肾上腺髓质素基因转染改善缺氧培养骨髓间充质干细胞的抗凋亡能力*

背景：基因转染可以提高骨髓间充质干细胞在移植区的存活,但目前对肾上腺髓质素基因转染骨髓间充质干细胞在缺氧条件下增殖、凋亡及分泌情况的研究很少。 目的：观察肾上腺髓质素基因转染对骨髓间充质干细胞在缺氧及无血清培养条件下增殖、凋亡、分泌血管内皮生长因子的影响。 方法：贴壁法体外分离、扩增培养大鼠骨髓间充质干细胞。用x-gal染色测含肾上腺髓质素基因的重组腺病毒Ad-ADM对骨髓间充质干细胞的感染率。骨髓间充质干细胞分为未转染组、空载体组、Ad-ADM转染组。在缺氧、无血清条件下进行骨髓间充质干细胞的培养,在缺氧0,3,6,9,12,16,20,24 h CCK-8法检测细胞增殖情况,ELISA法检测检测细胞上清液肾上腺髓质素及血管内皮生长因子表达,TUNEL法检测细胞凋亡情况。 结果与结论：重组腺病毒对骨髓间充质干细胞的转染率与病毒感染复数具有量效关系,病毒感染复数为150时细胞的感染率达95.4%。缺氧、无血清培养条件下,3组骨髓间充质干细胞均出现生长抑制、凋亡增加,但是肾上腺髓质素基因转染组于0,3,6,9,12,16 h细胞凋亡率显著低于其他两组(P﹤0.05)。缺氧 9,12 h,骨髓间充质干细胞分泌肾上腺髓质素及血管内皮生长因子达到高峰,且Ad-ADM转染组显著增高于其他两组(P﹤0.05)。提示在缺氧、无血清培养条件下 (<20 h),肾上腺髓质素基因转染可增强骨髓间充质干细胞抗凋亡能力,这可能与肾上腺髓质素、血管内皮生长因子表达增加有关。     

超极化激活环化核苷酸门控通道基因转染猪骨髓间充质干细胞

背景：研究证实超极化激活环化核苷酸门控通道（hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated,HCN）电流在调控心脏的自发搏动中起着非常重要的作用。 目的：观察HCN2基因重组腺病毒转染后猪骨髓间充质干细胞目的基因的表达及电生理特征。 设计、时间及地点：细胞-基因学体外观察,于2007-07/2008-03在解放军第二军医大学胸心外科实验室完成。 材料：Yorkshire猪由解放军第二军医大学动物所提供,HCN2质粒由意大利Dario DiFrancesco教授惠赠,重组腺病毒Ad.HCN2由本实验室采用Ad5系统构建并保存。 方法：Percoll密度梯度离心+贴壁法体外分离纯化猪骨髓间充质干细胞,以感染复数=50进行Ad.HCN2转染,同时设立未转染组和转染Ad.Null组。 主要观察指标：通过RT-PCR、免疫荧光染色检测各组细胞HCN2 mRNA和蛋白的表达,用全细胞膜片钳检测各组细胞电生理学变化。 结果：未转染组和转染Ad.Null组均未见扩增片段,而Ad.HCN2扩增后在250~500 bp可见扩增片段,与携带HCN2基因的质粒扩增出的片段位置相同。转染后细胞核染色强度明显弱于胞膜和胞浆,与HCN2蛋白的分布相符合,未转染组及转染Ad.Null组无HCN2蛋白阳性表达。全细胞膜片钳可记录到起搏电流,其激活电位约为-60 mV,完全激活电位-140 mV,呈电压依赖性,当给予4 mmol/L CsCl后,内向的起搏电流即被明显抑制;未转染组及转染Ad.Null组细胞均无起搏电流。 结论：通过起搏基因HCN2重组腺病毒载体可成功转染猪骨髓间充质干细胞,使其能够表达HCN2通道蛋白,全细胞膜片钳可检测到起搏电流。     

重组腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因转染兔骨髓间充质干细胞

背景：目前仍没有合适的标记方法追踪观察兔骨髓间充质干细胞组织修复及基因治疗的效果。 目的：观察重组腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因在兔骨髓间充质干细胞中的表达,及转染后干细胞活性的变化,以寻找稳定标记兔骨髓间充质干细胞的方法。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-03/05在南京市第一医院骨科干细胞实验室完成。 材料：健康2月龄纯种新西兰大白兔4只,由南京医科大学实验动物基地提供。重组腺病毒Ad5/F35-EGFP为北京本元正阳基因有限公司产品。 方法：用密度梯度离心法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,贴壁法纯化扩增。取传至第4代细胞,流式细胞仪检测细胞标志的表达,消化离心重悬后进行计数,平均分成5组,每组细胞数5.0×105个,接种于25 m2培养瓶,空白组加入50 μL的PBS液,剩余4组加入重组腺病毒Ad5/F35-EGFP进行转染,感染复数(MOI)分别为10,20,50,100,继续传代培养。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞的生长状态及表面标志鉴定,转染后骨髓间充质干细胞增强型绿色荧光蛋白的表达及活性变化。 结果：原代培养48 h后见细胞贴壁,8 d时细胞铺满瓶底80%以上,绝大多数呈梭形,传代后细胞增殖速度加快,三四天即可传代,第4代细胞CD29和CD44呈阳性表达,CD34与CD45呈阴性表达。转染后24 h可见绿色荧光,7 d时荧光最强,细胞转染率与感染复数值的呈线性增长关系,至49 d时仍可见绿色荧光。转染后0,7,14,28,49 d,感染复数=50组的骨髓间充质干细胞数量均与空白组基本相似(P均> 0.05),即转染后细胞增殖能力无明显变化。 结论：重组腺病毒载体能高效标记骨髓间充质干细胞,感染复数为50时较为理想,增强型绿色荧光蛋白基因可持续表达49 d,且标记后不影响骨髓间充质干细胞的增殖活性。     

白细胞介素12重组腺病毒质粒转染骨髓间充质干细胞

背景：有研究表明,骨髓间充质干细胞易于外源基因的导入和表达,且具有较弱的免疫抗原性和免疫调节功能,强大的迁移力和趋瘤性,因而逐渐显露其具有作为抗肿瘤基因治疗负载体系的优越性。 目的：拟应用白细胞介素12重组腺病毒质粒AdEasy-白细胞介素12转染骨髓间充质干细胞,构建表达外源性白细胞介素12的骨髓间充质干细胞。 设计、时间及地点：以细胞为对象的开放性实验,于2008-06在辽宁医学院实验中心及中国医科大学实验中心完成。 材料：原代骨髓间充质干细胞由辽宁医学院外科学实验室构建,白细胞介素12重组腺病毒载体AdIL-12由辽宁医学院分子生物学实验室构建。 方法：分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,免疫组织化学及流式细胞技术鉴定细胞表面标志物,应用腺病毒介导白细胞介素12基因转染大鼠骨髓间充质干细胞。 主要观察指标：以反转录-聚合酶链反应及Western Blotting技术检测转染后的骨髓间充质干细胞的白细胞介素12基因mRNA及蛋白表达。 结果：腺病毒介导白细胞介素12基因转染骨髓间充质干细胞后,通过反转录-聚合酶链反应及Western Blotting技术检测,结果证实白细胞介素12基因在mRNA及蛋白水平均有表达,而未经转染的骨髓间充质干细胞内无白细胞介素12基因及蛋白表达。 结论：应用白细胞介素12重组腺病毒质粒成功构建了在mRNA及蛋白水平表达外源性白细胞介素12基因的骨髓间充质干细胞。     

绿色荧光蛋白基因腺病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞的实验*

背景：以骨髓间充质干细胞作为种子细胞,把干细胞和基因治疗结合起来是研究中枢神经系统损伤和肿瘤治疗新的思路和趋势。 目的：观察腺病毒载体绿色荧光蛋白基因(Ad-GFP)在兔骨髓间充质干细胞转染和表达的量效关系及对细胞生物学特性的影响,探讨用该载体构建基因修饰骨髓间充质干细胞的可行性。 设计、时间及地点：随机分组设计,对比观察,于2008-08/2009-03在南方医科大学完成。 材料：新西兰大白兔,雌雄不拘,质量2.0~3.0 kg。 方法：体外分离培养兔骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞免疫表型,293细胞包装制备病毒,以不同滴度的Ad-GFP(1×103~1×1010 PFU/mL)转染骨髓间充质干细胞,细胞计数法分析转染率。 主要观察指标：倒置显微镜观察细胞形态学改变,CCK8法检测细胞增殖活性,用血清撤离加入β-巯基乙醇诱导感染Ad-GFP BMSCs向神经样细胞的定向分化。 结果：3~6代骨髓间充质干细胞表面标志CD34、CD45阴性,而CD29、CD44阳性。当病毒滴度为1×107 PFU/mL时感染率为55%,1×109,1×1010 PFU/mL感染率均为85%,但1×1010 PFU/mL时出现细胞病理现象,7 d荧光表达最强,28 d仍可见荧光表达。感染Ad-GFP的骨髓间充质干细胞经β-巯基乙醇诱导可分化为神经元样细胞,神经元特异性烯醇化酶表达阳性。 结论：合适滴度的Ad-GFP可以高效感染骨髓间充质干细胞,对细胞的生物学特性影响较小,不影响诱导分化功能,骨髓间充质干细胞可以作为Ad-GFP载体系统进行基因治疗研究的种子细胞。     

Ad5-增强型绿色荧光蛋白和rAAV2-增强型绿色荧光蛋白转染脂肪间充质干细胞的对比*

背景：利用基因转染技术诱导脂肪间充质干细胞成软骨细胞已有报道,但腺病毒和腺相关病毒转染脂肪间充质干细胞各有不同,且腺相关病毒载体能否转染脂肪间充质干细胞众说不一。 目的：观察Ad5-增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和rAAV2-EGFP转染脂肪间充质干细胞后增强型绿色荧光蛋白的表达及转染后细胞增殖能力的变化。 方法：脂肪组织来源于6月龄新西兰大白兔颈背部。机械消化和酶消化法分离提取脂肪间充质干细胞,体外培养扩增。分别采用腺病毒载体(Ad5-EGFP)和腺相关病毒载体(rAAV2-EGFP)转染脂肪间充质干细胞,并观察EGFP的表达。rAAV2-EGFP转染后,需加入2 μL丁酸钠(1 mol/L)。采用MTT法检测基因转染对脂肪间充质干细胞增殖能力的影响。 结果与结论：体外培养的脂肪间充质干细胞呈扁平状和长梭形,细胞形态均一,传代稳定。Ad5-EGFP组和rAAV2-EGFP组均能观察到较多荧光细胞,转染效率分别达到88%和83%。腺病毒和腺相关病毒载体均能转染脂肪间充质干细胞,且转染效率很高。腺相关病毒需要借助丁酸钠来提高其基因表达水平。     

构建人HCN4基因重组腺病毒载体及其对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率

背景：超极化激活及环化核苷酸门控阳离子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel, HCN)基因由于具有不增加诱发心律失常的风险、能够接受自主神经系统调节等优势,成为目前最受关注的生物起搏备选基因。 目的：构建携带人HCN4基因的重组腺病毒载体,并测定其对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率。 设计、时间及地点：细胞-基因学体外实验,于2008-02/09在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成。 材料：SD大鼠10只,由中山大学实验动物中心提供。携带目的基因人HCN4 cDNA的质粒pcDNA3.1-HCN4、人胚肾293细胞、大肠杆菌DH5α由中山大学附属第二医院林百欣实验中心保存。腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV、骨架质粒pAdxsi购自北京诺赛基因组研究中心有限公司。 方法：质粒pcDNA3.1-HCN4用Hind Ⅲ+Xba Ⅰ双酶切后回收HCN4片段,亚克隆至pShuttle-CMV中,得到重组穿梭质粒;I-Ceu Ⅰ+I-Sce Ⅰ双酶切处理pShuttle-CMV-HCN4,回收CMV-HCN4片段,亚克隆至腺病毒骨架载体pAdxsi,得到重组腺病毒质粒;重组腺病毒质粒酶切线性化后,应用脂质体法转染293细胞进行包装扩增,得到重组腺病毒AdHCN4;应用AdHCN4转染大鼠骨髓间充质干细胞。 主要观察指标：重组腺病毒质粒载体的鉴定,重组腺病毒的鉴定及滴度测定,重组腺病毒的感染效率。 结果：构建的重组穿梭质粒pShuttle-CMV-HCN4用Hind Ⅲ+Xho Ⅰ双酶切,得到大小为3 600 bp(HCN4)和5 100 bp (pShuttle-CMV)两个片段,DNA测序结果证实人HCN4基因的全长序列已正确插入到pShuttle-CMV穿梭质粒中;重组腺病毒质粒pAdxsi-CMV-HCN4用XhoⅠ酶切得到7个片段,而作为对照的空腺病毒质粒只得到6个片段;重组腺病毒质粒在293细胞中包装后产生的重组腺病毒对293细胞有致病作用;重组腺病毒AdHCN4 PCR鉴定可见657 bp的阳性扩增条带;经多次重复感染后,病毒滴度检测达2.5×1011PFU/mL。成功转染AdHCN4的大鼠骨髓间充质干细胞可表达绿色荧光蛋白,当病毒感染复数值为800,转染效率最高,达90%。 结论：实验成功构建携带人HCN4基因的重组腺病毒载体,并可在体外有效转染大鼠骨髓间充质干细胞。     

5和5/F35型腺病毒载体对人骨髓间充质干细胞转染效率的比较

背景：在以人骨髓间充质干细胞为基础的基因治疗中,提高腺病毒载体对人骨髓间充质干细胞的转染效率尤为重要。 目的：对比观察5和5/F35型腺病毒载体对体外培养的人骨髓间充质干细胞的转染效率。 设计、时间及地点：对比观察,于2008-03/10在解放军北京军区总医院血液科实验室完成。 材料：骨髓来源于解放军北京军区总医院血液科异基因造血干细胞移植中健康供者,均无造血系统疾病。 方法：采用密度梯度离心和贴壁筛选的方法体外分离培养人骨髓间充质干细胞,传至第3代后用流式细胞仪检测人骨髓间充质干细胞表型;按1×104/孔密度接种于24孔板,细胞贴壁后分别换用成骨、成脂诱导液培养,以碱性磷酸酶、油红O染色检测其分化特性。用不同滴度编码增强型绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体Ad5增强型绿色荧光蛋白和Ad5/F35增强型绿色荧光蛋白按5,20,100,400 感染复数转染体外培养的人骨髓间充质干细胞,荧光显微镜下观察。 主要观察指标：流式细胞仪检测增强型绿色荧光蛋白阳性表达率,并用锥虫蓝拒染法检测不同病毒滴度感染后人骨髓间充质干细胞活细胞比例。 结果：人骨髓间充质干细胞表面CD166、CD29、CD73、CD31、CD45、CD34和CD14阳性率分别为95.08%、99.53%、72.26%,1.50%,2.02%,3.80%和4.94%。人骨髓间充质干细胞成骨诱导后14 d碱性磷酸酶染色为阳性,成脂诱导后14 d油红O染色均为阳性。Ad5增强型绿色荧光蛋白和Ad5/F35增强型绿色荧光蛋白按5,20,100,400 感染复数分别感染人骨髓间充质干细胞,2 d后前者增强型绿色荧光蛋白阳性率分别为(0.72±0.14)%,(4.97±0.46)%,(9.80±3.43)%和(45.53±6.32)%;后者增强型绿色荧光蛋白阳性率分别为(24.31±10.55)%,(55.19±13.73)%,(87.68±9.5)%和(96.57±5.64)%。在5,20,100的感染复数,各组细胞存活率均在95%以上。在400的感染复数,细胞存活率明显降低,在90%以下。 结论：Ad5/F35对体外培养的人骨髓间充质干细胞的转染效率明显优于Ad5载体。     

腺病毒介导人转化生长因子β2基因转染诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞的定向分化

背景：前人的工作已证实转化生长因子β1能促进骨髓间充质细胞的增殖,诱导其向软骨细胞分化。 目的：进一步验证人转化生长因子β2(human transforming growth factor-β2,hTGFβ2)基因转染诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化作用。 方法：取清洁级3周龄雄性Lewis大鼠16只,用于分离培养骨髓间充质干细胞。通过腺病毒重组载体Ad-hTGFβ2将外源性hTGFβ2基因转染到体外培养的第2代大鼠骨髓间充质干细胞中,48 h后采用免疫组织化学染色、RT-PCR和Western blotting的方法检测转染细胞中目的基因与软骨特异性蛋白——Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达的情况。 结果与结论：从成体大鼠骨髓组织中培养出骨髓间充质干细胞,体外培养呈成纤维细胞样,能大量稳定增殖传代。Ad-hTGFβ2转染骨髓间充质干细胞获得稳定表达,免疫组织化学染色和Western blotting检测到基因转染细胞中Ⅱ型胶原蛋白的合成表达,RT-PCR检测到Ⅱ型胶原和蛋白多糖aggrecan mRNA的表达。结果提示,从骨髓组织中可获得具有多分化潜能的间充质干细胞,并能在体外稳定增殖传代;Ad-hTGFβ2成功转染骨髓间充质干细胞,诱导其向软骨细胞分化。     

人LIM矿化蛋白1基因腺病毒重组表达载体构建及在犬骨髓间充质干细胞中的表达*◆

背景：研究表明LIM矿化蛋白1在体内和体外都可促使骨发生。 目的：应用Adeasy-1腺病毒系统构建含人LIM矿化蛋白1基因的腺病毒重组体,并感染犬骨髓间充质干细胞,检测其体外表达及诱导成骨作用。 方法：构建重组腺病毒质粒pAd-LMP-1,经人胚胎肾293细胞包装、扩增后得到复制缺陷重组腺病毒Ad-LMP-1,以最佳感染复数值体外感染犬骨髓间充质干细胞,行RT-PCR及 Western Blot检测LIM矿化蛋白1、骨形态发生蛋白7基因的表达。重组Ad-LMP-1和(或)外源性重组人骨形态发生蛋白7处理犬骨髓间充质干细胞,21 d后行矿化(钙)结节茜素红染色分析LIM矿化蛋白1基因的诱导成骨作用。 结果与结论：①将Ad-LMP-1以感染复数值100感染犬骨髓间充质干细胞可获得最佳感染效率,感染后骨髓间充质干细胞能在基因和蛋白水平表达LIM矿化蛋白1,未引起骨形态发生蛋白7基因的表达。②Ad-LMP-1或重组人骨形态发生蛋白7均不能单独促使骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化,两者联合可促使骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化。③实验成功构建重组腺病毒载体Ad-LMP-1,并实现其在犬骨髓间充质干细胞中表达,证实了LIM矿化蛋白1在诱导成骨作用中表现为与外源性重组人骨形态发生蛋白7的协同效应。     

体外培养条件下人骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因的转染与鉴定

背景：骨髓间充质干细胞的定向分化需要合适生长因子的调控,利用细胞因子基因转染促进其生长、定向分化和加速骨缺损修复是近年来研究热点。 目的：探讨在体外培养条件下转染碱性成纤维细胞生长因子基因对人骨髓间充质干细胞生物学特性的影响。 方法：将含人pcDNA3.1-bFGF真核表达载体DH-5α菌扩增,用EndoFree质粒抽提纯化试剂盒抽提质粒,并对所提取的pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒进行酶切鉴定和测序。利用脂质体将pcDNA3.1-bFGF质粒转染到生长良好的P3代骨髓间充质干细胞,G418筛选获得抗性克隆。采用荧光定量PCR、免疫组化、免疫荧光、Western-blot检测转染后骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因及其产物的表达,流式细胞仪检测细胞增殖周期。 结果与结论：脂质体介导pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒转染骨髓间充质干细胞后,转染细胞确实表达碱性成纤维细胞生长因子,且表达部位主要位于胞浆。转染细胞增殖活力加强,处于增殖周期的细胞比例更高(P < 0.05)。提示采用脂质体转染法能将pcDNA3.1-bFGF成功导入体外培养的骨髓间充质干细胞,碱性成纤维细胞生长因子基因转染后可改善骨髓间充质干细胞的生存状态,促进其增殖。     

REST/NRSF基因shRNA慢病毒载体的构建与鉴定***☆◆

背景：神经元限制性沉默因子(REST/NRSF)能负向调控神经元及胰岛细胞分化相关基因的表达。 目的：构建并筛选能高效沉默大鼠REST/NRSF基因的shRNA慢病毒载体。 方法：针对REST/NRSF基因设计4组特异性siRNA靶点,合成靶序列的寡核苷酸序列,退火形成双链DNA,与经Hpa Ⅰ 和Xho Ⅰ双酶切后的pFU-GW-RNAi载体连接产生L-shREST/NRSF慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。包装产生慢病毒颗粒,随后将其感染大鼠骨髓间充质干细胞,采用 Real-time PCR方法检测靶基因在 mRNA 水平的沉默效率。 结果与结论：PCR和测序证实,构建出了REST/NRSF shRNA的慢病毒载体L-shREST/NRSF,并能稳定转染大鼠间充质干细胞,感染效率达100%。4组shRNA序列均有基因沉默效果,并以第3组shRN序列效果最为明显。结果表明,该慢病毒表达载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。     

pDsRed-C1-CDNF真核表达载体在大鼠骨髓间质干细胞中的表达*

背景：骨髓间质干细胞是一类具有多向分化能力的成体干细胞,目前,已有将其作为细胞载体对帕金森病进行治疗的相关报道。 目的：构建pDsRed-C1-CDNF真核表达载体,并诱导其在大鼠骨髓间质干细胞中表达。 方法：通过RT-PCR的方法从小鼠组织中扩增出CDNF基因片段,并在其两端引入Xho I、BamH I限制性内切酶酶切位点,然后将其克隆至pDsRed-C1真核载体,构建pDsRed-C1-CDNF真核表达载体,并通过Lipofectin2000将其转染至大鼠骨髓间质干细胞中。 结果与结论：pDsRed-C1-CDNF真核表达载体经双酶切、单酶切、PCR及测序验证正确,提示已成功构建pDsRed-C1-CDNF真核表达载体并已转染至大鼠骨髓间质干细胞中。     

Nesprin基因RNAi慢病毒载体的构建*

背景：Nesprin蛋白缺失将影响细胞骨架组织和动态平衡,引起细胞骨架刚性丧失或导致细胞过早成熟老化,其对间充质干细胞的作用如何？ 目的：构建Nesprin蛋白siRNA慢病毒载体,并转染骨髓间充质干细胞。 方法：针对Nesprin靶基因序列设计并合成4对miRNA oligo,将4种miRNA干扰质粒转入大鼠血管平滑肌细胞,筛选最有效干扰序列;将最佳干扰序列和pDONR221载体进行重组反应,获得含干扰序列的入门载体,再将入门载体和慢病毒表达目的载体pLenti6/V5-DEST进行重组反应,获得含干扰序列的慢病毒表达载体,转染包装细胞293T细胞,包装慢病毒,以293T细胞GFP蛋白水平测定病毒滴度。慢病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞。 结果与结论：测序证实合成的4对miRNA oligo正确,RT-PCR和western-blot筛选出最佳干扰miRNA质粒为SR-3,成功构建了Nesprin siRNA的慢病毒载体LV-siNesprin。包装慢病毒,浓缩病毒悬液的活性滴度为106 TU/mL。慢病毒成功了转染骨髓间充质干细胞细胞。     

阳离子聚合物载体介导脑源性神经营养因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞

BACKGROUND： Gene therapy is an effective expression of genes within target cells after transferring exogenous target genes. Both vector selection and transfection method are important factors for gene transfection. An ideal gene vector is required for a high transfusion of target gene and an exact introduction of target gene into specific target cells so as to express gene products.
OBJECTIVE： To study the expression of mRNA and protein after transfecting rat bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） with brain-derived neurotrophic factor （BDNF） genes based on cationic polymer vector.
DESIGN, TIME AND SETTING： A randomized, controlled in vitro study using gene engineering, performed at the Neurobiology Laboratory, Xuzhou Medical College between October 2007 and April 2008.
MATERIALS： PcDNA3.1 BDNF was obtained from Youbiai Biotechnological Company, Beijing and cationic polymer vector used was the SofastTM gene transfection reagent that was made by Taiyangma Biotechnological Co., Ltd., Xiamen.
METHODS： BMSCs extracted from six Sprague Dawley （SD） rats aged 1 month were isolated and cultured in vitro. Third passage BMSCs were inoculated on a 6-well culture plate at the density of 1×106 cells/L. At about 80% confluence, BMSCs were transfected with PcDNA3.1-BDNF （2 μg） combined with SofastTM gene transfection reagent （6 μg） （BDNF group） or with PcDNA3.1 （2 μg） combined with SofastTM gene transfection reagent （6 μg） （blank vector group）. Cells that were not transfected with any reagents but still cultured under primary culture conditions were used as a non-transfection group.
MAIN OUTCOME MEASURES： Enzyme linked immunosorbent assay was used to measure time efficiency of BMSC-secreted BDNF protein. Twenty-four hours after gene transfection, RT-PCR was used to detect expression of BDNF mRNA in the BMSCs. Immunohistochemistry was used to determine expression of BDNF protein in the BMSCs.
RESULTS： BDNF protein expression was detected at day 1 after gene transfection, rapidly increased after 5–9 days and gradually increased after 11–15 days in the BDNF group; moreover, BDNF protein expression was higher than that in the non-transfection group and the blank vector group at different time points （P 〈 0.01）. Additionally, BDNF mRNA expression in the BDNF group was higher than that in the blank vector group and the non-transfection group （P 〈 0.01）.
CONCLUSION： A cationic polymer vector can effectively mediate the BDNF gene to transfect BMSCs; genetically modified BMSCs can express BDNF protein effectively for a long term.     

构建稳定表达血管内皮细胞生长因子 的人间充质干细胞

背景：血管内皮细胞生长因子可有效治疗缺血性心脏病,但其在体内难以保持持续的有效浓度。 目的：构建稳定表达血管内皮细胞生长因子的人骨髓间充质干细胞株,检测经基因转染后外源基因的表达。 设计、时间及地点：观察实验,于2006-03/2007-04在上海胸科医院完成。 材料：人骨髓间充质干细胞株、血管内皮细胞生长因子由上海市胸科医院胸部肿瘤研究所基础实验室提供。 方法：扩增血管内皮细胞生长因子片断,构建pcPGK- hVEGF 165真核表达质粒,利用脂质体介导转染人骨髓间充质干细胞,然后进行阳性细胞克隆筛选。 主要观察指标：以RT-PCR、PCR、Western Blot、 ELISA 方法检测在稳定转染了pcPGK-VEGF165-IRES-GFP的3株细胞和稳定转染pcPGK- IRES-GFP的3株细胞中,人血管内皮细胞生长因子165在人骨髓间充质干细胞中的表达情况。 结果：扩增血管内皮细胞生长因子后,成功了构建质粒 pcPGK-hVEGF165,并利用脂质体顺利转染了人骨髓间充质干细胞,并筛选出稳定表达的细胞株。RT-PCR、PCR检测结果显示,在稳定转染血管内皮细胞生长因子骨髓间充质干细胞中表达的血管内皮细胞生长因子165信使RNA明显高于对照及未转染的人骨髓间充质干细胞,Western Blot、ELISA检测结果显示,稳定转染血管内皮细胞生长因子人骨髓间充质干细胞及培养上清中的血管内皮细胞生长因子蛋白明显高于对照及未转染的人骨髓间充质干细胞。 结论：采用脂质体介导基因转移技术可将人血管内皮细胞生长因子165顺利转染人骨髓间充质干细胞中,并获得稳定表达血管内皮细胞生长因子165的细胞株。     

反转录病毒介导基质金属蛋白酶特异性组织抑制剂1基因转染骨髓间充质干细胞的成骨能力

背景：间充质干细胞成骨分化早期是成骨性细胞外基质细胞外间质的堆积,其主要成分均是基质金属蛋白酶特异性组织抑制剂1(tissue Inhibitor of Metalloproteinases 1,TIMP-1)作用的基质金属蛋白酶作用底物,通过增加TIMP-1的表达,是否可以抑制基质金属蛋白酶的活性,进而影响间充质干细胞的成骨分化能力？ 目的：观察反转录病毒介导TIMP-1基因转染骨髓间充质干细胞的成骨能力。 方法：设计In-Fusion引物扩增TIMP-1基因片段,与酶切后线性化的pBABE-Puro反转录病毒表达载体进行位点同源重组,构建TIMP-1基因反转录病毒表达载体,RT-PCR和测序验证,并使用GP-293细胞进行包装。通过密度梯度法分离人下颌骨来源骨髓间充质干细胞,流式细胞仪验证其表面标记。将TIMP-1反转录病毒包装液感染骨髓间充质干细胞并筛选稳定表达TIMP-1细胞株,RT-PCR和蛋白电泳验证其表达,并使用成骨诱导液诱导10 d,观察其对成骨能力的影响,RT-PCR验证其成骨相关基因的表达。 结果与结论：经测序证实,RT-PCR所获得的TIMP-1基因 cDNA 序列与NM_003254.2(624 bp)序列完全一致;通过表面标记鉴定证实成功分离了人骨髓间充质干细胞,并具良好的成骨、成脂能力;RT-PCR和Western Blot验证反转录病毒载体成功介导TIMP-1转染骨髓间充质干细胞,RT-PCR表明成骨诱导10 d时,TIMP-1基因感染组成骨增加,RUNX-2和COL1 mRNA表达增加。提示TIMP-1基因可通过反转录病毒成功转染人骨髓间充质干细胞,并能促进其成骨。     

腺病毒介导骨形态发生蛋白2基因转染诱导脂肪间充质干细胞向

背景：在众多的骨生长因子中,骨形态发生蛋白2具有显著促进骨缺损修复和骨折愈合的效果。骨修复是一个阶段性过程,不需要转染的目的基因长久表达,因此利用腺病毒载体将目的基因导入脂肪间充质干细胞来促进骨愈合比较理想。 目的：观察腺病毒介导的骨形态发生蛋白2基因转染后大鼠脂肪间充质干细胞的分化情况。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2008-01/10在北京大学第三医院中心实验室完成。 材料：清洁级3周龄雄性Lewis大鼠24只,由北京大学实验动物学部提供。腺病毒载体Ad-BMP2、Ad-GFP由靳小兵博士构建扩增。 方法：胶原酶消化法分离培养大鼠脂肪间充质干细胞,传至第3代分为Ad-BMP2转染组、Ad-GFP转染组和未转染组。各转染组分别向培养液中加入对应的腺病毒液,转染复数MOI=100。 主要观察指标：转染后脂肪间充质干细胞碱性磷酸酶活性,von Kossa染色结果,Western blotting法检测骨桥蛋白和骨形态发生蛋白2的表达。 结果：与未转染组比较,转染后7,14,21d Ad-GFP转染组细胞碱性磷酸酶活性无明显变化;Ad-BMP2转染组细胞碱性磷酸酶活性明显增高（P < 0.01）,且随时间延长碱性磷酸酶活性增加更为显著。Ad-BMP2转染组von Kossa染色出现黑色钙结节,免疫细胞化学染色结果示胞浆内有大量黄染颗粒,骨桥蛋白、骨形态发生蛋白2均呈明显强阳性表达。Western blotting检测结果显示Ad-BMP2转染组脂肪间充质干细胞骨桥蛋白、骨形态发生蛋白2表达水平增高,Ad-GFP转染组中未检测到骨桥蛋白、骨形态发生蛋白2的表达。 结论：大鼠脂肪间充质干细胞经腺病毒介导的骨形态发生蛋白2基因转染后,可定向分化为成骨细胞。