人树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素基因RNAi

背景：慢病毒载体是一个能够在原代培养的人树突状细胞中进行RNA干扰的有效工具，但目前国内对RNA干扰技术应用于人树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素分子的研究却少有报道。 目的：拟构建人树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素基因RNA干扰慢病毒载体，为调控人树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素表达水平提供有利的工具。 方法：根据人树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素基因的mRNA序列选择4条靶序列，设计合成靶序列的Oligo DNA，退火形成双链DNA，与经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生DC-SIGN慢病毒载体，采用PCR及测序鉴定，应用Western blot技术外源性筛选干扰效率高的有效靶序列。用慢病毒包装系统pGCSIL-GFP、pHelper 1.0和pHelper 2.0共转染包装293T细胞，包装产生慢病毒，以系列稀释法测定病毒滴度。 结果与结论：PCR扩增和测序结果显示，人树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素核苷酸链序列插入正确，外源性筛选确定两条干扰效率高的有效靶序列。利用筛选确定的有效靶序列，包装产生慢病毒，其浓缩病毒悬液的滴度为1× 109 TU/mL。证实实验成功构建了DC-SIGN基因慢病毒载体。 关键词：慢病毒载体；RNA干扰；DC-SIGN基因；树突状细胞；结核病     

miR-221基因干扰慢病毒载体的构建及其有效靶序列的筛选与表达检测

目的 构建携带人miR-221 基因的miRNA 干扰慢病毒载体并寻找其有效靶序列,为胶质瘤的研究提供一种新的方法.方法 合成含干扰序列的双链DNA oligo 直接连入酶切后的RNA 干扰载体上.将产物转入细菌感受态细胞,对长出的克隆进行PCR 鉴定,阳性克隆即为目的 基因RNA 干扰慢病毒载体质粒.再将目的 基因与目的 载体分别进行双酶切,纯化酶切产物后进行定向连接,其产物转入细菌感受态细胞,再对PCR 鉴定阳性的克隆进行测序和分析比对,比对正确即为融合蛋白过表达质粒载体,然后将两种质粒共转染入293T 细胞,用western bolt 法检测其有效敲减靶序列.结果 重组质粒经测序鉴定证明各转录模板完整、正确插入到相应质粒中,共转染后发现编号为PscSI576 的靶点干扰效果最好.结论 本实验成功构建了人miR-221 基因的RNA 干扰慢病毒载体,并找到了有效的干扰靶序列.     

大鼠硫酸软骨素蛋白多糖基因shRNA慢病毒载体的构建及干扰效率鉴定*☆

背景：最近研究发现硫酸软骨素蛋白多糖(NG2)在中枢神经系统中参与多种生理病理功能,慢病毒载体可感染分裂期细胞或非分裂期的细胞,并能在细胞内高效稳定的表达。 目的：构建大鼠源性NG2基因shRNA慢病毒载体并检测其干扰效率。 方法：选择大鼠NG2基因RNA干扰的靶序列,合成Oligo DNA,退火形成双链DNA,与Hpa Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后的pFU-GW-RNAi载体连接产生pLV-NG2-RNAi,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。将重组载体与pHelper 1.0载体、pHelper 2.0载体通过lipofectamineTM 2000共转染293T细胞包装产生慢病毒LV-NG2-RNAi,收集病毒上清并浓缩。采用孔稀释滴度测定法计算病毒滴度。将LV-NG2-RNAi慢病毒感染C6细胞,于感染后96 h提取细胞总蛋白,采用Western blot检测NG2的表达。 结果与结论：经PCR和测序证实构建片段大小及DNA序列与目的序列一致,实验成功构建大鼠NG2基因shRNA慢病毒载体LV-NG2-RNAi。包装浓缩慢病毒的滴度为8×1011 TU/L。Western blot检测显示在感染复数为50时,感染LV-NG2-RNAi慢病毒的C6细胞较感染对照慢病毒及未感染细胞NG2的表达明显降低,干扰效率可达100%(P < 0.05)。结果证实了实验成功构建大鼠NG2基因shRNA慢病毒载体,且该载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。     

REST/NRSF基因shRNA慢病毒载体的构建与鉴定***☆◆

背景：神经元限制性沉默因子(REST/NRSF)能负向调控神经元及胰岛细胞分化相关基因的表达。 目的：构建并筛选能高效沉默大鼠REST/NRSF基因的shRNA慢病毒载体。 方法：针对REST/NRSF基因设计4组特异性siRNA靶点,合成靶序列的寡核苷酸序列,退火形成双链DNA,与经Hpa Ⅰ 和Xho Ⅰ双酶切后的pFU-GW-RNAi载体连接产生L-shREST/NRSF慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。包装产生慢病毒颗粒,随后将其感染大鼠骨髓间充质干细胞,采用 Real-time PCR方法检测靶基因在 mRNA 水平的沉默效率。 结果与结论：PCR和测序证实,构建出了REST/NRSF shRNA的慢病毒载体L-shREST/NRSF,并能稳定转染大鼠间充质干细胞,感染效率达100%。4组shRNA序列均有基因沉默效果,并以第3组shRN序列效果最为明显。结果表明,该慢病毒表达载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。     

人EGFL7基因短发夹结构RNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建人类表皮生长因子域7（EGFL7）基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体。方法将靶向EGFL7基因的短发夹结构RNA（shRNA）表达序列连接到包含U6启动子及绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的慢病毒载体pGCL-GFP中,获得重组质粒,命名为pGCL-GFP-vshEGFL7,经多聚酶链反应（PCR）和测序鉴定后,与慢病毒包装质粒pHelper 1.0及pHelper 2.0通过lipofectamine 2000共转染至包装细胞293T,包装产生病毒液,测定其滴度。结果PCR扩增和测序结果证实EGFL7shRNA核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液的滴度为4.8×107TU/ml。结论成功构建人EGFL7基因shRNA慢病毒载体。     

沉默Toll样受体4基因表达的RNAi慢病毒载体的构建******

背景：Toll样受体4 (toll-like receptor4,TLR4)是介导内毒素/脂多糖应答的主要受体,在由内毒素诱导的炎性反应的信号通路中发挥着重要作用。 目的：构建人TLR4基因的RNA干扰慢病毒载体,并观察其对人脐静脉内皮细胞TLR4在蛋白水平的沉默效应。 方法：利用Invitrogen在线软件设计人TLR4基因shRNA序列,合成、退火形成双链寡核苷酸后克隆到线性载体pENTRTM/H1/TO的黏性末端,并进行DNA测序。得到的阳性重组子再与慢病毒载体进行重组反应,从而获得干扰TLR4基因真核表达的慢病毒载体。在脂质体的介导下将慢病毒包装辅助复合体和TLR4基因的真核表达慢病毒载体导入293FT细胞包装病毒,测定病毒滴度,感染人脐静脉内皮细胞,检验其干扰TLR4基因表达的有效性。 结果与结论：实验成功构建TLR4基因真核表达慢病毒干扰载体并获得相应的慢病毒,病毒滴度为8.7×106 U/mL。免疫印迹杂交结果表明,所获得的慢病毒感染人脐静脉内皮细胞TLR4基因在蛋白水平的表达显著降低。实验成功构建了人TLR4基因慢病毒RNA干扰表达载体,并验证了其在人脐静脉内皮细胞上的有效性。     

人神经生长因子β亚基慢病毒载体的构建*

背景：糖尿病神经源性膀胱的发病与神经生长因子缺乏有关,β亚基是构成神经生长因子(NGF)3种亚基中惟一具有生物活性的亚基,慢病毒载体是基因治疗的理想载体。 目的：构建过表达人神经生长因子β亚基(β-NGF)基因的慢病毒载体。 方法：通过目的基因的获得,载体质粒双酶切,载体质粒与目的基因的连接将人β-NGF基因克隆到慢病毒载体质粒pGC-FU中,构建重组慢病毒载体质粒pGC-FU-β-NGF。观察人β-NGF基因的克隆情况,并进行重组慢病毒载体质粒pGC-FU-β-NGF的PCR鉴定和测序。 结果与结论：构建的重组慢病毒载体质粒pGC-FU-β-NGF进行PCR实际获得的产物与预计PCR产物大小一致,即初步判断为构建成功的重组质粒。所获得的β-NGF基因经测序后与GenBank报道序列完全一致。说明pGC-FU-β-NGF中携带有正确的β-NGF基因。结果证实,实验成功构建了携带人β-NGF基因的重组慢病毒载体质粒。     

Cdc2基因敲低逆转录病毒载体设计与构建方法

目的设计和构建cdc2基因敲低的表达siRNA的逆转录病毒重组载体。方法利用在线软件siRNASelectionProgram和siDirect设计干扰cdc2基因靶序列,合成回文DNA序列,退火后克隆至线性化pSUPER质粒载体,重组质粒载体扩增、抽提后行双酶切电泳鉴定和测序分析,再转染phoenix细胞,产生逆转录病毒,并利用NIH3T3细胞测定病毒滴度。结果pSUPER表达siRNA重组质粒载体经双酶切电泳鉴定和DNA测序分析,证实插入的60bp序列与原序列一致,位置正确。pSUPER.retro-C1、pSUPER.retro-C2病毒滴度值分别为4.25×105CFU/ml和6.00×105CFU/ml。结论cdc2基因表达siRNA逆转录病毒重组载体构建成功,可为研究胶质瘤分子病因学提供有用工具。     

DEC1基因shRNA慢病毒表达载体的构建及其稳转胶质瘤细胞系的建立

目的构建人分化型胚胎软骨发育基因1(DEC1)的短发卡RNA(shRNA)慢病毒表达载体并建立稳定敲减DEC1表达的人脑胶质瘤细胞株T98G。方法根据Gen Bank中DEC1基因c DNA序列设计合成两条特异性shRNA序列,同时设计1条非特异性序列作为阴性对照,分别克隆到PsiLVRU6MP质粒载体内,经酶切电泳、DNA测序鉴定后包装成慢病毒颗粒。再以3组慢病毒感染胶质瘤细胞系T98G,用嘌呤霉素筛选后,荧光显微镜下观察m Cherry的表达,Western Blot检测各组DEC1蛋白的表达水平。结果 DEC1基因shRNA慢病毒表达载体经酶切、测序鉴定证实克隆正确。荧光显微镜检测显示各组细胞均已被慢病毒高效感染。Western Blot结果显示,两干扰组细胞各自DEC1蛋白表达水平明显低于未处理组和阴性对照组,分别占未处理组的39.47%±0.69%和41.17%±0.89%(P0.05),但两干扰组之间无显著性差异(P0.05);阴性对照组与未处理组相比亦无明显差异(P0.05)。结论成功构建DEC1基因shRNA慢病毒表达载体,感染胶质瘤T98G细胞系获得成功。两干扰组慢病毒均能明显敲减目的基因DEC1的表达,为进一步研究DEC1在胶质瘤细胞系T98G中的生物学功能和作用机制提供了实验基础。     

小鼠α1，3-半乳糖基转移酶RNA干扰重组慢病毒的构建与鉴定

背景：研究表明,通过抑制α1,3-半乳糖基转移酶的生成而减少甚至避免供体Galα(1,3)Gal的生成,是渡过器官移植后超急性排斥反应的一条切实可行的方法。 目的：构建小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因的RNA干扰慢病毒载体,有效沉默小鼠血管内皮细胞的α1,3-半乳糖基转移酶基因表达,以期为有效控制异种移植超急性排斥反应提供稳定的转染细胞载体。 设计、时间及地点：单一样本观察,于2006-07/2007-05在天津医科大学总医院普外研究所完成。 材料：慢病毒载体系统(四质粒)购自Tronolab公司,包装细胞293T细胞株购自中科院上海细胞所。 方法：在线软件设计小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因发卡小分子干扰RNA片段。合成的双链DNA片段并将其连接到Tele-sh003/U6.2载体的黏性末端,产生重组质粒Tele-sh003/U6.2-shRNA/α1,3-半乳糖基转移酶。对干扰质粒做测序分析。用磷酸钙法将得到的阳性重组子与慢病毒包装质粒共转化293T细胞,72 h后收集含病毒上清液,超速离心后得到重组慢病毒。用实时定量聚合酶链反应测定病毒滴度。 主要观察指标：干扰质粒的测序分析,慢病毒颗粒的包装和滴度测定。 结果：小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因小发卡RNA片段被成功克隆进Tele-sh003质粒中,测序结果显示干扰质粒小干扰RNA编码序列与设计片段的序列完全一致。所得慢病毒亦为阳性克隆,经定量聚合酶链反应测定病毒滴度为2×108 Tu/mL。 结论：成功构建出小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因的小发卡RNA慢病毒RNA干扰表达载体,为进一步控制异种移植超急性排斥反应提供了稳定的转染细胞的载体。     

短发夹RNA靶向抑制suvivin基因在人胶质瘤细胞U251中的表达

目的构建表达靶向抑制survivin基因的三个短发夹结构(shRNA)的RNA干扰载体,使其在胶质瘤细胞发挥干扰效应。方法在survivin全长序列中选取设计3条19个核苷酸靶序列,2条反向重复序列,间以9个核苷酸的茎环序列,加上对应酶切位点,形成3条shRNA的DNA模板,分别克隆到3个干扰载体pG1,pG2和pG3上：采用分布酶切连接的方法,分别将U6启动子以及下游的后2个shRNA模板酶切下来,依次连接到pG1对应酶切位点,构建出含有3条shRNA模板且能独立编码shRNA的重组干扰载体pGenesil-survivin,测序鉴定：将干扰质粒导入到胶质瘤细胞U251,分别采用RT-PCR以及Western Bloting从mRNA和蛋白水平检测干扰后效果。结果重组的干扰载体含有3条正确的shRNA模板；RT-PCR以及Western Blotting检测显示,survivin的mRNA转录水平以及蛋白水平的表达均得到显著抑制。结论编码3条shRNA的干扰载体pGenesil-survivin介导的RNA干扰技术(RNAi)可以显著的靶向抑制survivin基因在人胶质瘤细胞U251中的表达。     

构建survivin shRNA重组载体及靶向下调PC3细胞survivin mRNA的表达

背景：survivin基因特异性表达于肿瘤和胚胎组织,与肿瘤细胞的分化增殖、浸润转移以及多药耐药密切相关。 目的：构建靶向survivin基因的shRNA重组质粒表达载体,转染前列腺癌细胞PC3,验证该载体能否下调细胞survivin基因mRNA水平。 方法：以survivin基因为靶点设计具有短发夹结构的shRNA序列,经退火成互补双链后克隆入pENTR/U6建立重组表达载体pENTR/U6-SUR;转化E.coli TOP10菌株,挑取阳性菌落进行菌落PCR和测序鉴定;将重组质粒转染前列腺癌细胞株PC3细胞,RT-PCR检测重组质粒对细胞survivin基因mRNA水平的抑制效果。 结果与结论：将设计合成的shRNA序列经退火后克隆至pENTR/U6载体中,菌落PCR可扩增出目的条带,测序结果证实插入片段为所需序列;pENTR/U6-SUR重组质粒转染后PC3细胞survivin基因mRNA表达水平显著下降,且24 h比48 h作用更明显。成功构建了靶向survivin基因的shRNA质粒表达载体,并证实该载体显著下调了PC3细胞中survivin基因mRNA水平。     

分化型胚胎软骨发育基因1特异性小干扰RNA表达质粒的构建和鉴定

背景：分化型胚胎软骨基因1可调控肿瘤生长、凋亡、衰老相关因子，与肿瘤的发生发展有着重要的联系。 目的：构建针对人分化型胚胎软骨基因1的小干扰RNA表达载体。 方法：从NCBI中查找人分化型胚胎软骨基因1基因全长mRNA序列，利用Katahdin提供的在线小干扰 RNA模板序列设计软件，设计针对分化型胚胎软骨基因1的2条shRNA 的 DNA 模板单链，合成靶向分化型胚胎软骨基因1基因转录可形成茎环结构的寡聚核苷酸，退火后与酶切后的pGreenPuro™ shRNA Cloning and Expression Lentivector质粒连接，在JM-109菌株中扩增，并进行质粒DNA琼脂糖凝胶电泳分析、紫外分光光度计检测、菌落PCR以及测序鉴定。 结果与结论：将含有分化型胚胎软骨基因1目标序列25 bp 的双链 DNA插入片段，连接到pGreenPuro™ shRNA Cloning and Expression Lentivector质粒形成重组质粒。质粒DNA琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分析结果确认所提质粒纯度较高，可用于后续实验。菌落PCR结果表明产物大小约为170 bp，与预期相符。测序结果表明pGreenPuro™ shRNA Cloning and Expression Lentivector质粒已经插入人分化型胚胎软骨基因1的干扰合成片段，无碱基突变。成功构建了靶向分化型胚胎软骨基因1-小干扰 RNA表达载体。     

稳定整合靶向性14—3—3ζ基因RNA干涉载体的胶质瘤细胞系建立

目的构建针对细胞凋亡抑制蛋白14-3-3ζ基因的特异性RNA干涉载体,并建立稳定转染该干涉载体的人胶质瘤细胞系。方法根据14-3-3ζ编码序列,设计并合成针对14-3-3ζ基因的特异性RNA干涉片断,并将其克隆入pSilencer3．1．H1neo干涉载体中,构建14-3-3ζ基因shRNA真核表达载体pSilencer-14-3-3ζ。重组载体pSilencer-14-3-3ζ和pSilencer3．1-Hlneo阴性对照载体pSilencer3．1-HlneoNegative经脂质体LipofectamineTM2000介导法转染胶质瘤细胞株U251;转染细胞经过G418筛选,采用Westernblot方法分别在蛋白水平检测、筛选G418抗性的克隆细胞。结果酶切鉴定和核苷酸序列分析证实,成功构建了14-3-3ζ基因shRNA真核表达载体pSilencer-14-3-3ζ,经酶切、测序鉴定证实克隆正确。获得了稳定转染pSilencer-14-3-3ζ载体的胶质瘤细胞株。结论14-3-3ζ基因特异性RNA干涉载体能够显著抑制14-3-3ζ基因在U251细胞中的表达,这为进一步研究14-3-3ζ在胶质瘤细胞系U251中的生物学功能和作用机制奠定了实验基础。     

核受体相关因子1 shRNA表达载体的构建及其对多巴胺能细胞内源基因的干扰作用

目的 构建小鼠核受体相关因子1（Nurr1）shRNA的真核表达载体,并检测其对多巴胺能细胞内源基因的干扰作用.方法 构建两个针对Nurr1的RNA干扰重组表达载体,分别命名为pSC-N1和pSC-N2.经测序确认后,转染多巴胺能神经前体细胞系MN9D细胞株,以实时荧光定量PCR以及Western blot方法检测转染后Nurr1 mRNA和蛋白的表达.结果 测序鉴定证实合成的siRNA基因序列正确并已被准确克隆入pSilenCircle载体.pSC-N1和pSC-N2可特异性抑制MN9D细胞中Nurr1 mRNA的表达,下降率分别为62.3%和45.6%;Nurr1蛋白的表达亦明显下调,其下降率分别为57.4%和72.0%,而对照质粒对其无抑制作用.结论 成功构建了能特异性抑制多巴胺能细胞内源Nurr1表达的shRNA表达载体,为多巴胺能神经元发育以及帕金森病相关基因的功能研究奠定了基础.     

人KiSS-1基因克隆及其慢病毒载体的构建**★

背景：慢性病毒载体技术是目前转基因中最有效和最成功的方法，技术操作简便。 目的：克隆转移抑制基因KiSS-1基因不含信号肽的表达序列，构建人KiSS-1基因的慢病毒表达载体。 设计、时间及地点：开放性实验于2006-09/2007-12在福建师范大学发育学院实验室完成。 材料：载体pNL-IRES2-EGFP由福建师范大学发育学院实验室保存。 方法：从人正常胎盘组织中提取总RNA，经反转录-聚合酶链反应得到KiSS-1基因开放阅读框cDNA序列，并将其克隆到慢病毒载体pNL-IRES2-EGFP中，构建其表达质粒pNL-IRES2-EGFP-KiSS-1。 主要观察指标：KiSS-1目的基因片段的克隆，重组表达质粒pNL-IRES2-EGFP-KiSS-1的酶切鉴定及测序。 结果：经酶切鉴定和基因序列测定，证实重组入载体pNL-IRES2-EGFP的片段为目的基因开放阅读框的核苷酸序列。 结论：成功构建了重组质粒pNL-IRES2-EGFP-KiSS-1。