转化生长因子β3诱导骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞

背景：转化生长因子β是一族多肽类生长因子，胚胎形成期可诱导原始的间充质干细胞分化形成软骨组织，有研究报道转化生长因子β3和碱性成纤维细胞生长因子可促进软骨细胞的代谢和增殖。 目的：验证转化生长因子β3体外诱导骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的可行性。 方法：骨髓来源于髋关节手术时的松质骨碎片或于下肢骨开放性手术时收集，分离培养骨髓间充质干细胞，鉴定其表面抗原，用含体积分数10%胎牛血清以及10 μg/L转化生长因子β3的条件培养基诱导，诱导后细胞通过软骨细胞特征性染色，即甲苯氨蓝染色以及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色鉴定。 结果与结论：骨髓间充质干细胞表面抗原CD73，CD90，CD105阳性，CD14，CD34，CD45，CD106以及HLA-DR阴性。诱导后细胞形态明显改变，甲苯氨蓝以及Ⅱ型胶原染色结果阳性。提示骨髓间充质干细胞在转化生长因子β3作用下，体外可分化为软骨细胞，可以作为组织工程种子细胞的一种有效来源。     

小鼠胚胎卵黄囊与成体间充质干细胞的比较：生物学特性相似吗？

背景：与成体间充质干细胞相比,来源于早期胚胎的卵黄囊间充质干细胞有更强的自我更新能力和可塑性,且在胚胎发育过程中可分化为成血管细胞和造血干细胞,启动胚胎血管发生和造血组织发育。 目的：探讨小鼠卵黄囊间充质干细胞的生物学特征。 设计、时间及地点：重复测量设计,细胞学体外观察,于2006-03/2007-01在首都医科大学组织学与胚胎学实验室完成。 材料：妊娠10 d的ICR小鼠80只,由首都医科大学动物部提供。 方法：显微分离ICR小鼠胚胎卵黄囊,经Ⅰ型胶原酶消化得到卵黄囊细胞,取贴壁细胞培养,于接近90%融合时按1∶2进行传代。取生长状态良好的第1代细胞,以地塞米松、胰岛素定向诱导卵黄囊间充质干细胞向脂肪细胞方向分化;以血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子体外诱导其向血管内皮细胞方向分化。 主要观察指标：相差显微镜下观察卵黄囊间充质干细胞形态;流式细胞仪检测卵黄囊间充质干细胞表面标志和细胞周期;钙钴法测定卵黄囊间充质干细胞碱性磷酸酶活性;细胞组织化学检测卵黄囊间充质干细胞化学变化;油红O检测诱导成脂能力;免疫荧光法鉴定诱导成血管内皮细胞能力。 结果：体外培养获得的小鼠卵黄囊间充质干细胞大多数呈梭形;原代和第1代细胞均为CD44,CD105阳性,CD34也有少量表达;67.4%细胞处于G0/G1期,13.9%细胞处于S期;P1代细胞碱性磷酸酶染色及苏丹黑B反应呈阴性,PAS染色呈阳性;成脂诱导1周后,胞浆中有脂滴形成,经油红O染色脂滴为鲜红色;成血管内皮细胞诱导后,细胞由原来梭形或多角形渐变为圆形或椭圆形,且内皮细胞标志物FLK1染色呈阳性。 结论：小鼠卵黄囊间充质干细胞的生物学特征与成体间充质干细胞相似。     

体外羊膜间充质干细胞分离培养及向神经元样细胞的分化

背景：胎盘组织作为寻找人类间充质干细胞的新来源,已成为备受人们关注的研究热点。从胎盘组织中羊膜层分离、培养细胞,因其来源广泛、不受伦理限制等优越性而具有广阔的应用前景。 目的：观察人羊膜间充质干细胞体外分离培养的方法,及向神经元样细胞分化的能力。 方法：用酶消化法从羊膜中分离和培养间充质干细胞,并通过形态的均一性及流式细胞术检测其表面标志以鉴定纯度。应用DMEM-LG+20 g/L DMSO+100 µmol/L BHA+10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子诱导分化,通过免疫荧光染色鉴定诱导后的细胞。 结果与结论：可从羊膜组织成功分离培养出间充质干细胞,细胞贴壁生长,在体外短期内可以稳定增殖和传代。具有与骨髓间充质干细胞相似的表面标志,体外可以诱导分化为神经元样细胞,胶质纤维酸性蛋白与神经元特异性烯醇化酶免疫荧光染色均为阳性。提示羊膜间充质干细胞可以在体外分离培养并诱导分化为神经元样细胞,羊膜组织可以作为干细胞研究以及神经组织疾病细胞治疗的一个全新的细胞来源。     

骨髓间充质干细胞体外诱导向内皮和上皮细胞的分化☆

背景：骨髓来源的间充质干细胞在体外具有多系分化潜能,但其在体外向肺组织细胞的分化能力尚存在争议。 目的：体外诱导验证小鼠骨髓间充质干细胞向内皮细胞和上皮细胞分化的能力。 方法：分离小鼠骨髓来源的间充质干细胞,以内皮诱导液向内皮细胞分化。另外将小鼠骨髓间充质干细胞分别在以下诱导培养基中进行上皮诱导3周：单纯上皮诱导培养液,上皮诱导培养液加10 μg/L 转化生长因子β1,并以未经诱导的小鼠骨髓间充质干细胞作为阴性对照,肺泡上皮作为阳性对照。 结果与结论：小鼠骨髓间充质干细胞在上皮诱导培养液中诱导培养3周后,部分细胞由梭形变为典型的卵石样上皮细胞形态,诱导后约60%细胞表达广谱上皮细胞标志pan-CK,RT-PCR结果显示分化后的细胞表达上皮细胞特异标志CK18,未经诱导的间充质干细胞未表达。小鼠骨髓间充质干细胞在内皮诱导24 h后即出现了典型的血管网状结构,vWF免疫荧光染色显示约70%的细胞呈阳性,RT-PCR显示分化后的细胞表达内皮细胞特异性标志CD31、vWF和CD34。提示骨髓来源的间充质干细胞体外诱导培养具有跨胚层多系分化能力。     

心脏瓣膜组织工程中理想种植细胞的来源比较

背景：现有的人工瓣膜,无论是机械瓣膜还是生物瓣膜,都存在与取材有关、无法从工艺制作方式改进解决的固有缺陷。组织工程心脏瓣膜概念的提出为解决该难题提供了新的方向。 目的：通过比较成熟分化血管内皮细胞和骨髓间充质干细胞骨的获取手段、体外增殖能力以及在脱细胞基质上的生长情况,分析何者更适合作为制备组织工程人工心脏瓣膜的种植细胞。 设计、时间及地点：单一样本观察,于2008-06/09在上海市胸科医院动物实验基地完成。 材料：用胰蛋白酶(胰酶)-EDTA、Triton X-100、DNase、RNase消化猪主动脉瓣膜获得脱细胞基质。从1只12 kg 2岁雄性杂交犬大隐静脉、股外侧动脉及肋骨骨髓获取种植细胞。 方法：用胰酶消化并收集内皮细胞,收集骨髓细胞,分别进行培养。通过贴壁法获得内皮细胞及骨髓间充质干细胞。利用内皮细胞生长因子诱导骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化,并绘制细胞生长曲线。以抗Ⅷ因子抗体以及抗血管内皮生长因子抗体荧光染色,荧光显微镜观察。将细胞种植于脱细胞瓣膜上培养3 d后进行扫描电镜观察。 主要观察指标：①试验犬伤口愈合情况。②细胞培养、增殖情况。③骨髓来源骨髓间充质干细胞表型分析以及形态学观察。 结果：成熟血管内皮细胞体外增殖能力低下,骨髓间充质干细胞则增殖旺盛。生长曲线显示骨髓间充质干细胞的倍增时间约30 h,而成熟内皮细胞生长曲线平直。对骨髓间充质干细胞进行抗Ⅷ因子抗体以及抗VEGF抗体荧光染色,可见荧光染色阳性。扫描电镜见种植骨髓间充质干细胞的脱细胞瓣膜上散在星状细胞贴附。 结论：骨髓间充质干细胞体外增殖能力强,在内皮细胞生长因子诱导下可向内皮细胞转化,并可以生长贴附于脱细胞瓣膜,是作为组织工程人工心脏瓣膜制备的理想细胞来源。     

大鼠骨髓间充质干细胞和内皮祖细胞的分离培养及鉴定

背景：骨髓间充质干细胞的分离和培养扩增至今缺乏统一的方法。内皮祖细胞可以由外周血或骨髓中的单个核细胞诱导分化而成,但因获取骨髓单个核细胞的方法各异,分离效果亦有较大差异。 目的：拟在体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞和内皮祖细胞,并对其进行鉴定。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-10/2009-02在安徽医科大学第一附属医院中心实验室完成。 材料：清洁级健康雄性SD大鼠2只,由安徽省动物中心提供。 方法：抽取大鼠骨髓,通过密度梯度离心法提取单个核细胞,采用差速贴壁法分离骨髓间充质干细胞。原代骨髓间充质干细胞培养48 h后,收集未贴壁细胞,加入含胎牛血清、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、重组人上皮生长因子的EGM-2完全培养液诱导骨髓间充质干细胞向内皮祖细胞分化。设立3组：分别为早期贴壁且普通培养的内皮祖细胞、2次贴壁且诱导培养的内皮祖细胞、大鼠成熟主动脉内皮细胞,采用硝酸还原酶法间接测量细胞培养液中一氧化氮的含量。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞与内皮祖细胞体外培养情况,细胞培养液中一氧化氮的含量。 结果：原代培养的骨髓间充质干细胞呈梭形,24 h内大部分细胞贴壁,9~10 d可达90%融合,纯化扩增后骨髓间充质干细胞呈均匀一致的长梭性,传代周期为8 d左右,流式细胞仪检测第3代骨髓间充质干细胞CD34,CD45呈阴性,CD105呈阳性。2次贴壁的内皮祖细胞培养3 d内贴壁,6 d形成集落,8~10 d出现条索状结构,呈微血管样生长,2周时大部分细胞呈多角形,细胞集落相互连接,呈典型的“铺路石”样,7~10 d细胞DiI-acLDL、FITC-UEA-1双染呈阳性,流式细胞仪检测Flk-1,CD133阳性。2次贴壁且诱导培养的内皮祖细胞培养液中一氧化氮含量明显高于早期贴壁且普通培养的内皮祖细胞(P < 0.05),但低于大鼠成熟主动脉内皮细胞(P < 0.05)。 结论：差速贴壁法能有效地分离、纯化、扩增大鼠骨髓间充质干细胞,加入多种细胞生长因子诱导后具有较强地向内皮细胞方向分化的能力,且2次贴壁细胞已具有部分内皮细胞的功能。     

脐带结缔组织多潜能干细胞向内皮及心肌方向的分化☆

背景：脐带结缔组织富含多潜能干细胞,其免疫原性弱、增殖力强。 目的：验证体外培养人类脐带结缔组织(wharton’s jelly)中多潜能干细胞向内皮细胞及心肌细胞方向的诱导分化。 方法：贴块法培养人类脐带结缔组织多潜能干细胞。 结果与结论：①流式细胞仪进行表型鉴定,多潜能干细胞CD105、CD73、CD90、CD44、CD54阳性,而CD45、CD34、CD106和CD133阴性。②加入血管内皮生长因子及碱性成纤维细胞诱导后,细胞表现内皮细胞形态,可以吞噬ac-LDL并结合UEA-1。③以5-氮杂胞甘诱导后经免疫组织化学染色显示,心肌细胞标记物肌钙蛋白Ⅰ和β肌球蛋白重链表达阳性。提示在体外培养的条件下,可以从脐带结缔组织中得到大量干细胞,该细胞可以向心肌及内皮方向分化。     

兔骨髓间充质干细胞体外培养定向诱导分化为软骨细胞

背景：骨髓间充质干细胞具有分化为骨、软骨、肌腱、脂肪等组织的多分化潜能。 目的：体外培养兔骨髓间充质干细胞并定向诱导分化为软骨细胞,探讨体外诱导分化为软骨的方法和条件。 方法：取兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子体外培养后,取第3代细胞在培养基中添加不同质量浓度转化生长因子β1的软骨分化诱导剂,2周后倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色,RT-PCR技术检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达。 结果与结论：可以从兔骨髓中培养出骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子能明显的促进骨髓间充质干细胞增殖。经软骨诱导分化后骨髓间充质干细胞呈软骨细胞形态,甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达阳性。10 μg/L的转化生长因子β1诱导成软骨分化能力最强。     

人脐带间充质干细胞体外长期培养及向肝样细胞的分化

目的：观察人脐带间充质干细胞体外长期培养的生物学特性,探讨其向肝样细胞分化的可能性。 方法：脐带来源于天津市第三中心医院住院的健康足月产妇,采用酶消化法分离培养人脐带间充质干细胞,待细胞生长至80%~90%融合时传代。取传至第9代细胞接种于12孔板内,调整细胞浓度为5×1010 L-1,加入含肝细胞生长因子、成纤维生长因子4、抑瘤素的DMEM培养基,诱导28 d。MTT法测定细胞生长活性,流式细胞仪检测细胞周期,免疫细胞化学及流式细胞仪鉴定细胞表型;免疫细胞化学染色鉴定诱导后肝细胞特异表面标志物的表达,以及糖原染色结果。 结果：从人脐带中分离得到的间充质干细胞贴壁生长,形态类似于成纤维细胞,80%以上处于G0/G1期,具有良好的生长活性,可在体外稳定传代20次以上;CD29,CD90,CD105,Vimentin呈阳性表达,基本不表达造血细胞标志CD34和内皮细胞标志CD31。随诱导时间的延长,圆形细胞逐渐增多,形态似肝细胞;诱导1周时细胞开始表达肝细胞表面标志物甲胎蛋白、细胞胶蛋白18、细胞胶蛋白19;诱导3周时开始表达成熟肝细胞标志白蛋白;诱导4周时白蛋白表达增强,且诱导细胞糖原染色呈阳性。 结论：从人脐带中可成功分离出间充质干细胞,实现体外长期培养,并可诱导分化为肝样细胞。     

转化生长因子β1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化*

背景：转化生长因子β1是关节软骨组织工程研究的首选生长因子，适当浓度能刺激关节软骨细胞增殖、分裂和分化。 目的：建立含有转化生长因子β1的特殊诱导体系培养条件下骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的能力，观察诱导后的细胞形态及表型变化。 方法：于兔胫骨结节内侧抽取骨髓，采用贴壁培养法分离纯化兔骨髓间充质干细胞，取第3代骨髓间充质干细胞行流式细胞仪检测鉴定其表面抗原，以含有转化生长因子β1的特殊软骨诱导体系的培养条件下对第3代骨髓间充质干细胞诱导培养21 d，诱导后与人鼻中隔软骨细胞进行比较。采用免疫组织化学法对Ⅱ型胶原进行定性检测。 结果与结论：贴壁培养法可分离并纯化兔骨髓间充质干细胞，所得第3代骨髓间充质干细胞表面抗原CD44 阳性，CD34、CD45 阴性。经诱导培养21 d后细胞形态变为不规则，Ⅱ型胶原免疫组织化学染色显示可见阳性细胞。提示含有转化生长因子β1的特殊软骨诱导体系的培养条件下，骨髓间充质干细胞可以转化为软骨细胞，且与正常软骨细胞无明显差异。     

神经干细胞与脑胶质瘤干细胞☆

所有的肿瘤组织并不是由均一的肿瘤细胞所组成的,不同的细胞具有不同的增殖、浸润和转移能力,亦即肿瘤的异质性。其中存在少数担当着干细胞角色的肿瘤细胞,具有干细胞的基本特性,包括自我更新能力、无限的增殖能力和多向分化潜能,为肿瘤干细胞。神经干细胞具有很强的自我更新机制,获得较少突变即有可能恶性转化,而且干细胞存活时间较长,这意味着干细胞比成熟细胞发生细胞复制的错误几率更大,因外界环境的刺激而发生突变的机会更多,最终形成脑胶质瘤干细胞,同时调节神经干细胞增殖和自我更新的基因在脑胶质瘤的脑胶质瘤干细胞中也表达,这也是支持神经干细胞是脑胶质瘤干细胞来源的;也有推测认为它可能起源于已分化的细胞,由这些细胞突变发生去分化得来,并通过基因突变而获得了干细胞自我更新的特性,从而形成脑胶质瘤干细胞。通过探讨神经干细胞与脑胶质瘤干细胞,为脑胶质瘤的治疗提供依据。     

Quite amusing stem cells:Muse cells

<正>Stem cells may be the future of therapeutics for stroke due to their regenerative and immunomodulatory capabilities.Major barriers faced when employing stem cells,however,include faulty migration,low cell survival,and diminished proliferation.M ultilineage-differentiating stress ensuring (Muse) cells,a subset of mesenchymal stem cells,overcome these barriers.Muse cells aid in neuroregeneration,have immense regenerative potential,and are pluripotent,non-tumorigenic,and immunomodulatory.I...     

神经干细胞诱导骨髓基质细胞向神经元样细胞分化

目的：研究骨髓基质细胞向神经元样细胞分化的条件。方法：神经十细胞诱导骨髓基质细胞向神经元样细胞分化，免疫细胞化学方法对分化的和未分化的细胞进行鉴定。结果：神经于细胞可诱导骨髓基质细胞向神经元样细胞分化，分化的细胞表达神经元的标志物神经元特异性烯醇化酶(NSE)。结论：骨髓组织中存在能分化为神经元的于细胞，可能成为中枢神经系统自体移植的于细胞的来源。     

Oligodendroglioma-like cells (clear cells) in ependymoma

A brain tumor of a 22-year-old man was composed mostly of round cells with perinuclear halos (clear cells), forming clusters intersected by small blood vessels. In some areas, the tumor cells showed perivascular arrangement and epithelial pattern. Phosphotungstic-acid hematoxylin stain and immunoperoxidase stain for glial fibrillary acidic protein (GFAP) technique failed to stain the clear cells. Electron microscopy of the clear cells revealed them to be classical ependymoma cells with well developed intercellular junctions, microvilli and cilia. As no reporters in the past showed the evidence to clarify the nature of the clear cells, this case is considered a good example to support the viewpoint that the clear cells (oligodendroglioma-like cells) commonly observed in ependymomas are in reality ependymoma cells. It is stressed that the diagnosis of "mixed glioma" or "oligoependymoma" should be made with sufficient caution despite the recent advances of GFAP technique.     

Differentiation of radial glia-like cells from embryonic stem cells

Radial glial cells play important roles in neural development. They provide support and guidance for neuronal migration and give rise to neurons and glia. In vitro, neurons, astrocytes, and oligodendrocytes can be generated from neural and embryonic stem cells, but the generation of radial glial cells from these stem cells has not yet been reported. Since the differentiation of radial glial cells is indispensable during brain development, we hypothesize that stem cells also generate radial glial cells during in vitro neural differentiation. To test this hypothesis, we utilized five different clones of mouse embryonic (ES) and embryonal carcinoma (EC) stem cell lines to investigate the differentiation of radial glial cells during in vitro neural differentiation. Here, we demonstrate that radial glia-like cells can be generated from ES/EC cell lines. These ES/EC cell-derived radial glia-like cells are similar in morphology to radial glial cells in vivo, i.e., they are bipolar with an unbranched long process and a short process. They also express several cytoskeletal markers, such as nestin, RC2, and/or GFAP, that are characteristics of radial glial cells in vivo. The processes of these in vitro generated radial glia-like cells are organized into parallel arrays that resemble the radial glial scaffolds in neocortical development. Since radial glia-like cells were observed in all five clones of ES/EC cells tested, we suggest that the differentiation of radial glial cells may be a common pathway during in vitro neural differentiation of ES cells. This novel in vitro model system should facilitate the investigation of regulation of radial glial cell differentiation and its biological function.     

Lysophosphatidic acid activates satellite glia cells and Schwann cells

Pruritus is a common and disabling symptom in patients with hepatobiliary disorders, particularly in those with cholestatic features. Serum levels of lysophosphatidic acid (LPA) and its forming enzyme autotaxin were increased in patients suffering from hepatic pruritus, correlated with itch severity and response to treatment. Here we show that in a culture of dorsal root ganglia LPA 18:1 surprisingly activated a large fraction of satellite glia cells, and responses to LPA 18:1 correlated inversely with responses to neuronal expressed transient receptor potential channels. LPA 18:1 caused only a marginal activation of heterologously expressed TRPV1, and responses in dorsal root ganglion cultures from TRPV1-deficient mice were similar to controls. LPA 18:1 desensitized subsequent responsiveness to chloroquine and TGR5 agonist INT-777. The LPA 18:1-induced increase in cytoplasmatic calcium stems from the endoplasmatic reticulum. LPA receptor expression in dorsal root ganglia and Schwann cells, LPAR1 immunohistochemistry, and pharmacological results indicate a signaling pathway through LPA receptor 1. Peripheral rat Schwann cells, which are of glial lineage as the satellite glia cells, were also responsive to LPA 18:1. Summarizing, LPA 18:1 primarily activates rather glial cells than neurons, which may subsequently modulate neuronal responsiveness and sensory sensations such as itch and pain.     

间充质干细胞向肝样细胞的诱导分化

目前很多体内外实验都已表明间充质干细胞具有向肝样细胞或肝细胞分化的能力,这使间充质干细胞治疗肝脏疾病成为可能。 目的：总结和分析间充质干细胞向肝样细胞诱导分化的方法、机制以及存在的问题。 方法：应用计算机检索PubMed数据库(2000-01/2009-12),以“mesenchymal stem cells,hepatocyte, differentiation”为检索词;应用计算机检索维普数据库(2000-01/2009-12),以“间充质干细胞,肝细胞,诱导分化”为检索词。选择文章内容与间充质干细胞诱导分化为肝细胞相关,同一领域文献则选择近期发表或发表在权威杂志文章。 结果与结论：共收集146篇关于间充质干细胞向肝样细胞诱导分化的文章,纳入 31篇符合标准的文献。间充质干细胞可在体外及肝脏病理条件下分化为肝细胞,其作用机制主要是间充质干细胞在合适的细胞因子组合诱导下,细胞因子通过特定的细胞信号传导途径,作用于细胞核,启动或关闭相应的基因,表达特异的蛋白质,使间充质干细胞向肝细胞分化。随着研究不断得深入,这使间充质干细胞治疗肝脏疾病成为可能,但其研究有待进一步完善。