人下颌下腺干/祖细胞的分离及培养

近年来国内外学者研究证实了唾液腺组织中的确存在一类具有成体干细胞特性的唾液腺细胞,但是这类干细胞的研究多集中在动物的唾液腺,而人类唾液腺干细胞的生物学特征研究较少。 目的：体外分离、培养人唾液腺干/祖细胞,并观察其生物学特征。 方法：从流产胎儿下颌下腺中分离、单克隆培养获得人唾液腺干/祖细胞,应用免疫荧光染色方法检测上皮细胞标志CK19,Laminin的表达,流式细胞术检测CD29,CD90.1和 CD117的表达。绘制人唾液腺干/祖细胞生长曲线,评价体外增殖能力。 结果与结论：人唾液腺干/祖细胞胞浆表达上皮细胞标志CK19及Laminin;流式细胞术结果显示,CD90.1,CD29及CD117的表达率分别为99.69%,98.83%及67.27%;体外培养也表现出高增殖能力、克隆形成能力和较高的传代数等组织干细胞特性。提示人胎儿下颌下腺中能分离出具有组织干细胞特性的细胞。     

含IKVAV两亲性肽自组装凝胶二维诱导神经干细胞分化的研究

目的：将鼠神经干细胞(NSCs)接种于含IKVAV两亲性肽自组装凝胶表面,观察其对细胞分化影响。 方法：机械分离法从乳鼠大脑皮层获取细胞,免疫组织化学鉴定;1wt%两亲性肽溶液在DMEM/F12触发下自组装为三维多孔凝胶,TEM观察凝胶结构;1×105/ml NSCs悬液分别接种于凝胶表面（实验组,EG）及多聚赖氨酸包被的盖玻片表面(对照组,CG)培养两周,免疫细胞化学染色鉴定。 结果：分离的细胞为Nestin 阳性的NSCs,可分化为NSE阳性神经元及GFAP阳性胶质细胞;TEM示凝胶由纳米纤维构成,纤维直径有3～5纳米,长度100纳米～1500纳米;培养7天后,实验组可观察到细胞长出突起, 可发现NF（+）神经元样细胞,标记为红色荧光, GFAP（+）胶质细胞样细胞,标记为绿色荧光;对照组仅形成未分化细胞球,Nestin(＋),标记为绿色荧光。 结论：含IKVAV肽自组装三维凝胶与NSCs有良好的细胞相容性,可诱导NSCs分化为神经元及胶质细胞。     

腺体组织损伤后体外分离下颌下腺干/祖细胞后的克隆化培养**

背景：体外构建组织工程化人工涎腺需获得分化增殖良好、数量充足的种子细胞，但正常下颌下腺中很难分离出成体干细胞。 目的：利用腺体组织损伤动物模型体外分离下颌下腺干/祖细胞，并进行克隆化培养。 设计、时间和地点：细胞学体外观察，于2006-03/2007-01在遵义医学院贵州省细胞工程实验室完成。 材料：8周龄雄性SD大鼠10只，由解放军第三军医大学动物中心提供。 方法：10只大鼠采用结扎下颌下腺主导管、抑制腺体分泌来建立组织损伤模型，1周后切取腺体组织，酶消化法体外分离下颌下腺干/祖细胞，原代培养10~14 d后，挑取培养皿中形成的小的类圆形、类上皮细胞集落予以纯化，传代后进行单克隆培养。 主要观察指标：下颌下腺干/祖细胞免疫细胞化学染色及免疫荧光染色结果，通过绘制生长曲线分析下颌下腺干/祖细胞体外增殖能力。 结果：实验获得表达层粘蛋白的细胞具有干细胞特征，CD29呈阳性表达表明其具有高黏附、高增殖等组织干细胞特性，角蛋白19的阳性表达提示下颌下腺干/祖细胞呈上皮源性。其生长曲线近似“S”形，体外培养增殖活跃。 结论：实验结果显示，下颌下腺干/祖细胞具有组织干细胞的特征，有望成为组织工程化人工涎腺构建的一类种子细胞来源。     

β-淀粉样蛋白致胚胎鼠大脑神经干细胞凋亡作用的研究

目的 探讨β-淀粉样蛋白（amyloid-β protein，Aβ）对胚胎鼠神经干细胞凋亡作用的影响。方法 体外培养7d的胚胎鼠神经干细胞．分为正常对照组和实验组，实验组根据Aβ1-40作用终浓度的不同，又分为0．1，1．0，5．0．10．0和20．0μmol／L等5个亚组，分别培养12h、24h、48h及72h。然后经四唑盐实验筛选Aβ1-40致神经干细胞发生凋亡的最佳浓度，再与神经干细胞共同培养。通过Annexin-V磷脂酰丝氨酸荧光标记染色法规察神经干细胞早期凋亡情况；用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术（TUNEL）进行染色，观察神经干细胞中晚期凋亡情况。结果（1）经四唑盐筛选实验确定，以终浓度为5．0μmol／L的Aβ1-40。作为β-淀粉样蛋白致神经干细胞发生凋亡的最佳诱导剂量。（2）神经干细胞与Aβ1-40（5.0μmol／L）共同培养至6h时，神经下细胞发生早期凋亡，细胞内出现大量绿色荧光标记物，而对照组则未见绿色荧光标记物。（3）神经干细胞与Aβ1-40（5．0μmol／L）共同培养24h时，神经于细胞发生中晚期凋亡，细胞内可见绿色荧光标记物。结论β-淀粉样蛋白可导致胚胎鼠大脑神经干细胞发生凋亡。     

胚胎干细胞在可降解聚合三维支架上的生长增殖与分化*

目的：三维可降解生物材料是组织工程的重要载体，观察胚胎干细胞在聚合三维支架上的生长、增殖和分化状态，为胚胎干细胞分化形成任何组织修复替代治疗机体组织器官的损伤和功能衰竭提供实验学依据。 方法：实验于2007-05/09在解放军第三军医大学西南医院感染病研究所人工肝实验室完成。①材料：鼠胚胎干细胞CCE株为加拿大Stem Cell Technologies公司产品，由聚乳酸和聚乙醇酸聚合而成的非编织型三维支架为美国Synthecon公司产品，细胞外基质Matrigel?由BD Biosciences公司提供。②实验方法：将鼠胚胎干细胞株接种于被覆明胶的培养瓶内，加入含0.1 mmol/L非必需氨基酸、2 mmol/L L-谷酰胺、0.1 mmol/L二羟基丙硫醇、15%胎牛血清、1 000 U/mL白血病抑制因子的IMDM培养液。3 d后采用“悬滴法”使细胞在不含白血病抑制因子的上述IMDM培养液中形成胚胎体，6 d后胰酶消化得到胚胎干细胞，浓度调整为（3~4）×109 L-1，与Matrigel? 按1∶1混合并接种于剪成5 mm×4 mm×1 mm小片的三维支架内，加入含1%二甲基亚酚、10-7 mol/L地塞米松、5 mg/L ITS、15%胎牛血清的IMDM培养液进行诱导分化。③实验评估：激光共聚焦显微镜观察胚胎干细胞在三维支架上的生长与增殖情况；应用荧光染色检测细胞活性；苏木精-伊红染色光镜下观察胚胎干细胞的组织分化情况。 结果：①细胞生长与增殖：接种培养1 d多数胚胎干细胞粘连在一起形成聚集体，状似球形，附着于三维支架的纤维上。7 d时聚集的胚胎干细胞开始沿纤维支架生长，互相粘连，呈片状和网状。细胞数随培养时间延长而不断扩大，至14 d细胞交织在一起呈现多层面立体景象，布满整个三维支架。②活细胞观察：接种培养1，7，14 d的胚胎干细胞绝大多数发出绿色荧光，始终保持良好的细胞活性。③胚胎干细胞的组织分化：在非特异诱导培养液作用下，胚胎干细胞可向原始血细胞样细胞、血管样结构、软骨样结构和腺样结构分化。 结论：胚胎干细胞能够附着于可降解聚合三维支架上生长增殖，并在保持细胞活性的情况下呈现向多细胞、多组织分化的良好态势。     

骨髓基质干细胞成骨分化过程中Wnt、骨形态发生蛋白2信号通路相关因子与辛伐他汀的作用*

背景：辛伐他汀可促进体外培养的人或鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化,但作用机制尚不清楚。 目的：观察辛伐他汀对大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化过程中Wnt与骨形态发生蛋白2信号途径中相关因子表达的影响。 方法：取6周龄雌性SD大鼠双侧股骨、胫骨全骨髓进行体外成骨细胞诱导培养。实验分为对照组及SIM组。SIM组加入浓度为10-7 mol/L辛伐他汀,对照组加入等量无水乙醇和PBS。培养14 d,行碱性磷酸酶染色,28 d时,行von Kossa染色观察细胞外基质矿化情况;培养14,21 d,免疫荧光细胞化学染色观察成骨细胞中β-catenin,Smad1/5,Cbfa1的表达及分布。 结果与结论：大鼠骨髓基质干细胞经体外诱导后可分化为具有碱性磷酸酶活性和矿化细胞外基质能力的成熟成骨细胞。辛伐他汀可显著上调骨髓基质干细胞成骨分化过程中碱性磷酸酶的表达。同时,与对照组比较,SIM组β-catenin,Smad1/5,Cbfa1表达明显增多(P < 0.05),且呈现明显的核内聚集趋势。说明辛伐他汀促进骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的作用可能与调控Wnt与骨形态发生蛋白2信号通路中相关因子的表达及细胞内分布有关。     

槐定碱通过Wnt/β-catenin信号通路抑制人胶质瘤U87细胞迁移、侵袭

目的 探讨槐定碱对人胶质瘤U87细胞迁移、侵袭能力的影响及其作用机制。方法 体外培养人胶质瘤U87细胞,加入槐定碱[0 mg/ml（对照组）,1.0 mg/ml,2.0 mg/ml,3.0 mg/ml]共培养24 h,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell小室实验检测细胞侵袭能力,免疫印迹法检测细胞β-catenin、E-cadherin、Vimentin和MMP-9蛋白表达,RT-PCR检测细胞Vimentin、MMP-9 mRNA表达。结果 槐定碱明显抑制U87细胞迁移、侵袭能力（P<0.001）,而且随浓度增加抑制作用明显增强（P<0.001）。槐定碱明显抑制U87细胞β-catenin蛋白、Vimentin和MMP-9 mRNA和蛋白表达（P<0.01）,明显增强E-cadherin蛋白表达（P<0.01）,而且随浓度增加抑制作用明显增强（P<0.01）。结论 槐定碱能抑制人胶质瘤U87细胞的迁移和侵袭,机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性,阻断细胞上皮间质转化过程。     

睾丸支持细胞对体外培养鼠胎脑皮质细胞的影响

背景：目前绝大多数研究者将目标指向功能细胞，为改善细胞的生存环境而给予一些生长因子。睾丸支持细胞能分泌大量营养物质及生长因子，且其所具有的Fas配体可降低移植入体内后宿主的免疫排斥。 目的：探讨睾丸支持细胞对体外培养鼠胚胎大脑皮质细胞的影响。 设计、时间及地点：细胞学体外观察实验，于2005-10/2007-09在首都医科大学生殖医学研究中心实验室完成。 材料：健康SPF级10~15 d龄雄性ICR小鼠40只，用于提取睾丸支持细胞；15 d龄胎鼠40只，用于提取大脑皮质细胞。 方法：将分离的大脑皮质细胞密度调整为2×109 L-1，分为2组：实验组接种于预铺有70%汇合传代的睾丸支持细胞培养瓶中，加入含体积分数为0.1的FBS、1×105 U/L青霉素、0.01 g/L链霉素的DMEM/F12完全培养基，置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度环境下培养17 d；对照组接种于预铺有0.05%多聚右旋赖氨酸的培养瓶中单独培养。 主要观察指标：采用免疫组织化学法、免疫细胞化学法、免疫细胞荧光法进行细胞鉴定，检测神经元、神经球数量及酪氨酸羟化酶阳性率。 结果：两组细胞神经元特异性烯醇化酶、巢蛋白、酪氨酸羟化酶均呈阳性表达。与培养2 h比较，随培养时间的延长两组贴壁神经元数均明显减少（P < 0.01），但实验组各时间点贴壁神经元数均明显多于对照组（P < 0.01）。实验组于培养3 d出现神经球，数量多且变化较快，7 d后开始呈现明显的下降趋势，至17 d神经球接近消失；对照组仅可见散在巢蛋白阳性表达细胞，未出现神经球。实验组酪氨酸羟化酶阳性细胞率随培养时间的延长而逐渐升高，至11 d达高峰，且各培养时间点酪氨酸羟化酶阳性细胞率均高于对照组（P < 0.01）。 结论：睾丸支持细胞可有效促进鼠胎脑皮质细胞的贴壁及生长，在促进神经干细胞增殖的同时诱导其向多巴胺能神经元分化。     

昆明鼠胚胎干细胞系的建立及其特性

背景：到目前为止,国际上通用的动物胚胎干细胞细胞系大多是从129品系和C57BL/6系小鼠中获得的,少部分来自BALB/C系,来自于中国昆明鼠则鲜有报道。 目的：分离培养昆明系小鼠胚胎干细胞,并对其生物学特性进行初步鉴定。 设计、时间及地点：以细胞为对象的观察性实验,于2006-05/2007-06在南昌大学第一附属医院泌尿外科研究所完成。 材料：昆明小鼠3.5 d胚龄的囊胚。 方法：自昆明系小鼠3.5 d胚龄的囊胚分离内细胞团细胞,接种于小鼠原代胚胎成纤维细胞饲养层上,对分离的内细胞团细胞进行扩增、传代培养。 主要观察指标：观察胚胎干细胞集落的生长情况,对其碱性磷酸酶表达进行染色分析,采用免疫荧光法检测其阶段特异性胚胎抗原1表达,以反转录-聚合酶链反应检测其特异性表达因子c-Myc,Nanog,Oct3/4和Sox2的基因表达情况,并对其体内外分化能力对进行鉴定分析。 结果：分离、培养自内细胞团的细胞呈典型的胚胎干细胞集落样生长,碱性磷酸酶染色及阶段特异性胚胎抗原1荧光染色阳性,细胞表达c-Myc,Nanog,Oct3/4和Sox2等基因,细胞在体内外均能分化成来源于不同胚层的多种细胞类型。 结论：成功从昆明小鼠囊胚中分离并建立一株胚胎干细胞系,其生物学特性与其他胚胎干细胞株相符。