环境诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化，并与常规诱导剂5-氮杂胞苷的诱导效果进行比较。 方法：实验于2007-03/09在山西医科大学中心实验室完成。①动物：Wistar大鼠20只，新生1 d龄Wistar乳鼠10只，均由山西医科大学动物房提供，清洁级，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。诱导剂5-氮杂胞苷为美国Sigma公司产品。②实验方法：自新生Wistar乳鼠心脏分离培养心肌细胞，取第1、2代制成1×109 L-1细胞悬液，-70 ℃放置4~5 h后融化，吸管吹打，反复3次，离心取上清，过滤后即为心肌细胞冻融液，以此作为培养基体外模拟心肌微环境。自成年Wistar大鼠骨髓分离骨髓间充质干细胞，取生长良好的第2代制成1×108 L-1细胞悬液，分为4组：血清对照组加入含15％胎牛血清的DMEM/F12培养基；5-氮杂胞苷组加入10μmol/L 5-氮杂胞苷37 ℃避光孵育24 h后，换DMEM/F12培养基继续培养；5-氮杂胞苷+心肌细胞冻融液组加入10μmol/L 5-氮杂胞苷诱导24 h后，在培养体系中加入相当于4倍骨髓间充质干细胞数量的心肌细胞冻融液；心肌细胞冻融液组加入相当于4倍骨髓间充质干细胞数量的心肌细胞冻融液。③实验评估：诱导1周后观察骨髓间充质干细胞的形态变化，利用免疫细胞化学技术鉴定心肌特异性肌钙蛋白T、连接蛋白43、α-横纹肌肌动蛋白、CD31的表达情况。 结果：①体外模拟心肌微环境情况：培养7 d时心肌细胞形成细胞簇或细胞单层，呈放射状排列的同心圆状或峰谷样生长，细胞簇搏动呈明显同步性。传代后的心肌细胞仍具有自主收缩的特性。②骨髓间充质干细胞的体外诱导结果：诱导处理1周后，5-氮杂胞苷组多数细胞呈杆状，紧密平行排列生长，细胞体积变大，可见肌丝样结构形成；心肌细胞冻融液组细胞有聚集生长趋势，形成大量的子细胞，可见大量的肌丝样的结构；5-氮杂胞苷+心肌细胞冻融液组脱落或降解的细胞数明显少于5-氮杂胞苷组，也形成肌丝样结构，但部分细胞内有脂肪空泡形成。③免疫细胞化学鉴定结果：诱导培养1周后，血清对照组仅表达α-横纹肌肌动蛋白；5-氮杂胞苷组表达心肌特异性蛋白T、α-横纹肌肌动蛋白、连接蛋白43，其阳性率分别为20%，28%，25%，抗CD31染色呈阴性；心肌细胞冻融液组上述蛋白阳性表达率分别为23%，32%，28%，明显高于5-氮杂胞苷组（P < 0.05），同时抗CD31染色呈阳性；5-氮杂胞苷+心肌细胞冻融液组上述蛋白阳性表达率略低于心肌细胞冻融液组，抗CD31染色呈阳性。 结论：①以心肌细胞冻融液体外模拟心肌微环境，可高效诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞。②部分骨髓间充质干细胞表达CD31，即可向血管内皮细胞分化，提示与5-氮杂胞苷单一的肌细胞诱导作用相比，心肌细胞冻融液更能提供一个心肌再生所需的自然条件。     

同种异体骨髓间充质干细胞移植对大鼠急性心肌梗死后Cx43、Cx45mRNA表达的影响

背景：细胞移植可以修复受损的心肌组织,但移植细胞是否和宿主细胞形成有效的电-机械偶联,并引起移植后细胞缝隙连接蛋白重构及心律失常等尚缺乏系统观察。目前只有少数研究发现心肌梗死后缝隙连接蛋白45表达上调,而对于骨髓间充质干细胞移植后缺血区缝隙连接蛋白45的表达尚无报道。 目的：课题组假设通过改变缝隙连接蛋白水平、干预异常的GJ通道,来尝试治疗心肌梗死后心律失常,为此探讨同种异体骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死大鼠缝隙连接蛋白43及缝隙连接蛋白45 mRNA表达的影响。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2008-01/2009-05在广西医科大学实验中心完成。 材料：健康Wistar大鼠180只,随机分为正常对照组、假手术组、心肌梗死组、细胞移植组,45只/组。各组按干预后4,8,12周又分为3个亚组,15只/亚组。另取1月龄健康雄性Wistar大鼠20只,用于分离培养骨髓间充质干细胞。 方法：取传至第3代的大鼠骨髓间充质干细胞,加入10 μmol/L 5-氮胞苷进行诱导,4周后用于移植,在移植前2 h行DAPI标记。心肌梗死组、细胞移植组大鼠建立急性心肌梗死模型,假手术组只穿线不结扎冠状动脉。造模后7 d,细胞移植组将2×1010 L-1骨髓间充质干细胞悬液分多点注射到心肌梗死的边缘区和中心区,心肌梗死组、正常对照组、假手术组均注射等量生理盐水。 主要观察指标：荧光定量PCR法检测缝隙连接蛋白43及缝隙连接蛋白45 mRNA的表达。 结果：①干预后4,8,12周,各组正常区缝隙连接蛋白43、缝隙连接蛋白45 mRNA表达基本相似。②与正常区比较,心肌梗死组、细胞移植组缺血区的缝隙连接蛋白43 mRNA表达均显著减少(P < 0.01),缝隙连接蛋白45 mRNA表达均显著增加(P < 0.01)。③同一时间点与心肌梗死组比较,细胞移植组缺血区缝隙连接蛋白43 mRNA表达显著增高(P < 0.01),缝隙连接蛋白45 mRNA表达显著减少(P < 0.01)。 结论：课题创新性证实急性心肌梗死导致心肌缝隙连接蛋白43 mRNA水平下降,缝隙连接蛋白45 mRNA水平升高。5-氮胞苷诱导的同种异体骨髓间充质干细胞移植后,能上调梗死边缘区缝隙连接蛋白43 mRNA的表达,并下调边缘区缝隙连接蛋白45 mRNA的表达。     

骨髓间充质干细胞体外诱导培养后的电生理特性

背景：骨髓间充质干细胞在宿主心肌中能够生长,并可在心肌环境诱导下分化,改善心脏功能,但目前骨髓干细胞分化过程中生物学特性尚不甚清楚。 目的：观察经5-氮胞苷诱导培养后,骨髓间充质干细胞体外缝隙连接蛋白43的表达及电生理特性变化。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2007-07/2009-02在河北省人民医院心脏中心完成。 材料：2月龄雄性冀中白猪24只,购自河北医科大学实验动物中心。 方法：无菌条件下抽取猪双侧股骨骨髓,Percoll密度梯度法体外分离培养骨髓间充质干细胞,传至第2代后,加入10 μmol/L的5-氮胞苷,24 h后更换为不含诱导剂的DMEM培养基继续培养,分别于诱导后1,2,3周进行指标检测;并设立未经5-氮胞苷诱导的对照组。实验猪抽取骨髓后麻醉,取心室肌,组织块酶消化法分离培养正常心室肌细胞。 主要观察指标：ABC法免疫细胞化学染色检测缝隙连接蛋白43的表达,以膜片钳全细胞记录模式测定Ito电流密度及动作电位。 结果：5-氮胞苷诱导后1,2周,部分骨髓间充质干细胞表达缝隙连接蛋白43,呈核周散在分布的棕黄色颗粒;诱导后3周缝隙连接蛋白43阳性率为95%,细胞密度大的区域出现类似正常心肌的闰盘结构。在+80 mV时与正常心室肌细胞比较,未诱导对照组及诱导1,2周的骨髓间充质干细胞Ito电流密度均明显降低(P < 0.05),诱导3周的骨髓间充质干细胞Ito电流密度升高至正常心室肌细胞水平(P > 0.05)。5-氮胞苷诱导1,2周的骨髓间充质干细胞未能检测到动作电位,诱导3周后可检测到动作电位,与正常心室肌细胞相似。 结论：骨髓间充质干细胞经5-氮胞苷体外诱导3周后,与正常心肌具有相似的缝隙连接蛋白43表达能力及电生理特性。     

hTERT正、反义表达载体转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的研究提高和阻断端粒酶活性对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖及分化的影响。方法采用直接贴壁法分离、培养SD大鼠BMSCs,流式细胞仪检测BMSCs表面标记。阳离子脂质体介导hTERT正、反义表达载体转染BMSCs,RT-PCR和免疫组化方法检测TERT表达,并对转染前后BMSCs的生长增殖能力、神经细胞方向的分化能力和大鼠颅内移植存活情况进行研究。结果大鼠BMSCs表面CD29、CD44、CD90阳性,CD31、CD34、CD45阴性,转染正义hTERT后BMSCs增殖速度明显提高,而其向神经元和星形胶质细胞诱导分化及异体海马移植后的存活能力未受影响,转染反义hTERT后BMSCs增殖速度减慢,5￣6周内死亡。结论BMSCs存在端粒酶低表达,提高或阻断端粒酶活性对BMSCs的增殖分别起到促进或抑制作用。     

经5-氮胞苷诱导后的骨髓间充质干细胞心肌移植后对心功能的影响

背景：骨髓间充质干细胞具有多分化潜能,但其在体外经5-氮胞苷诱导后移植于急性心肌梗死大鼠中,能否改善近期及远期的心功能,目前尚不明确。 目的：观察兔骨髓间充质干细胞移植入急性心肌梗死组织后对心功能的影响。 方法：分离培养兔骨髓间充质干细胞,5-氮胞苷诱导4周后,体外DAPI标记。新西兰兔随机均分3组,假手术组：打开胸腔1 h后缝合胸腔;骨髓间充质干细胞组：于冠状动脉结扎建立急性心肌梗死模型后1 h在梗死周边区用微量注射器分4点注射诱导后的自体骨髓间充质干细胞;急性心肌梗死组：造模后于相同部位注射等量生理盐水。移植后3 d,4周超声心动图检测各组大鼠左室舒张末期容积,左室收缩末期容积及射血分数变化。 结果与结论：荧光显微镜观察发现,骨髓间充质干细胞组移植后3 d,4周心脏标本中均发现有DAPI标记的阳性细胞,呈散在分布于瘢痕周边区并沿心肌纤维排列方向走行。移植后3 d,骨髓间充质干细胞组与急性心肌梗死组相比,左室舒张末期容积、左室收缩末期容积及射血分数无明显差异,心功能没有明显的改善;移植4周后,骨髓间充质干细胞组与急性心肌梗死组相比,射血分数明显提高,左室舒张末期容积、左室收缩末期容积明显降低。     

成肌分化因子和5-氮杂胞苷体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向骨骼肌细胞的分化

转位替代疗法,这样就造成了另一块肌组织的损伤。在这种背景下,作者设计了该课题,寻找肌肉原位修复的方法。目的：探讨大鼠骨髓间充质干细胞在体外诱导分化为骨骼肌细胞的条件。方法：分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞,应用5-氮杂胞苷、成肌分化因子、转化生长因子β1、胰岛素样生长因子1联合进行诱导,使之分化。在诱导后的第9天,收集细胞,免疫组织化学法对细胞进行鉴定。结果与结论：原代培养的骨髓间充质干细胞呈贴壁、集落样生长,5~7 d后有多突成纤维细胞、扁平多角形细胞、多角形细胞和三角形细胞。12 d后,见细胞融合,铺满瓶底,骨髓间充质干细胞的形态变化不明显。经5-氮杂胞苷诱导后细胞,起初部分细胞死亡,生长缓慢。7 d后见细胞明显生长,体积逐渐增大,呈椭圆形、梭形或不规则形状。14 d后,大量增殖的长梭形细胞开始增多。18~22 d后,肌管数量增多,体积增大,核数亦明显增多,初生肌管与长梭形成肌细胞呈平行排列,间隔分布。骨髓间充质/干细胞免疫组化法测定见CD44反应阳性,胞质呈棕褐颗粒,核周明显,CD34呈阴性反应。诱导后骨髓间充质干细胞免疫组化法测定见结蛋白、骨骼肌特异肌球蛋白均为阳性表达。结果提示在体外,成肌分化因子和5-氮杂胞苷可以诱导骨髓间充质干细胞向骨骼肌细胞定向分化,并伴有结蛋白和骨骼肌肌球蛋白阳性表达。     

5-氮胞苷诱导和未诱导骨髓间充质干细胞移植入梗死心肌后心功能变化的比较*☆

背景：已证实在体外经5-氮胞苷诱导后,骨髓间充质干细胞可向类心肌细胞转化,但移植这种经诱导的髓间充质干细胞是否更有利于急性心肌梗死后心功能改善,尚有争议。 目的：对比观察经5-氮胞苷诱导和未经诱导的骨髓间充质干细胞移植入急性心肌梗死组织后心功能的变化。 方法：开胸结扎左冠状动脉前降支建立新西兰兔急性心肌梗死模型,分别在心肌梗死组织周边区注射PBS,经5-氮胞苷诱导或未诱导的兔骨髓间充质干细胞。移植后3 d、4周超声心动图测定左室舒张末期容积,左室收缩末期容积及射血分数以评价心功能变化。 结果与结论：兔前降支结扎后,心功能明显下降;移植3 d后,各组动物左室舒张末期容积、左室收缩末期容积及射血分数均无显著差异,说明无论是否在体外经5-氮胞苷诱导过,骨髓间充质干细胞移植短期对兔心功能无明显改善;移植4周后,与注射PBS的动物比较,移植骨髓间充质干细胞可降低心肌梗死兔的左室舒张末期容积、左室收缩末期容积,提高射血分数,但骨髓间充质干细胞在体外是否经5-氮胞苷诱导对心功能改善程度无影响。     

端粒酶催化亚单位基因诱导人骨髓间充质干细胞的实验研究

目的利用端粒酶催化亚单位基因(h TERT)异位表达建立永生化人骨髓间充质干细胞(h MSCs)系。方法使用含有h TERT的重组质粒载体转染人原代骨髓间充质干细胞,经新霉素G418筛选,连续传代培养,通过形态学、免疫组织化学及PCR技术等方法对细胞系进行鉴定。结果转染后骨髓间充质干细胞基本保持了原代细胞的表型特征、形态均一、多为梭形,呈漩涡状或放射状排列,有特征性表型。细胞免疫组化染色显示有h TERT的表达。结论成功地构建了h TERT永生化的人骨髓间充质干细胞系,为其在神经系统疾病治疗中的应用奠定了实验基础。     

兔骨髓间充质干细胞体外向心肌样细胞诱导分化：缝隙连接蛋白43的

背景：骨髓间充质干细胞经过诱导因素刺激后,能够分化为心肌细胞,同时表达缝隙连接蛋白43,移植后可改善心功能或修复受损的心脏起搏传导系统。而缝隙连接蛋白43在维持心脏正常功能中发挥着重要作用。 目的：观察兔骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞过程中缝隙连接蛋白43的表达变化,及诱导后骨髓间充质干细胞间隙连接通讯功能的改变。 方法：采用Percoll非密度梯度离心法与贴壁法分离培养兔骨髓间充质干细胞,正常组不进行任何干预,诱导组加入5-氮胞苷向心肌样细胞诱导,免疫荧光及流式细胞仪检验细胞诱导前后缝隙连接蛋白43的表达。将原代培养1 d的乳鼠心肌细胞分别接种于上述两组细胞爬片上,免疫荧光观察兔骨髓间充质干细胞与心肌细胞形成间隙连接的情况。划痕试验设立正常组、诱导组以及添加甘草次酸的阻滞剂组,观察兔骨髓间充质干细胞诱导前后细胞间隙连接的功能变化。 结果与结论：正常组骨髓间充质干细胞缝隙连接蛋白43呈弱表达,5-氮胞苷诱导2,4周后缝隙连接蛋白43的表达均显著增加(P < 0.01),细胞间隙连接通讯功能明显增强(P < 0.001),且随诱导时间的延长呈依赖性增强(P < 0.05)。骨髓间充质干细胞与心肌细胞共培养后,诱导组缝隙连接蛋白43明显呈线状表达在两个相邻细胞的接触面。与诱导4周时比较,阻滞剂组细胞间隙连接通讯功能明显受到抑制(P < 0.001)。提示骨髓间充质干细胞能够自发表达缝隙连接蛋白43,在移植后早期能与心肌细胞形成间隙连接,从而有利于移植后心肌电传导,并发挥骨髓间充质干细胞的旁分泌效应。 关键词：缝隙连接蛋白43;间隙连接;5-氮胞苷;诱导;心肌细胞;骨髓间充质干细胞     

永生化人骨髓基质细胞的表面抗原及多向分化研究

目的研究本所转入人端粒酶逆转录酶基因的人骨髓基质细胞（hMSC—TERT细胞）的生物学特性。方法复苏hMSC—TERT细胞第30代，扩增，流式细胞仪检测细胞表面抗原；进行体外脂肪细胞、成骨细胞定向诱导，并分别进行油红O染色、碱性磷酸酶染色及von Kossa染色。结果hMSC—TERT细胞表面抗原检测CD34、CD5、CD44、CD106、CD166均为阴性；脂肪细胞定向诱导后油红O染色见胞浆内有红色脂肪颗粒，成骨细胞定向诱导后见胞浆内有碱性磷酸酶染色阳性黑褐色颗粒，von Kossa染色见有钙结节形成。结论hMSC—TERT细胞依然保留骨髓基质干细胞的自我更新特性及多向分化潜能。     

大鼠骨髓间充质干细胞的原代培养条件

背景：间充质干细胞适合生长、培养的条件尚不十分明确,目前对于间充质干细胞的分离纯化以及体外培养亦没有统一的方法,而培养出生长状态良好、数量足够多的大鼠骨髓间充质干细胞是进行以上实验的重要前提。 目的：寻求适宜有效的大鼠骨髓间充质干细胞体外培养条件,观察培养的间充质干细胞生物学特性。 设计、时间及地点：分组对比观察,实验于2007-04/09在重庆医科大学附属第一医院实验中心完成。 材料：6~8周龄雄性Wistar大鼠1只,体质量120 g,用于间充质干细胞的分离及培养。 方法：采用全骨髓培养法获取间充质干细胞,按不同接种密度(1×106,5×105,1×105,5×104,1×104 cm-2)、血清体积分数(体积分数5%,10%,15%的胎牛血清)、首次换液时间(接种后6,12,24,48,72 h)及pH值(分别为7.0~7.1,7.1~7.2,7.2~7.3,7.3~7.4,7.4~7.5)分组接种,10 d后进行活细胞计数。 主要观察指标：不同培养条件对间充质干细胞生长的影响;倒置显微镜下观察原代及传代间充质干细胞的形态变化;采用四甲基偶氮唑盐法绘制细胞的生长曲线,并计算细胞倍增时间;常规SABC免疫组织化学法检测传代间充质干细胞CD44、CD34的表达;流式细胞仪检测传代间充质干细胞生长周期。 结果：①以1×106,5×105 cm-2密度接种的细胞数较多,余3种接种密度获得细胞数明显低于上述2种密度(P < 0.05)。首次换液时间为48 h获得的细胞数量最多,各组间相比,差异有显著性意义(P < 0.05)。体积分数5%血清组较体积分数10%、15%血清组细胞数量少(P < 0.05)。pH值为7.1~7.2,7.2~7.3的培养液细胞生长活跃,细胞数量多,以pH值为7.0~7.1和pH 7.4~7.5培养的细胞生长缓慢,数量较少。②刚接种的间充质干细胞呈圆形,培养6~8 h后开始贴壁,呈纺锤状或类圆形;约10 d左右细胞基本汇合长满瓶底;传代后,细胞形态以梭形为主;经过一二次传代后,细胞呈放射状或平行排列,形态趋于一致。③传代一二天细胞生长缓慢,生长停滞期;自3 d起,细胞生长进入对数生长期,四五天达到高峰;之后进入平台期,细胞倍增时间约为39.5 h。④传代间充质干细胞存在CD44抗原表达,而CD34呈阴性表达。⑤传代后82.93%的间充质干细胞处于G0/G1期,G2+M+S期细胞占17.07%。 结论：细胞较佳接种密度为5×105 cm-2,合适血清体积分数为10%,首次换液时间为48 h,pH值为7.2左右;在适宜的培养条件下,间充质干细胞在体外生长状态良好,增殖速度快。     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

背景：骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极低,体外培养难度较大。体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞,对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要。 目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化方法,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。 方法：通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,细胞周期分析,流式细胞仪检测细胞表面标记物,分别向成骨、成脂方向诱导分化。 结果与结论：大鼠骨髓间充质干细胞生长以梭形细胞为主,呈放射状排列的细胞集落,细胞生长旺盛,可连续稳定传代10代以上。生长曲线及细胞周期显示骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特征且生长活跃。第3代骨髓间充质干细胞CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34,CD45呈阴性表达。成脂、成骨诱导后,油红O染色、碱性磷酸酶染色、von Kossa法染色和茜素红染色均呈阳性。全骨髓贴壁培养法操作简单,可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能。实验所用的全骨髓贴壁法法为组织工程提供充足的种子细胞来源具有重要的现实意义。     

低氧环境对骨髓间充质干细胞诱导分化的影响☆

目的：目前公认肾上腺素能β1受体含量和环磷酸腺苷水平在心肌细胞处于低氧状态时会发生改变，然而诱导分化的骨髓间充质干细胞经慢性低氧作用后能否表现与心肌细胞相同的特性还未知，故检测其β1受体mRNA表达及第二信使环磷酸腺苷活性变化。 方法：实验于2006-02/2007-04在华中科技大学同济医学院附属协和医院心研所实验室完成。①动物：清洁级成年昆明小鼠10只，新生1 d龄昆明小鼠40只，均购自华中科技大学同济医学院实验动物中心，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：成年小鼠麻醉后于肱骨及胫骨骨折处吸取适量骨髓，加入含15%胎牛血清、100 U/mL青霉素G、80 U/mL链霉素的IMDM培养基，贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞。将新生鼠处死迅速取心脏，用Ⅱ型胶原酶消化离心，将生长较好的第1、2代心肌细胞制成1×109 L-1细胞裂解液，体外模拟心肌微环境诱导分化骨髓间充质干细胞。设立2组，空白对照组仅加入IMDM培养基，实验组加入IMDM培养基和心肌细胞裂解液，隔天换液，继续培养1周后又分为4个亚组：常氧组，常氧不加药物作用72 h；低氧组，用1%氧浓度作用72 h；异丙肾上腺素组，用1×10-5 mmol/L异丙肾上腺素作用72 h；低氧+异丙肾上腺素组，用1%低氧和1×10-5 mmol/L异丙肾上腺素联合作用72 h。③实验评估：RT-PCR法检测骨髓间充质干细胞β1受体mRNA水平，放射免疫法测定骨髓间充质干细胞环磷酸腺苷的活性。 结果：①骨髓间充质干细胞β1受体mRNA水平的表达：空白对照组不表达β1受体mRNA。作用72ｈ后，常氧组表达β1受体mRNA，低氧组β1受体mRNA水平升高100%，异丙肾上腺素组、低氧+异丙肾上腺素组β1受体mRNA水平均降低40%。②骨髓间充质干细胞环磷酸腺苷活性检测：与常氧组比较，低氧组环磷酸腺苷活性无明显变化（P > 0.05）；异丙肾上腺素组环磷酸腺苷活性下降35%（P < 0.05）；低氧+异丙肾上腺素组与异丙肾上腺素组水平相当（P > 0.05）。 结论：①采用心肌细胞裂解液体外模拟心肌微环境诱导分化的骨髓间充质干细胞表达β1受体。②单纯低氧作用可明显升高骨髓间充质干细胞β1受体mRNA水平，环磷酸腺苷活性无变化。经异丙肾上腺素作用后，低氧环境无法显著改变β1受体mRNA水平和环磷酸腺苷活性。     

含GDNF基因真核载体的构建及其在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建含GDNF基因真核表达载体,并分析其在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达。方法从SD大鼠脑中提取总RNA,采用逆转录PCR法扩增GDNF基因,测序鉴定后将GDNF基因克隆入p CDNA3.1中,构建真核表达载体p CDNA3.1-GDNF;原代培养大鼠间充质干细胞,以脂质体介导法将构建好的真核表达载体p CDNA3.1-GDNF转染至间充质干细胞;RT-PCR、细胞免疫荧光、Western blot检测GDNF在间充质干细胞中的表达。结果扩增的大鼠GDNF基因序列与Gen Bbank的参考序列完全一致,GDNF基因已经正确克隆到真核表达载体p CDNA3.1中;转染骨髓间充质干细胞4 h后,GDNF的mRNA和蛋白能在细胞中正确表达。结论 p CDNA3.1-GDNF真核表达载体构建成功,并能在大鼠间充质干细胞中正确表达,这为下一步研究携带GDNF的骨髓间充质干细胞治疗癫痫奠定了实验基础。     

大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞诱导分化及神经蛋白的动态表达

背景：现阶段骨髓间充质干细胞定向诱导分化为神经元样细胞的方法并不统一。 目的：探讨大鼠骨髓间充质干细胞体外向神经样细胞诱导分化的条件，及其定向分化过程中神经蛋白的动态表达。 设计、时间及地点：细胞形态学观察及蛋白分子水平检测，于2006-09/2007-01在苏州大学生命科学学院完成。 材料：清洁级SD大鼠2只。胎牛血清为杭州四季青产品，成纤维生长因子、丁羟基茴香醚为Sigma公司产品，二甲基亚砜为Amresco产品。 方法：Percoll法体外分离培养、扩增纯化大鼠骨髓间充质干细胞，调整细胞密度为5×107 L-1。设立2组，诱导组用含10%胎牛血清和10 μg/L成纤维生长因子的L-DMEM培养基预诱导24 h后，再以含2%二甲基亚砜和200 μmol/L丁羟基茴香醚的L-DMEM无血清培养基诱导1，3，5 h。对照组始终用含10%胎牛血清的L-DMEM进行培养。 主要观察指标：细胞形态学变化，免疫荧光染色鉴定神经细胞表型。 结果：预诱导24 h，胞体由原来的长梭形变成多角形或不规则形，伸出多个短棒状突起，可见2~3个核仁，细胞间漩涡状生长趋势消失，排列无规律；诱导1~3 h，细胞逐渐变圆，胞质收缩明显，折光性增强，双级或多极的突起互相连接呈网状；诱导5 h，突起出现一、二级分支。诱导1 h后部分细胞表达神经前体细胞表面抗原巢蛋白；3 h后巢蛋白达高峰，同时表达成熟神经元标志物神经元特异性烯醇化酶和微管蛋白；5 h后巢蛋白表达下降，神经元特异性烯醇化酶和微管蛋白达高峰。对照组细胞形态无明显变化，巢蛋白表达为阴性。 结论：在添加化学诱导剂之前先使用成纤维生长因子进行预诱导，能促进骨髓间充质干细胞向神经前体细胞和神经元转化，且在诱导分化过程中神经蛋白分子的表达顺序与神经细胞发育过程一致。     

重组腺病毒Ad-LMP-1感染大鼠骨髓间充质干细胞

背景：LIM矿化蛋白1 (LIM Mineralization protein, LMP-1)是一种细胞内非分泌蛋白,可以通过招募众多的成骨因子共同参与成骨细胞的分化。LMP-1在成骨上游水平发挥的强大作用提示了其在骨骼重建方面具有巨大的应用潜力。 目的：观察重组腺病毒Ad-LMP-1感染骨髓间充质干细胞的效果,及对其分化的影响。方法：大鼠骨髓间充质干细胞分离培养,传代后,检测特异性标记物CD44的表达情况,矿化液诱导细胞成骨分化后用茜素红染色鉴定。感染重组腺病毒Ad-LMP-1后通过观察绿色荧光蛋白表达情况计算转染效率,RT-PCR及Western blot验证感染效果,观察感染Ad-LMP-1 2,7,14 d后骨髓间充质干细胞的形态变化和对细胞增殖活力的影响。结果与结论：传代细胞形态一致,排列紧密。矿化液诱导后,细胞形态明显改变。茜素红染色结果表明,诱导后出现钙化结节。观察绿色荧光蛋白信号表明重组病毒Ad-LMP-1感染骨髓间充质干细胞效率在85%左右。感染重组腺病毒Ad-LMP-1后第7天出现了细胞形态改变,14 d出现类钙化结节,但不伴有细胞增殖活力改变。结果提示重组腺病毒Ad-LMP-1可以有效地感染原代培养的骨髓间充质干细胞,并诱导其向成骨细胞分化。     

人端粒酶催化亚基基因转染大鼠颅神经嵴干细胞向永生化细胞的转变

背景：颅神经嵴干细胞可以作为颌面部各种组织和器官分化研究的重要细胞来源，如何使其获得永生化具有重要意义。人类细胞自发永生化的频率非常低，而一些永生化的基因可以显著增加这种频率。 目的：观察人端粒酶催化亚基基因在大鼠颅神经嵴干细胞永生化过程中的作用。 设计、时间及地点：观察性实验，于2007-09/2008-06在解放军第四军医大学完成。 材料：选择清洁级孕8.5 d SD大鼠3只，6周，体质量180 g；先天性细胞免疫缺陷动物雄性Balb/c裸小鼠，体质量18~21 g，均由解放军第四军医大学实验动物中心提供。质粒PCIneo-hTERT由解放军第四军医大学口腔医院牙体牙髓科提供。 方法：原代培养大鼠颅神经嵴干细胞后，将含有人端粒酶催化亚基基因的质粒PCIneo-hTERT转入大鼠颅神经嵴干细胞，经G418筛选后扩增，并连续培养。采用免疫细胞化学法观察转染细胞内人端粒酶催化亚基基因和颅神经嵴干细胞的特异标志物P75的表达，检测细胞的端粒酶活性，绘制细胞生长曲线观察其增殖能力，并通过裸鼠移植实验了解转染细胞的特性。 主要观察指标：细胞克隆、特异性蛋白P75表达、端粒酶活性、增殖能力及致瘤性实验结果。 结果：①质粒PCIneo-hTERT转染细胞后24 h，有少量细胞死亡。加G418后48 h，细胞逐步开始大量死亡。12 d后出现抗性细胞克隆，共有3个细胞克隆生长良好。分别命名为克隆1、2、3。克隆1和克隆2经过20~25代的传代后，细胞发生衰老、死亡；而克隆3在体外长期培养条件下生长状态良好，稳定表达人端粒酶催化亚基和P75。经转染后颅神经嵴干细胞的端粒酶活性明显升高，且能持续表达。②人端粒酶催化亚基基因转染后，3个细胞克隆在初期的增殖能力较强，随后克隆1、2的增殖速度逐渐变慢，出现死亡，克隆3越过衰老期，且无致瘤性。 结论：人端粒酶催化亚基基因转染大鼠颅神经嵴干细胞后，细胞得以永生化，其表型稳定，可作为颅颌面部细胞分化和组织工程研究的种子细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞表达心肌基因表型的时间依赖效应

背景：前期实验已经证实30%心肌培养上清是诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的最佳浓度。 目的：在前期实验基础上,观察30%心肌培养上清条件下诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的时间依赖效应。 设计、时间及地点：对比观察,于2007-08/2008-06在徐州市心血管病研究所完成。 材料：健康成年SD大鼠,体质量180~220 g。 方法：分离大鼠骨髓间充质干细胞和心肌细胞并在体外培养纯化。以1×108 L-1的细胞密度种植心肌细胞,培养72 h后收集上清。将骨髓间充质干细胞的DMEM/F12培养基换为含有30%M199心肌细胞培养上清作为实验组,对照组仍将细胞接种在DMEM/F12培养基上继续培养。 主要观察指标：30%心肌细胞培养上清诱导7,14,21 d后,应用免疫细胞化学技术检测骨髓间充质干细胞中α-平滑肌肌动蛋白、β-肌动蛋白和心肌特异性肌钙蛋白T的表达。 结果：30%心肌细胞培养上清诱导骨髓间充质干细胞后,细胞的形态没有改变,但与对照组相比,α-平滑肌肌动蛋白、 β-肌动蛋白和心肌特异性肌钙蛋白T的表达均呈阳性,其中以第14天的蛋白表达量最高(P < 0.01)。 结论：30%心肌细胞培养上清诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的最佳诱导时间是14 d。 关键词：骨髓间充质干细胞;心肌微环境;分化;心肌样细胞