胶质源性神经营养因子与白细胞介素1β体外诱导中脑神经干细胞的分化

背景：在神经干细胞移植治疗帕金森病中,移植细胞的数量及多巴胺能神经元的分化比率是必须解决的问题,而有效的神经干细胞体外增殖与多巴胺能神经元的大量定向诱导分化是解决问题的关键所在。 目的: 探讨胶质源性神经营养因子与白细胞介素1β体外诱导中脑神经干细胞向多巴胺能神经元的分化。 方法:分离妊娠12 d小鼠胚胎腹侧中脑,经胰酶消化和机械吹打制成单细胞悬液,离心过滤后机械方法传代培养5~7 d的神经球,分组进行诱导分化10~12 d,待80%细胞从神经球迁移出来,分化为单细胞时,进行免疫细胞化学鉴定及流式细胞术检测酪氨酸羟化酶阳性细胞率。 结果与结论：神经球细胞表达巢蛋白抗原,能分化为神经元特异性烯醇化酶和胶原纤维酸性蛋白阳性细胞。胶质源性神经营养因子与白细胞介素1β在体外能明显提高中脑神经干细胞分化为酪氨酸羟化酶阳性神经元的比例,胶质源性神经营养因子诱导组、白细胞介素1β诱导组和两者联合应用均较空白对照组比例高,尤其是两者联合应用作用更显著,说明胶质源性神经营养因子、白细胞介素1β可明显促进中脑神经干细胞分化为数量足够、形态及功能成熟的多巴胺能神经元。     

维生素A对体外培养小鼠精原干细胞生长增殖的影响*

背景：维生素A在体内对精原干细胞生长具有重要作用,目前还没有发现在体外培养过程中能够很好促进精原干细胞生长与分化的诱导物质。 目的：探讨维生素A对体外培养小鼠精原干细胞生长增殖的影响。 方法：无菌收集5~7 d龄昆明雄性小鼠双侧睾丸,采用差速贴壁联合非连续性Percoll密度梯度离心法分离纯化精原干细胞。无菌取出12~15 d龄昆明雄性小鼠双侧睾丸,酶消化法分离纯化Sertoli细胞,贴壁并极化后作为饲养层,将精原干细胞接种在单层Sertoli细胞上。设立2组,实验组向DMEM/F12培养液中加入1 g/L维生素A,对照组不添加维生素A。采用酶联仪测定精原干细胞生长增殖情况,流式细胞仪检测精原干细胞生长周期。 结果与结论：共培养6,9,12,15 d时,实验组精原干细胞吸光度值明显高于对照组(P < 0.05或0.01)。随共培养时间的延长,实验组精原干细胞S期染色体含量逐渐增多,然后又逐渐下降,开始另一个分裂周期;与实验组比较,对照组精原干细胞S期染色体含量增长缓慢(P < 0.05)。小鼠精原干细胞在体外培养过程中,维生素A可促进其增殖分化。     

低氧环境下胶质源性神经营养因子体外诱导中脑神经干细胞的分化*

背景：有效的神经干细胞体外增殖与多巴胺能神经元的定向诱导分化是神经干细胞移植治疗帕金森病的关键所在。 目的：观察低氧条件下胶质源性神经营养因子体外诱导中脑源性神经干细胞向多巴胺能神经元的分化。 方法：体外分离培养孕12 d胚鼠腹侧中脑组织,制成单细胞悬液,在含碱性成纤维细胞生长因子和B27的无血清培养基中培养并传代,分别置于常氧(体积分数21%O2)或低氧(体积分数3%O2)环境下增殖5~7 d后,接种于含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基,或含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12+1 µg/L胶质源性神经营养因子。 结果与结论：低氧环境下分化10~12 d,中脑神经干细胞向多巴胺能神经元分化均高于常氧组,在胶质源性神经营养因子诱导下向多巴胺能神经元分化比例更高,表型更成熟。说明低氧环境下胶质源性神经营养因子可明显促进中脑神经干细胞分化为数量足够、形态及功能成熟的多巴胺能神经元。     

骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元的诱导分化

背景：近年来研究发现,神经营养因子在骨髓间充质干细胞的分化中发挥重要作用。目前脑组织中具有再生能力的神经干细胞在体外是否具有直接诱导骨髓间充质干细胞分化为多巴胺能神经元的作用还未见报道。 目的：观察大鼠间充质干细胞在胶质细胞源性神经营养因子与神经干细胞共培养两种诱导条件下体外分化成多巴胺能神经元的能力。 方法：分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代细胞分2组培养,一组细胞应用胶质细胞源性神经营养因子单独诱导,另一组细胞与已培养成球的神经干细胞共培养进行诱导,共培养之前行Brdu标记。诱导3 d后以免疫组织化学法检测各组贴壁细胞神经元特异性标志物神经原纤维和多巴胺能神经元特异性标志物酪氨酸羟化酶的表达,观察间充质干细胞的分化情况。 结果与结论：胶质细胞源性神经营养因子单独诱导组间充质干细胞在诱导24 h后胞体回缩呈锥形,突起延长且数量增多,有神经元样形态,且细胞间相互连接成网络状,3 d后部分细胞表达神经原纤维,其中少部分同时表达酪氨酸羟化酶。与神经干细胞共培养组神经干细胞球很快解离,迅速贴壁,共培养的贴壁细胞大量增殖且多呈神经元样,胞体细长多突起,相互间连接成网,多数贴壁细胞分别单独表达神经原纤维和酪氨酸羟化酶,少数细胞可见Brdu/神经原纤维,Brdu/胶质纤维酸性蛋白,Brdu/酪氨酸羟化酶双标阳性。提示间充质干细胞在胶质细胞源性神经营养因子、神经干细胞存在的情况下可定向转化为神经元,并有向多巴胺能神经元分化的可能。在该实验条件下胶质细胞源性神经营养因子效果好于神经干细胞。     

脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子单独或联合体外诱导人脐带血来源的间充质干细胞向神经样细胞分化

背景：体外培养条件下脐血间充质干细胞可向神经样细胞诱导分化,一定浓度范围的脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子联合体外诱导可获得较高的神经元分化比例。 目的：观察脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子单独或联合体外诱导人脐带血来源的间充质干细胞分化成神经样细胞的可行性。 方法：取第5代的脐血间充质干细胞,分别用5,10,20 μg/L的脑源性神经营养因子和5,10,20 μg/L睫状神经营养因子单独或联合诱导脐血源间充质干细胞向神经样细胞分化,另设空白对照组无任何干预措施。倒置相差显微镜观察细胞形态变化,于实验第1,3,6天分别进行神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白免疫细胞化学染色,并计数分化为神经元样细胞及神经胶质细胞的比例。 结果与结论：①向神经细胞诱导后,人脐血源间充质干细胞形态明显改变,胞体收缩,胞核部分折光性增强,出现类似于树突及轴突样结构。②与空白对照组相比,脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子能显著提高人脐血源间充质干细胞分化为神经元的比例。其中20 μg/L的脑源性神经营养因子联合20 μg/L睫状神经营养因子诱导人脐血源间充质干细胞分化为神经样细胞的比例最高。提示人脐血间充质干细胞经脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子体外诱导,均能够分化为神经样细胞。     

Nurr1对小胶质细胞联合神经干细胞共培养促进神经干细胞向多巴胺神经元分化作用研究

目的探讨联合过表达核受体相关因子1(Nurr1)基因的小胶质细胞(MG)和神经干细胞(NSC)共培养对神经干细胞向多巴胺神经元分化的影响。方法原代培养SD大鼠神经干细胞和小胶质细胞,并过表达Nurr1基因。CCK-8法检测Nurr1过表达对神经干细胞以及小胶质细胞活率的影响。Transwell系统共培养神经干细胞和小胶质细胞,实验分为NSC组、NSC+MG组和N(NSC+MG)组。ELISA检测共培养后第3天、第6天和第9天各组脑源性神经营养因子(BDNF)、血小板源性神经营养因子(PDNF)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)表达变化;RT-PCR和Western Blot检测各组第9天酪氨酸羟化酶(TH)、多巴胺转运蛋白(DAT)DAT和Nurr1的表达变化;细胞免疫荧光鉴定神经干细胞的分化,并对TH和DAT阳性细胞计数,计算各组神经干细胞向多巴胺神经元的分化效率。结果原代培养小胶质细胞以及神经干细胞并成功过表达Nurr1基因。CCK-8法检测结果表明,Nurr1过表达对神经干细胞以及小胶质细胞活率无明显影响。ELISA检测结果表明,N(NSC+MG)组在不同时间点神经营养因子(BDNF、PDNF和GDNF)表达量明显高于其他各组(P0.05)。RT-PCR和Westen Blot检测结果表明,N(NSC+MG)组TH、DAT和Nurr1的表达水平明显高于其他各组(P0.05)。细胞免疫荧光鉴定结果表明,N(NSC+MG)组TH阳性细胞率明显高于其他各组(P0.05)。结论Nurr1基因可促进神经干细胞和小胶质细胞共培养系统神经营养因子的分泌。过表达Nurr1基因的神经干细胞和小胶质细胞共培养可促进神经干细胞向多巴胺神经元的分化。     

睫状神经营养因子和丹参注射液体外诱导肌源性干细胞向神经元样细胞的分化

背景：在干细胞异体移植时神经细胞的低存活率成为异体细胞移植失败的主要诱因。核因子κB是细胞信号传导的主要转录因子之一，参与细胞的增殖和分化过程。 目的：观察睫状神经营养因子和丹参注射液联合诱导肌源性干细胞向神经元样细胞的分化情况，以及分化过程中核因子κB的表达。 设计、时间及地点：细胞学基因水平实验，于2008-03/05在辽宁医学院附属第二医院口腔科学实验室完成。 材料：新生7 d龄SD乳鼠10只，由辽宁医学院实验动物中心提供。睫状神经营养因子为Sigma公司产品，丹参注射液购自正大青春宝药业有限公司。 方法：体外分离培养鼠肌源性干细胞，差速贴壁法和酶消化法纯化后接种于6孔板内，诱导组用含睫状神经营养因子的DMEM预诱导24 h，更换培养液，洗涤3次，再加入含丹参注射液的无血清DMEM诱导5 h；对照组使用无血清DMEM培养基处理。 主要观察指标：RT-PCR及Western blotting法检测神经丝蛋白、核因子κB抑制蛋白的表达。 结果：诱导前肌源性干细胞未见神经丝蛋白表达，诱导后的神经元样细胞神经丝蛋白呈阳性表达。凝胶电泳及Western blot检测结果显示，与诱导前比较，诱导后对照组核因子κB抑制蛋白的表达无明显变化，诱导组核因子κB抑制蛋白的表达明显下降。 结论：睫状神经营养因子和丹参注射液可联合诱导肌源性干细胞分化为神经元样细胞，分化过程中核因子κB的活化被抑制。     

精原干细胞移植后的体内迁移、增殖和分化**☆

a背景：精原干细胞移植对男性不育的治疗具有潜在的临床应用价值,但移植后干细胞体内迁移、增殖、分化的过程目前尚不完全清楚。 目的：观测精原干细胞移植后的体内迁移、增殖和分化过程。 方法：以出生后6~10 d的雄性C57BL/6小鼠为供体,通过复合酶消化、差速贴壁结合非连续性Percoll密度梯度离心的方法获取精原干细胞;以出生后6周的雄性C57BL/6小鼠为受体,腹腔注射白消安,破坏其内源性生精功能。实验组采用曲细精管微注射法将供体精原干细胞移植入受体睾丸内,对移植后细胞进行PKH26-GL荧光追踪分析,观察其体内迁移过程,以Western Blot和RFQ-PCR法检测睾丸组织α6-Integrin,c-kit,SCF蛋白及mRNA的变化。以未接受化疗和细胞移植的正常同系生小鼠作为阳性对照组,以单侧睾丸曲细精管微注射移植细胞递质作为阴性对照组。 结果与结论：PKH26-GL荧光追踪移植细胞,移植后1周部分精原干细胞已向曲细精管基底膜迁移,移植后1个月精原干细胞已从曲细精管管腔迁移至曲细精管基底膜,并分裂增殖,移植后3个月曲细精管管腔内可见大量精子细胞形成。移植后1,2,3个月,各组α6-Integrin,c-kit蛋白表达均呈增加趋势(P < 0.01),阴性对照组、实验组SCF蛋白表达有增加趋势(P < 0.05);各组α6-Integrin,c-kit,SCF mRNA的表达均有增加趋势(P < 0.05)。提示大剂量化疗后,生精上皮内仍存在一定数量的Sertoli细胞,这种精子发生的微环境并未完全破坏,外源性精原干细胞移植后能在受体Sertoli细胞所提供的微环境中增殖和分化。     

成年骨髓间质干细胞体外诱导分化成神经细胞研究

目的：探索成年骨髓间质干细胞（ABMMSC）诱导分化为神经细胞（神经元和神经胶质细胞）的可行性，为ABMMSC在神经科学领域内的应用提供 参考。方法：以成年犬ABMMSC为实验对象，利用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长因子（FGF）、维甲酸（RA）、脑源性神经营养因子（BDNF）、胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）等作为增殖及分化诱导因子，采用两步法进行增殖培养，分化诱导；免疫细胞化学法进行细胞性质鉴定。结果：加入bFGF、EGF后增殖培养48h，换液、去除非粘附细胞，再增殖培养72h ,可见细胞分裂相（成纤维细胞样细胞）和簇样克隆形成（中小型细胞）。加入RA、BDNF、GDNF诱导3d，部分细胞有神经元特异性烯醇酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）成分表达；第10d可见有神经元、神经胶质形态样细胞形成。经细胞成分（NSE、GFAP）鉴定证实为神经元、神经胶质细胞。结论：ABMSC在体外培养条件下，经过bFGF、EGF、RA、BDNF、GDNF等因子的“程序性”作用，可以向神经元、神经胶质前体细胞及其终末细胞方向分化。     

常氧及低氧条件下胶质源性神经营养因子体外诱导中脑神经干细胞向多巴胺能神经元的分化

背景：神经干细胞的定向诱导分化和扩增受细胞自身基因和外来信号的调控。 目的：观察中脑源性神经干细胞在常氧、低氧和胶质源性神经营养因子诱导下向多巴胺能神经元的分化情况。 方法：无菌条件下分离E12小鼠胚胎腹侧中脑组织,胰酶消化和机械吹打制成单细胞悬液,在无血清培养基中培养扩增;Nestin免疫细胞化学染色方法鉴定神经干细胞。在有血清培养基中对纯化神经干细胞自然分化;神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白免疫细胞化学染色方法分别鉴定神经元和星形胶质细胞。建立常氧和低氧环境,设置常氧组、常氧+胶质源性神经营养因子组、低氧组、低氧+胶质源性神经营养因子组,按实验分组在有血清条件下诱导分化。 结果与结论：在低氧条件下,中脑神经干细胞向多巴胺能神经元分化均高于常氧组;尤其是低氧环境和胶质源性神经营养因子诱导下向多巴胺能神经元分化比例更高,表型更成熟。说明低氧环境下胶质源性神经营养因子可明显促进中脑神经干细胞分化为数量足够、形态及功能成熟的多巴胺能神经元。     

人胎盘间充质干细胞生物学特性和抗凋亡细胞因子的分泌

背景：由于骨髓源性间充质干细胞的提取造成患者的二次损伤,也存在病毒、细菌污染的可能,扩增、分化能力不高,为此,实验从胎盘中提取间充质干细胞进行研究,了解其分泌抗凋亡细胞因子的情况,探讨其代替骨髓间充质干细胞的可能性。 目的：体外分离培养、扩增人胎盘源性间充质干细胞,研究其基本生物学特性和抗凋亡细胞因子的分泌水平。 方法：提取人胎盘间充质干细胞,显微镜下观察细胞形态;采用流式细胞仪测定细胞周期、凋亡情况及表面标记的表达,研究其增殖和生长特性。ELISA检测血管内皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、肝细胞生长因子的分泌水平。 结果与结论：在体外培养条件下,人胎盘间充质干细胞为贴壁生长,为成纤维细胞样,核浆比大,细胞增殖活跃,凋亡率低,可分泌能抑制细胞凋亡的细胞因子如血管内皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、肝细胞生长因子。     

Feridex-labeled bone marrow stromal cells for analysis of sciatic nerve defects in rabbits

BACKGROUND: Traumatic approaches, such as sacrifice and perfusion sampling, have been used to evaluate efficiency of stem cell transplantation. However, these methods are not applicable to human studies. Cell tracing, in combination with non-invasive imaging technology, can be utilized to trace cell survival following transplantation to evaluate the efficacy of cell transplantation therapy. OBJECTIVE: To explore feasibility of magnetic resonance imaging (MRI) to observe in vivo repair of injured sciatic nerves following feridex and polylysine (FE-PLL) complex-labeled bone marrow stromal cell (BMSC) transplantation. DESIGN, TIME AND SETTING: A randomized, controlled, animal experiment was performed at the Laboratory of the Department of Neurosurgery, Zhujiang Hospital from March to December 2008.MATERIALS: Feridex was purchased from Advanced Magnetic, USA, and polylysine was purchased from Sigma, USA.METHODS: BMSCs were harvested from adult rabbit femurs and were cultured in vitro with neural stem cell culture medium, leukemia inhibitory factor, and basic fibroblast growth factor. Bone marrow stromal cell-derived neural stem cells (BMSC-D-NSCs) were obtained and labeled with FE-PLL complex. The right sciatic nerve (0.8 mm) was excised from healthy, New Zealand rabbits, aged 1.5 months, and the epineuria of distal stumps underwent turnover and were anastomosed at the proximal ends. FE-PLL labeled BMSC-D-NSC suspension or culture medium was transplanted into the epineurial lumen using a microsyringe. The left sciatic nerve was left intact and served as the normal control. MAIN OUTCOME MEASURES: Cellular morphology, proliferation, and differentiation, as well as expression of nestin and neuron-specific enolase (NSE), of BMSCs-D-NSCs were observed. Efficacy of FE-PLL labeling and effects on cells were measured. In addition, neural regeneration at 2, 8, and 16 weeks following transplantation was observed by MRI. Histopathology and mean number of regenerated nerve fibers in the proximodistal-injured sciatic nerve were evaluated by hematoxylin and eosin and Bielschowsky staining. RESULTS: Results demonstrated that BMSCs expanded, proliferated, and differentiated into neural-like cells with slim, long processes. The cells expressed nestin and NSE, as detected by immunocytochemistry. BMSC-D-NSCs were effectively labeled by FE-PLL, with a labeling efficiency of 98%. In addition, cell viability was not influenced by the FE-PLL complex. MRI results revealed low signals in the FE-labeled BMSC-D-NSC-implanted region of the sciatic nerve. A low-signal region was observed at 2 weeks, which was widely spread at 8-16 weeks after cell transplantation. The regenerated nerve fibers were orderly arranged in the cell transplantation group and exhibited no significant differences compared with the normal control side (P > 0.05). CONCLUSION: BMSCs were successfully cultured in vitro, and the cells proliferated and trans-differentiated into neuronal-like cells, which expressed nestin and NSE. The FE-PLL complex effectively labeled rabbit BMSC-D-NSCs in vitro and did not affect peripheral neural regeneration following cell transplantation. Results demonstrated that MRI could be used to track FE-labeled BMSC-D-NSCs transplanted in the sciatic nerve.     

细胞因子介导的人脐血单个核细胞体外扩增并重建NOD/SCID小鼠造血及免疫功能

背景：细胞因子介导的脐血造血细胞体外扩增有望能解决脐血移植数量不足的问题。 目的：实验拟确立在无基质培养条件下体外扩增脐血单个核细胞最合适的细胞因子组合及干细胞因子、FLT3配基协同促聚核细胞生成因子对造血及免疫重建功能的影响。 方法：将新鲜脐血标本分离的单个核细胞接种于含有不同细胞因子组合的无血清无基质培养体系中培养7 d,根据不同细胞因子组合分组,将3因子干细胞因子+FLT3配基+促聚核细胞生成因子组合在无血清无基质条件下扩增培养7 d前后的脐血单个核细胞移植给经亚致死量照射的NOD/SCID小鼠。在扩增培养0,7 d检测脐血CD34+细胞数及CD34+CXCR4+,CD34+CD62L+,CD34+CD49d+的细胞数。脐血移植6周后通过流式细胞仪,PCR法检测存活小鼠体内的人源性细胞。 结果与结论：移植6周后,存活小鼠体内均可检测到人源性CD45+细胞,扩增脐血移植组的NOD/SCID小鼠存活率和人特异性基因捡出率均高于新鲜脐血移植组和高于生理盐水移植组 (P < 0.05)。扩增脐血组存活NOD/SCID小鼠骨髓中可检测到人髓系细胞(CD33+),T淋巴细胞(CD4+),B淋巴细胞(CD19+)和人造血干细胞成分(CD34+)细胞的表达。结果提示干细胞因子+FLT3配基+促聚核细胞生成因子3因子组合脐血造血细胞体外扩增是最合适的细胞因子组合,其扩增的脐血单个核细胞能够植入并重建NOD/SCID小鼠的造血及免疫功能。     

无血清培养大鼠胚胎向神经干细胞的分化

背景：体外培养扩增获取大量、高纯度的神经干细胞是其移植应用的前提,无血清培养主要目的是去除血清中可能诱导神经干细胞分化的生长因子等干扰因素。 目的：在无血清条件下体外分离培养大鼠胚胎神经干细胞,并观察其生物学特性。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2005-03/2006-03在河北医科大学第三医院中心实验室完成。 材料：14~16 d龄SD胎鼠2只,由河北医科大学实验动物中心提供。 方法：无菌条件下取胎鼠大脑皮质,剪碎后机械分离法制作单细胞悬液,加入含B27神经营养添加剂的无血清MEM/F12培养基进行培养,1周后传代。 主要观察指标：免疫荧光染色鉴定神经干细胞巢蛋白的表达及传代能力,加入含血清的MEM/F12培养基诱导分化1周后免疫组化检测细胞分化情况。 结果：培养48~72 h细胞聚集悬浮生长,形成典型的神经球,呈神经干细胞特异性抗原巢蛋白阳性表达。传代的神经干细胞置于BrdU培养液中5~7 d形成次代神经球,呈BrdU阳性,表明次代神经球中绝大部分细胞为传代后细胞分裂而来,具有传代能力,传代后加入含血清的培养基后可以分化为微管相关蛋白2阳性细胞和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞。 结论：利用无血清培养技术可成功从胎鼠脑皮质中分离培养出具有分裂增殖能力及多向分化潜能的神经干细胞。     

人脑胶质瘤中肿瘤干细胞的体外培养及生物学特性

背景：有研究者提出，脑内存在少量正常的神经干细胞能够向肿瘤组织迁移。这需要对从胶质瘤体外培养得到的肿瘤干细胞与正常的神经干细胞进行鉴别。 目的：从人脑胶质瘤组织中分离脑胶质瘤干细胞进行体外培养，并对其干细胞特性加以鉴定，观察脑肿瘤干细胞的生长特性。 设计、时间及地点：细胞学观察实验，于2007-02/12在解放军第四军医大学细胞工程研究中心完成。 材料：7份肿瘤标本来源于胶质瘤患者，间变性星形细胞瘤标本3份，多形性胶质母细胞瘤标本4份。 方法：将获取的胶质瘤细胞置于含2%B27、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、左旋谷胺酰氨、胰岛素、青霉素和链霉素生长因子的无血清DMEM/F12培养基中，重新悬浮为单细胞悬液，以1×108 L-1接种于含有B27、表皮细胞生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养基中培养分离培养肿瘤干细胞球。取第5代的肿瘤干细胞球，离心后除去原培养基，用含有体积分数为0.10胎牛血清的DMEM/F12培养基接种于放置有多聚赖氨酸包被盖玻片的小平皿中，观察肿瘤干细胞分化情况。 主要观察指标：利用细胞免疫荧光及组织免疫组织化学法检测脑肿瘤干细胞在细胞培养或组织切片中CD133及巢蛋白表达。 结果：在胶质瘤中存在一定量的细胞能在无血清培养基中存活并悬浮生长，并增殖形成克隆性脑肿瘤干细胞球，细胞核较大，核质比例高，具有肿瘤细胞的特性，与原肿瘤组织标本的苏木精-伊红染色比较，肿瘤干细胞分化后的子代细胞中大部分与胶质瘤细胞相似。原代及传代脑肿瘤干细胞表达神经干细胞的特异性标志物巢蛋白和CD133。 结论：人脑胶质瘤中存在一定量的肿瘤干细胞，并能在体外将其分离培养，能够自我更新增殖、诱导分化，表达神经干细胞标志物CD133。     

无血清条件下体外分离培养鼠胚胎脑组织神经干细胞

背景：神经干细胞的体外培养成功为治疗中枢神经系统疾病提供了新的思路,但神经干细胞的分化和功能修复机制尚不甚清楚,移植后的细胞能否与体内细胞结合以及建立起正常的神经系统突触联系急需解决。 目的：在无血清条件下体外分离培养胚鼠神经干细胞,观察其生长及分化情况。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-03/2008-01在天津市环湖医院神经干细胞室完成。 材料：孕14~16 d的SD大鼠,由北京维通利华实验动物中心提供。 方法：取孕鼠胚胎的脑海马组织,通过机械分离和胰蛋白酶消化结合法体外分离培养神经干细胞,在含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子及B27的无血清DMEM/F12培养基中传代扩增。取原代培养7 d的神经干细胞,制备单细胞悬液,接种后加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液诱导3 d。 主要观察指标：倒置显微镜下观察神经干细胞的增殖分化过程,并行免疫荧光染色鉴定。通过细胞免疫化学染色检测诱导分化后的细胞类型。 结果：分离培养的神经干细胞在无血清培养基中不断分裂增殖,8 d左右即可形成胞体透亮、折光性好的干细胞球,悬浮生长,免疫荧光染色巢蛋白呈阳性表达。神经干细胞球诱导5 d,免疫细胞化学染色后可见胶质纤维酸性蛋白及神经元特异性烯醇酶呈阳性表达的细胞。 结论：体外无血清条件下,分离培养的神经干细胞生长状态良好,且具有自我更新和增殖能力,诱导后能够向神经元及星形胶质细胞方向分化。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外培养方法的改进☆

背景：间充质干细胞在骨髓中的含量很低,需进行体外分离纯化和大量增殖。 目的：优化骨髓间充质干细胞取材、纯化、扩增的方法,拟提高骨髓间充质干细胞的获得率和扩增率。 设计、实施及地点：以细胞为对象的观察实验,于2007-03/2008-02在南方医科大学珠江医院血液科实验室进行。 材料：实验动物为6~8周龄清洁级雄性大鼠,体质量130~150 g。 方法：采用改进的贴壁法培养骨髓间充质干细胞：保留大鼠肱骨、股骨和胫骨,尽量将骨周边组织剔除干净,从而减少混杂的细胞;冲洗骨髓腔时,选用2.5 mL的注射器,可以将紧贴骨髓腔壁的骨髓间充质干细胞吹洗下来,从而提升获得率;细胞换液时未全部倾去旧培养液,保留了1/4~1/5的旧培养液;采用“二传一” 的方法将两瓶原代细胞分别消化后合为一瓶,保证传代时对细胞数目的要求,能避免细胞过度老化。 主要观察指标：倒置光显微镜和苏木精-伊红染色进行细胞形态学观察, 流式细胞术进行细胞周期分析,MTT法和克隆形成实验测定细胞P1和P5生长曲线和克隆形成能力,用流式细胞仪和碱性磷酸酶对培养进行细胞鉴定。 结果:分离的骨髓间充质干细胞大小较为均匀, 基本上呈梭形或星形。原代培养细胞传代后,细胞增殖速度较快,基本上三四天传代1次,随传代次数的增加细胞形态趋于一致细胞基本为成纤维细胞型。流式细胞术证明G0G1期的细胞约占80%以上。细胞生长曲线测定表明接种后第3天细胞进入指数增生期, 至第五天进入平台期,随着传代次数的增加,细胞增殖速度变慢、克隆能力降低。经流式细胞仪检测显示CD44、CD99阳性,CD45阴性,碱性磷酸酶试验为阳性。 结论：采用改良的的方法获得了大量遗传性质均一、功能状态良好的骨髓间充质干细胞,并有效地提高了细胞的获得率和扩增率。     

脐带间充质干细胞对脐血CD34+细胞体外扩增的影响

背景：体外扩增是目前解决脐带血干细胞移植所面临的单份脐血造血干祖细胞数不足问题的主要手段。已有许多关于不同来源的间充质干细胞联合不同细胞因子支持脐血造血干祖细胞体外扩增的报道,而单独应用间充质干细胞对人脐血CD34+细胞体外扩增的报道仍很少。 目的：观察应用脐带源间充质干细胞作基质层的体外培养体系对脐血CD34+细胞体外扩增的支持作用。 设计、时间及地点：对比观察实验,于2006-03/2007-05在中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所、实验血液学国家重点实验室完成。 材料：经产妇知情同意,采集健康足月分娩胎儿脐带9份。 方法：应用贴壁培养的方法从正常足月出生儿脐带中分离培养间充质干细胞,通过细胞形态学、免疫表型、分化实验进行鉴定。利用免疫磁珠分离法从正常足月出生儿脐带血中分离CD34+细胞。应用3种不同培养体系进行脐血CD34+细胞的体外扩增：单独应用脐带源间充质干细胞作基质层、细胞因子培养体系和间充质干细胞联合细胞因子培养体系。 主要观察指标：应用细胞计数法、集落培养计数法和流式细胞学检测法对扩增后细胞数量、集落形成能力和免疫表型进行分析比较。RT-PCR检测间充质干细胞中细胞因子的表达情况。 结果：培养第14天后,间充质干细胞组的CD34+细胞比例明显高于细胞因子联合间充质干细胞组;CD34+细胞总数为培养前的(4.19±1.37)倍,明显高于细胞因子组。培养第7天和第14天,间充质干细胞组的CD34+CD38-细胞亚群比例均高于另两组。RT-PCR结果显示,脐带源间充质干细胞体外可表达干细胞因子和血小板生成素早期干细胞效应因子。 结论：单独应用脐带源间充质干细胞可有效地对脐血CD34+细胞进行体外扩增,更有利于保持较早期干、祖细胞的扩增。 关键词：间充质干细胞;脐带;脐血;CD34+细胞;体外扩增     

Mesencephalic neural stem (progenitor) cells develop to dopaminergic neurons more strongly in dopamine-depleted striatum than in intact striatum

Epidermal growth factor (EGF)/fibroblast growth factor (FGF)-responsive stem (progenitor) cells from embryonic brain have self-renewing and multipotent properties and thus are good candidates for donor cells in neural transplantation. However, the survival and differentiation to mature neurons after grafting of stem cells into adult brain are rather poor. We hypothesize that the differentiation of stem cells to mature neurons, such as dopaminergic (DAergic) neurons, is dependent on environmental cues that control the ontogenic development. We compared the survival and differentiation between mesencephalic (MS) and cortical (CTx) stem (progenitor) cells, following grafting into bilateral striata of hemiparkinsonian model rats. MS and CTx stem cells were prepared from E12 rats and proliferated in serum-free medium with EGF or basic FGF for 2 weeks. One day after being primed to differentiate, the cell suspensions of both origins were grafted into the bilateral striata of adult rats that had unilateral 6-OHDA lesions in the substantia nigra. MS cells differentiated to tyrosine hydroxylase (TH)-positive neurons more strongly in DA-depleted striatum than in intact striatum, and methamphetamine-induced rotation was ameliorated in half of the grafted animals. Rosette-like cell aggregation and dysfunction of the blood-brain barrier (BBB) were less in and around the grafts in DA-depleted striatum, suggesting less proliferation and more differentiation of MS stem cells in DA-depleted striatum. Neither TH-positive neurons nor behavioral amelioration were detected following CTx stem (progenitor) cell transplantation in the striata. Data suggest that the DA-depleted striatum offers a suitable environment for MS stem (progenitor) cells to differentiate into mature DAergic neurons.