蜂蜜治疗糖尿病创面与内皮祖细胞的动员*

背景：研究表明溃疡愈合的重要过程之一为溃疡的基质中形成新生血管,而骨髓来源的内皮祖细胞在这一过程中起到重要作用。骨髓来源的内皮祖细胞由骨髓向外周血动员以及其向溃疡处移行将有助于在溃疡处形成新生血管从而促进溃疡愈合,基质细胞衍生因子1α正是循环中调节血管生成前体细胞向受损组织移行的关键分子。 目的：观察蜂蜜治疗后内皮祖细胞动员情况以及对基质细胞衍生因子1α表达的影响。 方法：在链脲佐菌素介导的糖尿病大鼠模型的背部制造一个直径1.8 cm的全层皮肤创面,随机分成蜂蜜组和生理盐水组,观察两组的创面变化。流式细胞仪测定大鼠外周血中内皮祖细胞的数量。实时定量PCR测定局部组织中基质细胞衍生因子1α的表达。 结果与结论：在伤后3,7 d 蜂蜜组创面愈合面积比生理盐水组明显增加(P < 0.05);创面模型建立后3 d,外周血内皮祖细胞明显增加(P < 0.05);实时定量PCR检测创面组织中基质细胞衍生因子1α mRNA的表达与生理盐水组相比较明显增强。结果提示蜂蜜可能通过基质细胞衍生因子1α的生成促进内皮祖细胞的动员,进而参与新生血管生成,促进糖尿病大鼠创面愈合。     

缺氧诱导因子1α小干扰RNA对骨髓间充质干细胞缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子基因表达的影响*

背景：缺氧可以影响骨髓间充质干细胞分泌细胞因子,其机制可能是通过缺氧诱导因子1α起作用的。 目的：观察缺氧诱导因子1α RNA干扰对骨髓间充质干细胞缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子基因表达的影响。 方法：贴壁法培养骨髓间充质干细胞,取第3~5代细胞用于实验,倒置显微镜下观察细胞形态,并用流式细胞仪检测其表面标志物CD34、CD44、CD90表达。将骨髓间充质干细胞分四组：常氧对照组(无干预因素)、缺氧组(缺氧24 h)、脂质体对照组(转染空载脂质体后缺氧24 h)、RNA干扰组(转染脂质体介导的RNA干扰序列后缺氧24 h)。RT-PCR法检测骨髓间充质干细胞的缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子 mRNA表达水平, ELISA检测骨髓间充质干细胞培养上清缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子蛋白表达水平。 结果与结论：同常氧对照组比较,缺氧组缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1 α和血管内皮生长因子基因及蛋白表达增高(P < 0.05);同脂质体对照组比较,RNA干扰组缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子基因及蛋白表达降低(P < 0.05)。证实了缺氧条件可以使骨髓间充质干细胞血管内皮生长因子和基质细胞衍生因子1α的表达增加,抑制缺氧诱导因子1α的表达可以使血管内皮生长因子和基质细胞衍生因子1α的表达减少,缺氧诱导因子1α很可能是干细胞移植细胞因子分泌的调控因素。     

基质细胞衍生因子1α及受体CXCR4对颈总动脉球囊损伤血管平滑肌细胞和骨髓基质细胞的影响

背景：在细胞因子的作用下,骨髓基质细胞可以向内皮祖细胞分化,并迁移至损伤部位增殖,参与血管新生内膜的修复。 目的：观察基质细胞衍生因子1α及其受体CXCR4在大鼠颈总动脉球囊损伤后对血管平滑肌细胞和骨髓基质细胞的影响。 方法：体外培养大鼠颈总动脉球囊损伤后各时间点(即刻、1,4,7,14及1个月)的血管平滑肌细胞和骨髓基质细胞,检测损伤后平滑肌细胞中基质细胞衍生因子1α及骨髓基质细胞中CXCR4的表达情况,并应用基质细胞衍生因子1α siRNA转染损伤后血管平滑肌细胞,同时应用transwell 小室观察基质细胞衍生因子1α和损伤后血管平滑肌细胞对骨髓基质细胞的趋化作用。 结果与结论：大鼠颈总动脉球囊损伤后,平滑肌细胞中基质细胞衍生因子1α mRNA表达开始增加,至损伤第7天后逐渐减弱;血管损伤后4 d起,骨髓基质细胞中CXCR4 mRNA开始出现,并持续表达;transwell小室显示损伤后的骨髓基质细胞对基质细胞衍生因子1α的趋化性增强;CXCR4受体拮抗剂AMD3100可以明显减弱基质细胞衍生因子1α对骨髓基质细胞的趋化作用;损伤后的血管平滑肌细胞对骨髓基质细胞的趋化作用强于基质细胞衍生因子1α(P < 0.05),应用AMD3100干预或细胞内转染基质细胞衍生因子1α siRNA后,此趋化作用亦减弱(P < 0.05)。结果提示,基质细胞衍生因子1α/CXCR4轴在骨髓基质细胞向损伤血管迁移中起重要的作用。     

骨髓基质细胞及血管内皮祖细胞共移植对局灶性脑缺血大鼠系列生长因子表达的影响

目的 观察经静脉移植骨髓基质细胞(BMSCs)及血管内皮祖细胞(EPCs)后血管内皮生长因子(VEGF)、基质细胞衍生因子-1(SDF-1)、碱性成纤维生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、转化生长因子β(TGF-β)、血小板源性生长因子(PDGF)、脑源性生长因子(BDNF)、胶质源性生长因子(GDNF)和神经生长因子(NGF)这9种细胞因子的表达. 方法 80只健康成年Wistar 大鼠按照随机数字表法分为模型对照组、BMSCs移植组、EPCs移植组及联合移植组,每组20只.线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞模型.造模24h后,分别取浓度为3x106个/mL的BMSCs、EPCs悬液及两者混合液1mL经鼠尾静脉移植入BMSCs移植组、EPCs移植组及联合移植组;模型对照组鼠尾静脉注射1 mL生理盐水.移植后7d,实时荧光PCR、Western boltting检测各组大鼠脑内生长因子的表达. 结果 联合移植组中bFGF、VEGF、BDNF mRNA表达水平最高,与其他3组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).BMSCs移植组中NGF、GDNF、TGF-β mRNA表达水平最高,与其他3组比较差异均有统计学意义(P＜0.05),联合移植组次之.EPCs组中PDGF-BB、IGF-1、SDF-1 mRNA表达水平最高,与其他3组比较差异均有统计学意义(P＜0.05),联合移植组次之. 结论 BMSCs及EPCs联合静脉移植可上调脑内生长因子表达水平,为提高细胞移植效率提供了新的尝试途径.     

脐血血管内皮祖细胞移植对心肌梗死血管形成的影响

背景：人体内存在一种能以血管发生方式形成新生血管的内皮祖细胞,更新了传统意义上的出生后血管生成、血管损伤修复的理论。 目的：观察犬脐血血管内皮祖细胞移植对梗死心肌血管形成的影响。 设计、时间及地点：细胞学体内实验,于2006-05/2007-03在新华医院实验中心完成。 材料：接近足月的妊娠杂种犬1只,用于制备脐血血管内皮祖细胞;成年犬36只,随机分为细胞移植组、模型对照组,18只/组。 方法：2组犬均于冠状动脉前降支第1对角支分出后结扎建立急性心肌梗死模型。细胞移植组向冠状动脉内注射含5×106个血管内皮祖细胞(经BrdU标记)的生理盐水2 mL,模型对照组同法注射单纯等量生理盐水。移植后1,4,8周处死取材。 主要观察指标：心肌标本苏木精-伊红染色确认梗死模型,BrdU免疫组化染色观察心肌血管新生情况,vW因子染色观察梗死心肌血管数。 结果：心肌梗死区可见大量的瘢痕组织、成纤维细胞以及小血管形成。细胞移植组梗死心肌区小血管上可见部分细胞核内有棕黄色颗粒,BrdU呈阳性表达;模型对照组无明显新生血管。细胞移植组在心肌缺血区和梗死区血管内皮细胞的胞浆内有棕黄色颗粒,vW因子呈阳性表达;模型对照组不表达vW因子。心肌梗死后第1,4,8周,细胞移植组和模型对照组的心肌缺血区、梗死区的血管数均无明显差异(P > 0.05)。 结论：犬脐血血管内皮祖细胞移植至梗死心肌后可参与血管形成,但尚不能够促进心肌的血管再生。     

脂肪来源神经干细胞移植局灶性脑缺血模型大鼠的血管新生

背景：脂肪组织来源的神经干细胞移植可改善脑缺血大鼠神经功能,但其机制尚不明确。 目的：观察人脂肪组织来源神经干细胞移植对大鼠局灶性脑缺血后血管新生的影响。 方法：体外培养脂肪基质细胞,诱导分化为神经干细胞。60只健康雄性SD大鼠分为4组：正常组6只,假手术组6只,缺血对照组24只,移植治疗组24只。后两组线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血2 h再灌注模型,又分为缺血2 h再灌注7,14,21,28 d组,每个时点各6只。假手术组不闭塞大脑中动脉。造模成功后24 h,移植治疗组经尾静脉移植人脂肪组织来源神经干细胞悬液,细胞浓度为2×109 L-1;缺血对照组经尾静脉注射生理盐水。免疫组织化学法进行微血管密度计数,观察脑缺血区血管增生情况。 结果与结论：免疫组织化学结果显示,与缺血对照组比较,移植治疗组缺血2 h再灌注7,14,21,28 d的微血管密度值均显著高于缺血对照组,差异有显著性意义(P < 0.05~0.01)。提示脂肪组织来源的神经干细胞移植可促进脑缺血区新生血管的形成。     

基质细胞衍生因子1及其受体CXCR4对人骨髓间充质干细胞向

背景：近年研究发现移植的骨髓间充质干细胞能向颅内创伤、脑卒中、炎症和变性疾病等病灶部位迁移,进而发挥治疗作用,但对于其向病灶定向迁移的具体机制还不十分清楚。 目的：探讨基质细胞衍生因子1及其受体 CXCR4在移植的骨髓间充质干细胞趋向缺血脑组织迁移中的作用。 设计、时间及地点：细胞学体内实验,于2008-02/2009-02在解放军第三军医大学新桥医院中心实验室进行。 材料：骨髓标本取自解放军第三军医大学附属新桥医院血液科收治的15~40岁正常或原发病未累及骨髓患者,三四月龄健康雄性SD大鼠72只由解放军第三军医大学野战外科研究所实验动物中心提供。 方法：密度梯度离心贴壁筛选法分离纯化、体外培养人骨髓间充质干细胞。54只大鼠参照Nagasawa线栓法制备局灶性脑缺血再灌注模型,剩余18只作为假手术组,仅插入线栓10 mm。模型组及假手术组大鼠各取9只,分别于造模后第2,4,8天,采用Real-time PCR和免疫组织化学法定量分析缺血脑组织基质细胞衍生因子1表达变化。剩余36只脑缺血再灌注模型鼠随机分为细胞移植组、溶液对照组,18只/组,于再灌注后24 h分别从尾静脉缓慢注入1 mL人骨髓间充质干细胞悬液(含2×109 L-1个细胞)或1 mL PBS。 主要观察指标：人骨髓间充质干细胞CXCR4 mRNA和蛋白的表达,缺血再灌注后脑组织基质细胞衍生因子1 mRNA和蛋白表达变化,免疫组织化学检测人骨髓间充质干细胞向缺血脑组织的迁移和分布。 结果：RT-PCR结果发现人骨髓间充质干细胞表达CXCR4 mRNA,免疫细胞化学染色发现CXCR4主要表达于人骨髓间充质干细胞的胞膜和胞浆。脑缺血再灌注损伤后2,4,8 d,趋化因子基质细胞衍生因子1 mRNA水平呈上升趋势,与假手术组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。经静脉移植的人骨髓间充质干细胞定向迁移到脑损伤区域,并大量分布于基质细胞衍生因子1高表达的缺血半暗区,损伤侧大脑半球人骨髓间充质干细胞数量显著高于对侧半球(P < 0.01)。 结论：基质细胞衍生因子1及其受体CXCR4参与并促进人骨髓间充质干细胞向脑缺血再灌注损伤区的迁移。     

心肌梗死大鼠体外培养心肌组织对间充质干细胞迁移的作用

背景：间充质干细胞具有改善心脏功能的潜力,间充质干细胞移植后向心脏归巢的机制尚不完全清楚。 目的：观察心肌梗死大鼠体外培养的心肌组织对间充质干细胞迁移的作用及可能机制。 方法：建立大鼠心肌梗死模型,培养大鼠心脏组织块,密度梯度离心及贴壁筛选法分离培养骨髓间充质干细胞,24只SD大鼠随机抽签法分为心肌梗死组、假手术组及正常对照组。假手术组只穿线不结扎,正常对照组不做任何处理。荧光染料DAPI标记间充质干细胞,利用transwell模型进行共培养,共培养48 h。荧光镜下计数迁移细胞数,CD34/CD44免疫细胞化学染色进行迁移细胞定性,免疫荧光检测迁移细胞CXCR4的表达情况,心脏组织切片行免疫组织化学染色检测基质细胞衍生因子1的表达情况并进行平均吸光度分析。 结果与结论：心肌梗死组单位视野迁移细胞数显著高于假手术组(P < 0.05),正常对照组未见迁移细胞。免疫细胞化学染色显示迁移细胞CD44阳性而CD34阴性,符合间充质干细胞特点,其膜受体CXCR4阳性表达。心肌梗死组及假手术组心脏切片基质细胞衍生因子1阳性表达,正常对照组心肌组织不表达基质细胞衍生因子1。心肌梗死组心脏组织基质细胞衍生因子1平均吸光度显著高于其他组别(P < 0.05)。提示心肌梗死后大鼠心脏组织能促进间充质干细胞迁移,这一效应的实现可能与基质细胞衍生因子1-CXCR4轴的作用有关。     

基质细胞衍生因子1α促进皮肤创面的新血管形成

背景：基质细胞衍生因子1α是有促进血管生成作用的CXC类趋化因子,研究发现其在调节一些重要组织/器官的损伤修复过程中有重要作用,但对其在皮肤创伤愈合过程中的作用还不很清楚。 目的：观察基质细胞衍生因子1α在创面新生血管形成过程中的作用。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2008-06/08在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究六室完成。 材料：SPF级昆明小鼠60只,雌雄不拘,体质量25~30 g;基质细胞衍生因子1α抗体为美国Santa Cruz Biotechnology公司产品。 方法：建立小鼠背部全层皮肤缺损伤模型,分为3组,即对照组,10 mg/L 基质细胞衍生因子1α抗体组和20 mg/L 基质细胞衍生因子1α抗体组,每组20只。各组分别在创面及创周连续6 d注射不同质量浓度的基质细胞衍生因子1α抗体(0,10,20 mg/L)。 主要观察指标：创伤后3,4,5,6,7 d,以半定量反转录-聚合酶链反应检测创面CD146表达情况,并观察创面微血管密度及创面收缩率。 结果：伤后各天,10 mg/L抗体组和20 mg/L抗体组CD146 mRNA表达和微血管密度均少于对照组(P < 0.05),伤后5,6,7 d,抗体组CD146 mRNA表达和微血管密度多于3,4 d(P < 0.05);伤后6,7 d,10 mg/L 抗体组创面收缩率低于对照组 (P < 0.05),伤后5,6,7 d,20 mg/L 抗体组创面收缩率低于对照组(P < 0.05),抗体组间仅在伤后7d差异有显著性意义(P < 0.05)。 结论：阻断创面基质细胞衍生因子1α作用,能够降低创面新血管化程度,从而可能影响创面愈合速度。     

脐血内皮祖细胞尾静脉与局部注射治疗糖尿病下肢缺血

背景：内皮祖细胞治疗糖尿病下肢缺血临床及动物实验多采用局部肌肉注射。 目的：比较脐血内皮祖细胞鼠尾静脉与局部注射治疗糖尿病下肢缺血效果的差异。 方法：取Wistar雄性大鼠分成5组：①糖尿病射线照射后结扎双后肢股动脉,尾静脉注射内皮祖细胞(DLV)。②糖尿病结扎双后肢股动脉左后肢局部肌肉注射PBS(DLC),右后肢局部肌肉注射内皮祖细胞(DLM)。③正常大鼠射线照射后结扎双后肢,尾静脉注射内皮祖细胞(NLV)。④糖尿病不结扎不注射内皮祖细胞(DC)。用绿色荧光示踪内皮祖细胞,苏木精-伊红染色检测肌纤维间毛细血管数,RT-PCR检测双后肢肌肉血管内皮生长因子mRNA水平。 结果与结论：DLV组与DLM组比较,右后肢腓肠肌溃疡及缺血好转明显,二者无明显区别;有明显荧光,差别不明显,Ⅷ因子免疫组织化学染色肌纤维间毛细血管数多,相互间无明显差别;腓肠肌血管内皮生长因子表达差异无显著性意义(P > 0.05)。提示脐血内皮祖细胞治疗糖尿病大鼠下肢缺血尾静脉注射与局部肌肉注射效果相当。