pEGFP-N1-过氧化物酶体增殖物激活受体γ载体构建及在兔骨髓间充质干细胞中的表达

背景：过氧化物酶体增殖物激活受体γ是细胞分化重要的调控因子,通过调节其他转录因子的表达,参与调节骨髓间充质干细胞的分化。 目的：构建pEGFP-N1-过氧化物酶体增殖物激活受体γ真核表达载体,体外转染兔骨髓间充质干细胞,为过氧化物酶体增殖物激活受体γ受体功能和基于过氧化物酶体增殖物激活受体γ受体靶点的药物筛选提供分子研究平台。 设计、时间及地点：单一样本观察,于2007-09/2008-07在南华大学附属一医院临床研究所完成。 材料：选择雄性2~5月龄新西兰大白兔,用于分离培养骨髓间充质干细胞。 方法：应用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞,贴壁法不断纯化。从正常小鼠的肝组织中提取总RNA,反转录-聚合酶链反应法获得过氧化物酶体增殖物激活受体γcDNA,经Xho Ⅰ,Apa Ⅰ双酶切,定向克隆到真核表达载体pEGFP-N1,构建重组质粒pEGFP-N1-过氧化物酶体增殖物激活受体γ。 主要观察指标：经酶切分析和测序鉴定重组质粒中过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因的完整性和真实性,脂质体介导下体外转染骨髓间充质干细胞,荧光倒置显微镜下观察瞬时表达及转染效率,提取总RNA和总蛋白,进行反转录-聚合酶链反应和Western blot检测。 结果：获得的过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因片段经酶切和测序鉴定正确,重组质粒经酶切和测序鉴定证实构建正确,成功转染骨髓间充质干细胞,在其中检测到目的基因及蛋白表达。 结论：实验成功构建了pEGFP-N1-过氧化物酶体增殖物激活受体γ重组质粒,同时在转染的骨髓间充质干细胞中获得了过氧化物酶体增殖物激活受体γ的高效表达。     

再生障碍性贫血患者骨髓间充质干细胞体外生物学特性与其免疫调节缺陷

背景：许多报道指出骨髓间充质干细胞具有免疫调节及造血功能作用,而再生障碍性贫血患者骨髓间充质干细胞与正常人骨髓间充质干细胞在免疫调节及造血功能都存在显著差异。 目的：对再生障碍性贫血患者骨髓间充质干细胞的体外生物学特点及与免疫调节缺陷之间的关系进行综述。 方法：由第一作检索Pubmed数据库(1987/2009)和维普数据库(1989/2009),英文检索词为“Mesenchymal stem cell,Bone marrow”;中文检索词为“再生障碍性贫血,间充质干细胞”,总计检索到文献55篇。纳入与再生障碍性贫血患者骨髓间充质干细胞生物学特性相关及与再生障碍性贫血患者免疫调节相关的文献。排除重复性研究及与主题非密切相关的文献。符合纳入标准的32篇文献中,英文综述3篇,英文研究论文23篇,中文研究论文6篇。 结果与结论：骨髓间充质干细胞具有高度增殖、自我更新及多向分化的能力,除支持造血、促进植入及体内造血重建等作用之外,还具有免疫负调节及降低移植物抗宿主病发生率的作用。再生障碍性贫血发病机制与造血干细胞内在增殖或分化缺陷,造血微环境系统异常以及机体免疫功能紊乱等有关,而再生障碍性贫血患者骨髓间充质干细胞的异常可能在其发病机制中存在重要作用。     

骨髓间充质干细胞对免疫介导再生障碍性贫血的治疗

背景：骨髓间充质干细胞具有免疫调节作用,可以影响淋巴细胞和其他免疫细胞的功能,同时其分泌的因子尚有支持造血的作用。而再生障碍性贫血的发生、发展与T细胞功能亢进引起的造血干、祖细胞凋亡密切相关。 目的：比较骨髓间充质干细胞和全骨髓细胞治疗免疫介导再生障碍性贫血小鼠的疗效。 方法：建立BALB/C小鼠免疫介导再生障碍性贫血模型。将BALB/C小鼠随机分成正常组、对照组、注射骨髓间充质干细胞和注射全骨髓细胞组。观察骨髓间充质干细胞和全骨髓细胞对实验动物的疗效及骨髓的造血组织容量、脂肪细胞和血窦结构。 结果与结论：再生障碍性贫血模型小鼠至第20天,对照组全部死亡,骨髓间充质干细胞组4例死亡,全骨髓细胞组1例死亡。②骨髓间充质干细胞组和全骨髓细胞组存活小鼠,其体质量变化趋势、血细胞计数、骨髓造血功能恢复均无显著性差异。③检测骨髓间充质干细胞组和全骨髓细胞组脾脏CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+/CD8+的比值示无差异,与正常小鼠相比,骨髓间充质干细胞组外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞水平有下降趋势。全骨髓细胞组CD8+T细胞水平明显下降。提示,单独使用骨髓间充质干细胞治疗能够使部分再生障碍性贫血模型小鼠症状改善、造血恢复。骨髓间充质干细胞治疗有效率不如全骨髓细胞,但两组无显著性差异。     

过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂对二氧化硅致成纤维细胞纤维连接蛋白表达的影响

背景: 过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂对转化生长因子β1致矽肺肺间质纤维化作用的影响及机制尚不明确,罕见报道。 目的：观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂对转化生长因子β1致矽肺肺纤维化作用的影响。 方法：200 mg/L SiO2刺激SD大鼠肺泡巨噬细胞培养上清液作用于中国仓鼠肺成纤维细胞株(CHL)建立矽肺纤维化的体外细胞模型。RT-PCR检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ配体15d-PGJ2及其激动剂曲格列酮和齐格列酮对转化生长因子β1诱导CHL的纤维连接蛋白mRNA表达的影响。利用Western印迹技术观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂对转化生长因子β1诱导CHL的纤维连接蛋白表达的影响。 结果与结论：①转化生长因子β1 mRNA表达呈一定范围内的剂量(0~5 μg/L)和时间(0~24 h)依赖效应。②过氧化物酶体增殖物激活受体γ配体及激动剂降低了纤维连接蛋白mRNA和蛋白的表达。结果提示过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂可以抑制转化生长因子β1诱导的SiO2致肺成纤维细胞纤维连接蛋白合成,具有抗SiO2所致肺间质纤维化的潜在作用。     

骨髓间充质干细胞抑制再生障碍性贫血患者外周血T细胞增殖的实验研究

背景：既往研究发现骨髓间充质干细胞具有免疫抑制作用,而再生障碍性贫血患者存在T淋巴细胞异常活化及增殖。 目的：体外分析骨髓间充质干细胞对再生障碍性贫血患者外周血T淋巴细胞增殖的抑制作用。 方法：分离再生障碍性贫血患者外周血T淋巴细胞,行羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFDA SE)荧光染色,与体外培养扩增的骨髓间充质干细胞按3︰1比例直接接触法及Transwell法共培养,加入植物血凝素(PHA)刺激T淋巴细胞增殖,并设阴性及阳性对照。流式细胞术检测各组T细胞增殖情况,评价骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞增殖的影响。 结果与结论：CFDA SE染色分析显示,直接接触组T细胞增殖较阳性对照组明显减低(P < 0.01);Transwell组T细胞增殖亦较阳性对照组减低(P < 0.05);直接接触组T细胞增殖较Transwell组明显减低(P < 0.01)。骨髓间充质干细胞可能通过直接接触及分泌某些细胞因子方式抑制再生障碍性贫血患者异常增殖的T细胞,以直接接触方式发挥主要作用。     

间充质干细胞在再生障碍性贫血治疗中的应用

背景：造血干细胞移植现在仍然是儿童和青年重型再生障碍性贫血的一线治疗选择,但供者来源有限,费用高,且5%~15%的患者因为慢性移植物抗宿主病影响疗效和生活质量。因此尚需探索能提高疗效,减轻不良反应的治疗途径。间充质干细胞易于分离并且增殖力稳定,可以满足临床需求。 目的：总结间充质干细胞的研究进展、免疫学特性以及在再生障碍性贫血治疗中的应用情况。 方法：由第一作者在2010-06检索PubMed数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed)及中国期刊全文数据库(http://www.cnki.net)1995/2010有关间充质干细胞的研究进展、免疫学特性以及在再生障碍性贫血治疗中应用的文献。英文检索词为“mesenchymal stem cells,aplastic anemia,anemia”,中文检索词为“间充质干细胞,再生障碍性贫血,贫血”。 结果与结论：共收集119篇关于间充质干细胞及再生障碍性贫血的文献,中文85篇,英文34篇,排除因研究目的与课题无关、发表较早、重复及类似研究,纳入30 篇符合标准的文献。目前普遍认为再生障碍性贫血是一种获得性骨髓造血功能衰竭症,再生障碍性贫血的发生、发展与T细胞功能亢进引起的造血组织损伤密切相关。间充质干细胞具有免疫负调节及支持造血双重作用,且具有可移植性和来源广泛的特点。再生障碍性贫血患者和正常人的间充质干细胞在生物学特性上具有差异性,间充质干细胞将会为研究再生障碍性贫血的发病机制和治疗提供新的思路和方法。     

2型糖尿病大鼠骨髓腔内过氧化物酶体增殖物激活受体γ和核心结合因子α1 mRNA表达与骨折的愈合

背景：骨髓间充质干细胞成骨分化与成脂分化方向对骨再生和修复的影响是目前的研究热点,过氧化物酶体增殖物激活受体γ特别是过氧化物酶体增殖物激活受体γ2和核心结合因子α1对骨髓间充质干细胞分化方向有调控作用。 目的：分析2型糖尿病大鼠骨髓腔内过氧化物酶体增殖物激活受体γ和核心结合因子α1的表达变化与骨折愈合障碍的关系。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2007-08/12在中南大学第三附属医院中心实验室完成。 材料：选用雄性SD大鼠30只,按随机数字表法分为2组,对照组10只,实验组20只,分别给予普通饲料、高糖高脂饲料喂养。 方法：大鼠喂养8周后断尾法取血,实验组腹腔注射链脲佐菌素30 mg/kg,对照组注射等量枸橼酸盐缓冲液。注射2周后断尾法取血,建立大鼠左胫骨牵引成骨模型,行左胫骨中上段骨干横行截骨,安置特制延长外固定架,牵引14 d。 主要观察指标：行X射线摄片比较2组大鼠牵引间隙内骨痂的形成;在组织学水平观察牵引骨痂内微骨柱及初始基质前沿形成及骨折两端髓腔内脂肪细胞形成,并计算骨折两端髓腔内脂肪细胞与骨髓腔面积百分比;以反转录-聚合酶链反应法检测双侧股骨骨髓腔内过氧化物酶体增殖物激活受体γ和核心结合因子α1 mRNA的表达。 结果：实验组大鼠高糖高脂饲料喂养8周后,总胆固醇、三酰甘油及空腹胰岛素浓度均高于对照组(P < 0.05~0.01);实验组大鼠腹腔注射链脲佐菌素2周后：空腹血糖、总胆固醇及三酰甘油浓度高于对照组(P < 0.05~0.01),说明2型糖尿病建立成功。X射线摄片显示,实验组大鼠骨折断端之间牵引骨痂形成明显减少,骨痂组织学检查表现为微骨柱基质排列紊乱,初始基质前沿浅染。组织学检查显示,实验组大鼠骨折两端髓腔内脂肪细胞及脂肪细胞占骨髓腔面积百分比高于对照组(P < 0.01)。反转录-聚合酶链反应法检测显示,实验组大鼠双侧股骨骨髓腔内过氧化物酶体增殖物激活受体γ mRNA表达上调(P < 0.05),核心结合因子α1 mRNA表达下调(P < 0.05)。 结论：2型糖尿病大鼠骨折愈合障碍可能与2型糖尿病条件下骨髓腔内过氧化物酶体增殖物激活受体γ mRNA表达增加及核心结合因子α1mRNA的表达受抑制有关。     

杜仲诱导大鼠间充质干细胞成骨分化中成骨与成脂相关转录因子的表达

背景：杜仲对骨质疏松具有明显的干预和治疗作用,前期研究发现杜仲能够显著诱导骨髓间充质干细胞成骨分化和抑制成脂分化,而对于学术界广泛认同的成骨和成脂相关转录因子的表达变化还未见报道。 目的：观察杜仲诱导大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中成骨和成脂相关转录因子表达的变化。 方法：制备杜仲水/醇提取物,诱导培养至第3代的SD大鼠间充质干细胞,提取物按生药2 g,定容至15 mL体积为原液,诱导时按10-3、10-4倍稀释度稀释。诱导实验分为6组：阴性对照组(加入与诱导物等量的PBS);阳性对照组(诱导物为地塞米松0.01 mmol/L,β-甘油磷酸钠10 mmol/L,L-抗坏血酸钠50 mg/L);杜仲水提取物10-4稀释度诱导组;杜仲水提取物10-3稀释度诱导组;杜仲醇提取物10-4稀释度诱导组;杜仲醇提取物10-3稀释度诱导组,各组于诱导之后的第15天终止培养。RT-PCR和荧光定量PCR方法检测成骨分化转录因子基因Runx2、Osterix和成脂分化转录因子基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ、脂肪酸结合蛋白的表达。 结果与结论：Runx2除在10-3稀释度水提取物组表达下调,在10-4稀释度醇提取物组上调外,其他各组无显著变化;Osx在各诱导组的表达均明显下调;过氧化物酶体增殖物激活受体γ在各组中无显著变化;脂肪酸结合蛋白在各组均下调。提示杜仲诱导间充质干细胞成骨分化与成脂相关转录因子脂肪酸结合蛋白的表达抑制相关。     

大鼠骨髓细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ和核结合因子α1表达增龄性变化与增龄性骨折愈合障碍

背景：有报道随着年龄的增加,骨折愈合的难度加大,可能是由于骨髓间充质干细胞分化为成脂细胞、成骨细胞等时的基因调控不同,但其具体机制尚不清楚。 目的：观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ以及核结合因子α1在增龄性骨折愈合过程中的表达情况,以探讨过氧化物酶体增殖物激活受体与核结合因子α1基因的增龄性表达变化与增龄性骨折愈合障碍的联系。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2007-10/2008-02在中南大学湘雅三医院完成。 材料：随机选取雄性3月龄及23月龄SD大鼠各6只,分为高龄组(23月龄)和低龄对照组(3月龄),每组各6只。 方法：所有动物左下肢胫骨处安装自制微型外固定延长支架并行中上段横行截骨。术后第2天始每日延长牵引外固定架2次,0.20 mm/次,牵引期为14 d。术后第15天处死大鼠,无菌条件下分离采集左胫骨标本。 主要观察指标：骨折影像学、组织学检查;以反转录-聚合酶链反应检测过氧化物酶体增殖物激活受体与核结合因子α1 mRNA的表达。 结果：所有动物均进入结果分析。骨折断端间影像学检查,低龄对照组骨折断端间大量骨痂产生,成骨显著强于实验组;组织学检查,低龄对照组各实验动物均有大量骨痂生长,膜内成骨显著;而老龄组骨痂生长存在明显减弱,断端间仅为纤维连接;反转录-聚合酶链反应检查,低龄组大鼠骨髓中核结合因子α1 mRNA表达明显强于高龄组,而高龄组过氧化物酶体增殖物激活受体mRNA表达则较为显著,且两组间该两种因子的表达差异有显著性意义。 结论：不同年龄组大鼠骨折愈合情况存在差异,随着年龄的增加,骨折愈合能力下降;大鼠骨髓中过氧化物酶体增殖物激活受体mRNA与核结合因子α1 mRNA表达水平随年龄增加发生相应变化,提示该两种基因表达水平变化与增龄性骨折愈合障碍存在联系。     

残粒脂蛋白激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ诱导人脂肪间充质干细胞的成脂分化***★

背景：残粒脂蛋白可诱导大鼠脂肪间充质干细胞分化为成熟的脂肪细胞。 目的：观察残粒脂蛋白对人脂肪间充质干细胞成脂分化和氧化物酶体增殖物激活受体γ、脂联素基因表达的影响。 方法：采用成脂诱导剂刺激人脂肪间充质干细胞，油红O染色鉴定脂肪细胞。分离高三酰甘油血症患者高脂餐后4 h抗凝血浆中的残粒脂蛋白，分别将0，50，100，150，200 mg/L残粒脂蛋白与10 mg/L胰岛素联合刺激脂肪间充质干细胞。 结果与结论：油红O染色发现0，50 mg/L 残粒脂蛋白组有微量脂滴形成。100~200 mg/L残粒脂蛋白组红色脂滴逐渐增加，以200mg/L组红色脂滴最多。在50~200 mg/L质量浓度范围内，细胞氧化物酶体增殖物激活受体γ mRNA与脂联素mRNA表达随残粒脂蛋白浓度增加而逐渐增强(P < 0.05)。200 mg/L残粒脂蛋白组脂联素 mRNA表达量显著低于150 mg/L组(P < 0.05)，但与100 mg/L 残粒脂蛋白组差异未达到显著性意义。表明残粒脂蛋白通过激活氧化物酶体增殖物激活受体γ诱导人脂肪间充质干细胞的成脂分化，并上调脂联素mRNA的表达。     

小鼠卵巢免疫反应产物内GATA-4的表达定位

背景：特异性转录因子GATA-4家族对动物生殖细胞分化和生殖过程中多种激素的调节有非常重要的作用。 目的：观察小鼠卵巢内GATA-4免疫反应产物的特征与分布。 方法：选取健康昆明种 6周龄ICR 小鼠6只,取卵巢进行石蜡切片,应用免疫组织化学ABC法,DAB显色观察GATA-4在此时期卵巢中的表达情况。 结果与结论：GATA-4免疫反应细胞在6周龄小鼠的卵巢中均有分布,主要在初级卵泡和次级卵泡的颗粒细胞,在卵泡膜细胞上有少量分布,黄体上未见分布。说明小鼠卵巢内存在GATA-4。     

Transcription factor GATA-3 alters pathway selection of olivocochlear neurons and affects morphogenesis of the ear

Patterning the vertebrate ear requires the coordinated expression of genes that are involved in morphogenesis, neurogenesis, and hair cell formation. The zinc finger gene GATA-3 is expressed both in the inner ear and in afferent and efferent auditory neurons. Specifically, GATA-3 is expressed in a population of neurons in rhombomere 4 that extend their axons across the floor plate of rhombomere 4 (r4) at embryonic day 10 (E10) and reach the sensory epithelia of the ear by E13.5. The distribution of their cell bodies corresponds to that of the cell bodies of the cochlear and vestibular efferent neurons as revealed by labeling with tracers. Both GATA-3 heterozygous and GATA-3 null mutant mice show unusual axonal projections, such as misrouted crossing fibers and fibers in the facial nerve, that are absent in wild-type littermates. This suggests that GATA-3 is involved in the pathfinding of efferent neuron axons that navigate to the ear. In the ear, GATA-3 is expressed inside the otocyst and the surrounding periotic mesenchyme. The latter expression is in areas of branching of the developing ear leading to the formation of semicircular canals. Ears of GATA-3 null mutants remain cystic, with a single extension of the endolymphatic duct and no formation of semicircular canals or saccular and utricular recesses. Thus, both the distribution of GATA-3 and the effects of null mutations on the ear suggest involvement of GATA-3 in morphogenesis of the ear. This study shows for the first time that a zinc finger factor is involved in axonal navigation of the inner ear efferent neurons and, simultaneously, in the morphogenesis of the inner ear.     

Calcineurin is a potent regulator for skeletal muscle regeneration by association with NFATc1 and GATA-2

The molecular signaling pathways involved in regeneration after muscle damage have not been identified. In the present study, we tested the hypothesis that calcineurin, a calcium-regulated phosphatase recently implicated in the signaling of fiber-type conversion and muscle hypertrophy, is required to induce skeletal muscle remodeling. The amount of calcineurin and dephosphorylated nuclear factor of activated T cells c1 (NFATc1) proteins was markedly increased in the regenerating muscle of rats. The amount of calcineurin co-precipitating with NFATc1 and GATA-2, and NFATc1 co-precipitating with GATA-2 gradually increased in the tibialis anterior muscle after bupivacaine injection. Calcineurin protein was present in the proliferating satellite cells labeled with BrdU in the damaged muscle after 4 days. In contrast, calcineurin was not detected in the quiescent nonactivating satellite cells expressing Myf-5. At 4 days post injection, many macrophages detected in the damaged and regenerating area did not possess calcineurin protein. Calcineurin protein was abundant in many myoblasts and myotubes that expressed MyoD and myogenin at 4 and 6 days post injection. In the intact muscle, no immunoreactivity of calcineurin or BrdU was detected in the cell membrane, cytosol or the extracellular connective tissue. In mice, intraperitoneal injection of cyclosporin A, a potent inhibitor of calcineurin, induced extensive inflammation, marked fiber atrophy, the appearance of immature myotubes, and calcification in the regenerating muscle compared with phosphate-buffered saline-administered mice. Thus, calcineurin may have an important role in muscle regeneration in association with NFATc1 and GATA-2.     

Pregabalin effect on steady-state pharmacokinetics of carbamazepine, lamotrigine, phenobarbital, phenytoin, topiramate, valproate, and tiagabine

By reducing neuronal excitability through selective binding to the α(2)δ subunit of voltage-dependent calcium channels, pregabalin effectively treats epilepsy, chronic pain, and anxiety disorders. To evaluate if pregabalin coadministration affects pharmacokinetics of other antiepileptic drugs, population pharmacokinetic analyses using NONMEM software were performed on data from three epilepsy trials involving seven antiepileptic drugs with pregabalin as add-on therapy. Results demonstrated that pregabalin did not alter the steady-state plasma concentrations of carbamazepine, lamotrigine, phenobarbital, phenytoin, tiagabine, topiramate, and valproate. Furthermore, the small percent change in the population estimate of antiepileptic drug plasma clearance values (-2% to +7%) suggests that pregabalin coadministration exerted no significant effect on the pharmacokinetics of these antiepileptic drugs, with the possible exception of tiagabine (+34.9%). These findings are in agreement with those of previously published reports. A further clarification study is necessary for tiagabine. In conclusion, it appears that pregabalin can be coadministered with other antiepileptic drugs without concern for significantly altering their pharmacokinetic profiles.