局部注射骨髓间充质干细胞治疗大鼠脊髓损伤：运动功能有改善吗？

背景：目前研究多为骨髓间充质干细胞的体外培养及细胞移植对颅内疾病的治疗,对植入细胞在损伤脊髓中的成活、分化、迁移、结构重建等了解有限。 目的：探讨局部骨髓间充质干细胞移植在脊髓损伤修复中的作用和骨髓间充质干细胞替代治疗的可行性。 方法：成年健康雌性SD大鼠随机分为细胞移植组和对照组,建立SD大鼠脊髓横断损伤模型,伤后即刻分别向损伤区局部移植大鼠骨髓间充质干细胞悬液或无钙镁磷酸缓冲液。在术前和术后1 d,1周,2周,3周,4周和8周进行BBB评分,观测大鼠的运动功能,并于移植后1周免疫组织化学染色法观察BrdU标记的骨髓间充质干细胞在脊髓损伤处的存活情况,移植后4周进行损伤脊髓的大体观察和组织学检测。 结果与结论：移植后第1~8周细胞移植组BBB评分均髙于对照组;术后1周免疫组织化学染色结果显示在细胞移植组大鼠脊髓远端检测到BrdU阳性细胞,术后4周脊髓损伤处发现有神经纤维。证实通过损伤后立即局部注射的方式将骨髓间充质干细胞移植进大鼠脊髓损伤区,细胞可在损伤区存活;存活的骨髓间充质干细胞可分化为神经元,在损伤局部形成神经元通路,从而促进脊髓神经纤维传导功能的恢复,并促进高位脊髓损伤后大鼠后肢运动功能恢复。     

骨髓间充质干细胞尾静脉移植脊髓损伤大鼠脑源性神经营养因子及神经生长因子的表达

背景：骨髓间充质干细胞移植对脊髓损伤有治疗作用,但其机制尚不完全清楚。 目的：应用免疫组织化学方法观察骨髓间充质干细胞静脉移植损伤脊髓局部脑源性神经营养因子及神经生长因子的表达,分析骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的作用途径。 方法：运用改良Allen法制备T10脊髓外伤性截瘫大鼠模型,假手术组6只,脊髓损伤组24只随机分为对照组和骨髓间充质干细胞移植组。骨髓间充质干细胞移植组、假手术组接受骨髓间充质干细胞单细胞悬液1 mL(1×106 cells)自大鼠尾静脉缓慢注射移植,对照组静脉注射PBS 1 mL。 结果与结论：脊髓损伤后损伤局部的脑源性神经营养因子、神经生长因子表达增加,骨髓间充质干细胞静脉注射移植后能促进脊髓损伤局部脑源性神经营养因子、神经生长因子更进一步的表达,这可能是促进神经结构及神经功能恢复的因素之一。     

基质细胞衍生因子1及其受体CXCR4对人骨髓间充质干细胞向

背景：近年研究发现移植的骨髓间充质干细胞能向颅内创伤、脑卒中、炎症和变性疾病等病灶部位迁移,进而发挥治疗作用,但对于其向病灶定向迁移的具体机制还不十分清楚。 目的：探讨基质细胞衍生因子1及其受体 CXCR4在移植的骨髓间充质干细胞趋向缺血脑组织迁移中的作用。 设计、时间及地点：细胞学体内实验,于2008-02/2009-02在解放军第三军医大学新桥医院中心实验室进行。 材料：骨髓标本取自解放军第三军医大学附属新桥医院血液科收治的15~40岁正常或原发病未累及骨髓患者,三四月龄健康雄性SD大鼠72只由解放军第三军医大学野战外科研究所实验动物中心提供。 方法：密度梯度离心贴壁筛选法分离纯化、体外培养人骨髓间充质干细胞。54只大鼠参照Nagasawa线栓法制备局灶性脑缺血再灌注模型,剩余18只作为假手术组,仅插入线栓10 mm。模型组及假手术组大鼠各取9只,分别于造模后第2,4,8天,采用Real-time PCR和免疫组织化学法定量分析缺血脑组织基质细胞衍生因子1表达变化。剩余36只脑缺血再灌注模型鼠随机分为细胞移植组、溶液对照组,18只/组,于再灌注后24 h分别从尾静脉缓慢注入1 mL人骨髓间充质干细胞悬液(含2×109 L-1个细胞)或1 mL PBS。 主要观察指标：人骨髓间充质干细胞CXCR4 mRNA和蛋白的表达,缺血再灌注后脑组织基质细胞衍生因子1 mRNA和蛋白表达变化,免疫组织化学检测人骨髓间充质干细胞向缺血脑组织的迁移和分布。 结果：RT-PCR结果发现人骨髓间充质干细胞表达CXCR4 mRNA,免疫细胞化学染色发现CXCR4主要表达于人骨髓间充质干细胞的胞膜和胞浆。脑缺血再灌注损伤后2,4,8 d,趋化因子基质细胞衍生因子1 mRNA水平呈上升趋势,与假手术组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。经静脉移植的人骨髓间充质干细胞定向迁移到脑损伤区域,并大量分布于基质细胞衍生因子1高表达的缺血半暗区,损伤侧大脑半球人骨髓间充质干细胞数量显著高于对侧半球(P < 0.01)。 结论：基质细胞衍生因子1及其受体CXCR4参与并促进人骨髓间充质干细胞向脑缺血再灌注损伤区的迁移。     

低氧对人骨髓间充质干细胞趋化因子受体CXCR4和CX3CR1表达的影响

背景：移植的骨髓间充质干细胞能向损伤病灶部位定向迁移,进而发挥治疗作用,但关于其向病灶定向迁移的具体机制还不十分清楚。 目的：观察低氧对人骨髓间充质干细胞趋化因子受体CXCR4和CX3CR1表达的影响。 设计、时间和地点：细胞学体外观察,于2008-02/2009-02在解放军第三军医大学新桥医院中心实验室进行。 材料：骨髓标本取自解放军第三军医大学附属新桥医院血液科收治的15~40岁正常或原发病未累及骨髓患者。 方法：穿刺采集骨髓,密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化人骨髓间充质干细胞。取生长良好的第3代细胞接种于25 cm2培养瓶中,培养至70%~80%融合后,置于 37 ℃、体积分数分别为3%O2、5%CO2、92%N2的饱和湿度孵育箱内培养48 h,以常氧培养作为对照。 主要观察指标：相差显微镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞表面标记物,Real time荧光定量PCR法检测CXCR4和CX3CR1 mRNA的表达,免疫细胞化学和Western blot法检测CXCR4和CX3CR1蛋白的表达。 结果：体外分离纯化的人骨髓间充质干细胞呈成纤维细胞样,培养12~14 d达90%汇合,呈极性排列,集落呈漩涡状;CD105和CD29阳性率分别为99.38%和99.13%,而CD14,CD45均呈阴性表达。在体积分数为3%的O2培养条件下,人骨髓间充质干细胞CXCR4和CX3CR1 mRNA的表达分别是常规培养条件下的2.130倍和2.361倍,CXCR4和CX3CR1蛋白的表达分别是常规培养条件下的1.69倍和1.93倍,CXCR4和CX3CR1主要表达于人骨髓间充质干细胞的胞膜和胞浆。 结论：体积分数为3%的O2低氧条件能够促进人骨髓间充质干细胞趋化因子受体CXCR4和CX3CR1 mRNA及蛋白的表达,这可能是体内移植的骨髓间充质干细胞向损伤病灶定向迁移的机制之一。     

不同途径移植骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复效果研究

目的观察不同途径移植骨髓间充质干细胞(BMSCs)对脊髓损伤修复效果。方法选取20g Wis-ter大鼠采用贴壁法分离、培养、纯化BMSCs,选取180gWister大鼠制备脊髓损伤模型动物,分别采用损伤部位和腰骶鞘内两条途径移植细胞,通过BBB评分和细胞形态学方法,观察不同途径移植BMSCs治疗脊髓损伤的效果。结果腰骶鞘内细胞移植后第2、3周进行BBB评分各时间段均较损伤部位细胞移植组评分高。另外形态学观察显示BMSCs经腰骶鞘内移植后组织结构规则,形成明显的网状结构,且组织内空泡数量明显少于BMSCs经损伤部位移植组。结论经腰骶鞘内移植BMSCs的疗效好于经损伤部位细胞移植。     

趋化因子CXCL-8趋化骨髓间充质干细胞迁移的体外效应

背景：早期研究表明趋化因子参与骨髓间充质干细胞的体外趋化,确定骨髓间充质干细胞体内迁移的分子机制,对其介导的细胞治疗中枢神经系统损伤和疾病有重要作用。 目的：观察体外条件下趋化因子CXCL-8对大鼠骨髓间充质干细胞迁移的趋化作用。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-10/2008-06在青岛大学医学院附属医院脑血管病研究所完成。 材料：纯种SPF级成年Wistar大鼠8只,由青岛市实验动物和动物实验中心提供。鼠重组趋化因子CXCL-8为Santa cruz公司产品。 方法：采用全骨髓法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,胰蛋白酶消化传代。取500 μL趋化因子CXCL-8,加入含体积分数为0.5%胎牛血清的DMEM条件培养基,分别将质量浓度调整为5,50,250,500 μg/L加到趋化板下层,对照组单纯添加DMEM条件培养基,以8 μm孔径的聚碳酸酯膜覆盖。调整骨髓间充质干细胞浓度至1.5×109 L-1,取100 μL细胞悬液加到趋化板上层。为验证趋化因子CXCL-8作用的特异性,将经抗CXCR6多克隆抗体孵育12 h后的骨髓间充质干细胞加到趋化板上层,趋化因子CXCL-8加到趋化板下层。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞趋化因子受体CXCR1的表达,趋化因子CXCL-8对骨髓间充质干细胞体外趋化迁移作用及其特异性检测。 结果：骨髓间充质干细胞趋化因子受体CXCR1呈阳性表达,位于细胞膜和细胞浆中,RT-PCR琼脂糖凝胶电泳后出现215 bp特异性扩增条带。与对照组比较,加入5~500 μg/L趋化因子CXCL-8后,骨髓间充质干细胞迁移数均明显增加（P < 0.05）。加入抗CXCR1多克隆抗体后,骨髓间充质干细胞迁移数较250 μg/L趋化因子CXCL-8组明显减少（P < 0.05）。 结论：体外条件下趋化因子CXCL-8在5~500 μg/L质量浓度范围可趋化骨髓间充质干细胞迁移,封闭趋化因子受体CXCR1后其趋化迁移作用明显减弱。     

骨髓间充质干细胞移植联用氨基胍对大鼠脊髓损伤修复的影响*

背景：体内实验发现,骨髓间充质干细胞可在体内神经组织中分化为神经元样细胞,表达神经元抗原,并且骨髓间充质干细胞的存在对神经元的损伤有保护作用,这可能与骨髓间充质干细胞分泌的活性物质有关。 目的：观察骨髓间充质干细胞移植联用诱导型一氧化氮合酶抑制剂-氨基胍对大鼠脊髓损伤修复的影响。 设计、时间及地点： 随机对照动物实验,细胞学观察,于2006-07/2008-02在河北工程大学附属医院外科实验室和中心实验室完成。 材料：Wistar大鼠36只随机分成对照组、骨髓间充质干细胞组、联合移植组,每组12只。氨基胍由美国Sigma公司提供。 方法：采用密度梯度离心法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,以Brdu标记细胞核。对照组：制备脊髓半切损伤模型不做处理。骨髓间充质干细胞组：制备脊髓半切损伤模型后,损伤上下各 1 mm处移植骨髓间充质干细胞悬液共2 μL。联合移植组：制备脊髓半切损伤模型后,损伤上下各 1 mm处移植骨髓间充质干细胞悬液8 μL,同时局部给予氨基胍100 mg/kg。 主要观察指标：术后采用斜板试验及改良Tarlov评分评价动物后肢运动功能恢复情况。术后2个月,显微镜下观察移植后脊髓形态结构变化及移植物存活情况。神经微丝和胶质原纤维酸性蛋白免疫组织化学评价移植对脊髓再生的影响。 结果：下肢运动功能评价联合移植组优于骨髓间充质干细胞组,骨髓间充质干细胞组优于对照组。免疫组织化学检测发现,脊髓损伤区有新生束状轴突伸向断端,嗜银染色可见脊髓断端的再生轴突长入断端间组织中,部分连接两端面。损伤阶段脊髓内可见Brdu标记阳性骨髓间充质干细胞存活,灰质分布较白质多,以注射部位向周围损伤组织迁移,联合应用氨基胍组Brdu标记阳性骨髓间充质干细胞存活多。联合移植组术后2个月神经微丝和胶质原纤维酸性蛋白免疫阳性反应的面积比均高于其他各组。 结论：骨髓间充质干细胞联合氨基胍移植促进大鼠半横断脊髓结构和功能恢复的效果明显优于单纯细胞移植组,两者联用具有协同效应。     

静脉移植CXCR-4基因转染骨髓间充质干细胞在脊髓损伤鼠体内的迁移与分化

背景：研究发现,基质细胞衍生因子1/CXCR-4轴具有介导骨髓间充质干细胞定向迁移的作用。 目的：观察静脉移植CXCR-4基因转染间充质干细胞治疗脊髓损伤的可行性。 方法：利用脊髓横切法构建C57BL/6小鼠T10脊髓损伤模型,造模后7 d抽签随机分成3组：实验组经尾静脉注射CXCR-4基因转染同种异体骨髓间充质干细胞悬液,对照组与空白对照组分别注射同种异体骨髓间充质干细胞悬液及无细胞培养基。移植后第7,14,21,28天利用激光共聚焦显微镜、免疫组织化学双标染色法检测脊髓损伤部位绿色荧光蛋白阳性细胞迁移存活及分化情况,并采用BBB评分评估小鼠神经运动功能恢复情况。 结果与结论：实验组移植后各时相点损伤灶内绿色荧光蛋白阳性细胞集聚明显,数量不断增多,迁移率明显高于对照组与空白对照组,来源于骨髓间充质干细胞的神经细胞占移植细胞的比例亦高于对照组与空白对照组,小鼠神经运动功能恢复明显。说明静脉移植CXCR-4基因转染的骨髓间充质干细胞表现出对脊髓损伤灶更强的定向迁移能力,且能在损伤灶内存活、分化,发挥修复损伤脊髓作用。     

骨髓间充质干细胞修复损伤脊髓的实验及临床应用短期随访

背景：骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤的研究已经逐渐由动物实验过渡到临床,但其作用机制还不完全清楚。 目的：观察骨髓间充质干细胞移植对脊髓损伤大鼠脊髓功能的修复作用,并通过临床应用观察短期疗效。 方法：采用改良Allen's打击法造成Wistar大鼠脊髓损伤模型,将体外分离培养的骨髓间充质干细胞分别经尾静脉及损伤局部移植,应用改良Tarlov评分评定大鼠行为学变化,在光镜下对损伤脊髓病理切片进行对比分析。对5例脊髓损伤患者通过损伤原位注射、腰穿、静脉输注的方式行人自体骨髓间充质干细胞移植,并行神经功能及生活能力评定。 结果与结论：治疗后15 d,骨髓间充质干细胞尾静脉及损伤局部移植组大鼠运动功能评分较模型对照组显著提高;移植后7,15,30 d,脊髓病理切片显示骨髓间充质干细胞尾静脉及损伤局部移植组大鼠较模型对照组有显著恢复。临床患者骨髓间充质干细胞移植后半年神经功能及生活能力均有改善。     

骨髓间充质干细胞不同移植途径治疗大鼠脊髓损伤的比较

背景：在适当的生长环境下，中枢神经系统内的一些受损的神经元轴突有少许再生，并能与靶细胞形成功能性的突触联系。 目的：比较局部注射和尾静脉注射途径移植骨髓间充质干细胞对大鼠脊髓损伤神经功能恢复的作用。 设计、时间及地点：细胞组织学对照观察，于2007-03/2008-04在承德医学院完成。 材料：健康成年雄性SD大鼠40只，由解放军军事医学科学院动物中心（北京）提供。 方法：取4只大鼠，采用密度梯度离心法和贴壁法体外分离培养骨髓间充质干细胞，传至第2代于临用前24 h行BrdU标记。余36只大鼠均建立T12脊髓损伤模型，1周后随机分为3组，局部注射组于损伤部位上下位点注射1×106个骨髓间充质干细胞至损伤大鼠体内；尾静脉注射组通过尾静脉移植等量骨髓间充质干细胞至损伤大鼠体内；模型对照组不行细胞移植。 主要观察指标：神经功能缺损BBB评分，苏木精-伊红染色病理学检测，细胞分化免疫组化染色结果。 结果：细胞移植后2，4，6周，模型对照组神经功能缺损BBB评分均显著低于局部注射组、尾静脉注射组（F=721.373，F=1 114.450，F=1 004.099，P均 < 0.01）；局部注射组神经功能缺损BBB评分均显著高于尾静脉注射组（t=55.261，t=71.385，t=78.135，P均 < 0.01）。苏木精-伊红染色结果显示，模型对照组损伤脊髓组织有较多空腔，横断处形成大量空泡；局部注射组无明显空腔，空泡小而少，间质水肿较轻。移植后4，6周，部分植入的骨髓间充质干细胞呈微管相关蛋白2及胶质纤维酸性蛋白双阳性表达。 结论：局部注射和尾静脉注射两种途径移植的骨髓间充质干细胞均可在脊髓损伤处存活、分化并改善神经功能，且局部注射的效果优于尾静脉注射。