细胞因子介导的人脐血单个核细胞体外扩增并重建NOD/SCID小鼠造血及免疫功能

背景：细胞因子介导的脐血造血细胞体外扩增有望能解决脐血移植数量不足的问题。 目的：实验拟确立在无基质培养条件下体外扩增脐血单个核细胞最合适的细胞因子组合及干细胞因子、FLT3配基协同促聚核细胞生成因子对造血及免疫重建功能的影响。 方法：将新鲜脐血标本分离的单个核细胞接种于含有不同细胞因子组合的无血清无基质培养体系中培养7 d,根据不同细胞因子组合分组,将3因子干细胞因子+FLT3配基+促聚核细胞生成因子组合在无血清无基质条件下扩增培养7 d前后的脐血单个核细胞移植给经亚致死量照射的NOD/SCID小鼠。在扩增培养0,7 d检测脐血CD34+细胞数及CD34+CXCR4+,CD34+CD62L+,CD34+CD49d+的细胞数。脐血移植6周后通过流式细胞仪,PCR法检测存活小鼠体内的人源性细胞。 结果与结论：移植6周后,存活小鼠体内均可检测到人源性CD45+细胞,扩增脐血移植组的NOD/SCID小鼠存活率和人特异性基因捡出率均高于新鲜脐血移植组和高于生理盐水移植组 (P < 0.05)。扩增脐血组存活NOD/SCID小鼠骨髓中可检测到人髓系细胞(CD33+),T淋巴细胞(CD4+),B淋巴细胞(CD19+)和人造血干细胞成分(CD34+)细胞的表达。结果提示干细胞因子+FLT3配基+促聚核细胞生成因子3因子组合脐血造血细胞体外扩增是最合适的细胞因子组合,其扩增的脐血单个核细胞能够植入并重建NOD/SCID小鼠的造血及免疫功能。     

猪苓多糖对脐血造血干细胞体外扩增及干细胞移植后免疫重建的调节效应★

目的：人脐血造血干细胞得以移植于小鼠体内，其理论基础是放射线照射使小鼠骨髓枯竭，龛位腾出，为移植的脐血造血干细胞提供空间，而猪苓多糖是从中药猪苓中提取的多糖成分，具有免疫调节抗肿瘤作用，也是一种非T细胞促有丝分裂素，对放射线照射有一定的防护作用。观察猪苓多糖对脐血造血干细胞体外扩增及干细胞移植后免疫重建效应。 方法： 实验于2004-06/2006-05在兰州大学基础医学院免疫研究所完成。①实验材料：清洁级BALB/c小鼠由兰州生物制品研究所提供，8周龄，体质量约20 g，雌雄各半，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。脐血样本由兰泰医院妇产科提供，产妇及家属对实验知情同意，并经医院伦理委员会批准。猪苓多糖由兰州大学第一医院提供。②实验方法：应用20，17.5，12.5，7.5 mg/L猪苓多糖体外扩增培养脐血造血干细胞，并测定细胞增殖率及CD34+细胞数。将BALB/c小鼠分为正常对照组：尾静脉、腹腔注射等量生理盐水；照射空白组：3.5Gy经60Coγ放射线照射联合尾静脉、腹腔注射等量生理盐水；照射药物组：3.5Gy经60Coγ放射线照射联合尾静脉注射等量生理盐水、腹腔注射猪苓多糖；照射移植组（n =15）：3.5Gy经60Coγ放射线照射联合脐血造血干细胞移植、腹腔注射等量生理盐水；照射移植药物组：3.5Gy经60Coγ放射线照射联合脐血造血干细胞移植、腹腔注射猪苓多糖。③实验评估：观察小鼠生存状况及血常规变化，流式细胞仪测定CD3、CD4、CD8、CD19水平。 结果：57只小鼠均进入结果分析。①12.5 mg/L猪苓多糖增殖效率最为显著（P < 0.01），流式细胞仪测定显示CD34+细胞数扩增了6.33倍。移植药物组小鼠死亡率最低，死亡高峰集中在照射移植后7~14 d左右。②移植药物组小鼠血象恢复正常，并且时间明显短于其他实验组（P < 0.05）。③细胞及体液免疫恢复情况，移植药物组小鼠各项指标水平与正常小鼠无差别（P > 0.05），与其他各组小鼠比较，除CD4、CD19水平与照射移植小鼠无差别外均有差别（P < 0.05）。 结论：猪苓多糖对脐血造血干细胞有明显扩增作用，并能促进脐血造血干细胞移植小鼠免疫造血重建。     

甘露醇促进人脐血CD34+细胞通过血脑屏障静脉迁移至高血压脑梗死大鼠脑组织

背景：单纯脐血细胞经静脉移植治疗脑梗死疗效有限，移植细胞经血脑屏障迁入脑内数量不足为重要原因之一。 目的：观察血脑屏障开放剂甘露醇对人脐血CD34+细胞经静脉移植治疗高血压大鼠脑梗死疗效的影响。 方法：分离人脐血CD34+细胞，脂质体方法转染pEGFPF质粒，制备pEGFP-CD34+细胞；45只雄性SD大鼠经线栓法建立大脑中动脉栓塞模型，造模后24 h随机分为3组：实验组注射1×106 GFP-CD34+细胞，继之注射20%甘露醇2 g/kg；阳性对照组注射1×106 GFP-CD34+细胞；空白对照组注射等量生理盐水。 结果与结论：①荧光显微镜下实验组每张切片脑组织GFP标记阳性的绿色荧光细胞计数平均值显著多于阳性对照组。②移植后第7天治疗组与其他各组神经功能损害评分差异无显著性意义；移植后28 d，各组神经功能均有不同程度恢复，实验组神经功能恢复明显优于阳性对照组和空白对照组(P < 0.05)。③实验组与其他两组相比，大鼠脑梗死体积均显著减少。④实验组脑组织匀浆胶质细胞源性神经营养因子水平较阳性对照组、空白对照组明显增高。提示血脑屏障开放剂甘露醇促进静脉移植CD34+细胞通过血脑屏障迁入至脑组织，并增强静脉移植CD34+细胞治疗脑梗死的疗效。     

靶基因调控的脐血干/祖细胞体外长期扩增与调控**★

背景：脐血干细胞是基因治疗最理想的靶细胞之一，但基因转移率低下是目前面临的主要障碍。酪氨酸激酶JAK2在造血干/祖细胞自我更新中扮演着重要的作用，为了克服脐血基因转移率低下的障碍，根据基因调控表达技术原理，是否可开发一个可以靶向扩增JAK2基因修饰的脐血CD34+细胞体系。 目的：探讨转基因JAK2介导的脐血干祖细胞长期扩增调控的可行性和安全性。 单位：卫生部北京医院血液科。 材料：实验于2003-06/2006-04在卫生部北京医院血液科实验室完成。脐血取自健康、足月、自然分娩后立即断脐的脐血。脐血由北京医院妇产科提供，产妇及家属均知情同意，实验经医学伦理委员会批准。MiniMACS磁性分离仪、免疫磁珠吸附CD34单抗购自德国Miltenyi Biotec公司， 流式细胞仪购自美国FACScalibur，人重组干细胞因子、Flt3配体、人白介素-6、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、血小板生成素为PeproTec产品，SPF级裸鼠购自北京医科大学动物中心。 方法：构建逆转录病毒载体MGI-F2JAK2，内含有JAK2基因的功能催化区和两个与小分子靶向基因合成药物(AP20187)结合的位点蛋白(2xF36v，F2)组成。AP20187可与F36v特异结合引起JAK2二聚化而激活细胞内信号传导。该载体同时含有绿色荧光蛋白报告基因，用作检测细胞增殖的标记。应用MiniMACS免疫磁珠分选系统纯化分离脐血CD34+ 细胞，用含JAK2的逆转录病毒上清转染脐血CD34+细胞。转导后的CD34+ 细胞在集落刺激因子、Flt3配体、血小板生成素、白介素-6细胞因子的联合培养条件下，以不加或加入AP20187分别作为对照组和实验组。 主要观察指标：①应用流式细胞仪测定两组CD34+细胞中所含绿色荧光蛋白细胞的百分率，确定基因转移率。②扩增后的脐血祖细胞集落培养结果。③取培养10周的脐血CD34+细胞于裸鼠的胁部皮下注射，30 d后观察成瘤情况。 结果：①实验组与对照组均可获得CD34+ 细胞大量扩增。随着培养时间的延长，实验组扩增的CD34+细胞GFP阳性率由基线水平逐渐上升于第11周时达到95%以上，而对照组绿色荧光蛋白报告基因阳性率逐渐下降到基线水平以下并逐渐消失。②实验组转基因CD34+ 细胞于12周后仍可产生造血祖细胞集落红系祖细胞、粒单系祖细胞、脐血多向造血祖细胞，所形成的造血祖细胞集落以粒单系祖细胞为主。③裸鼠实验无致瘤特性。 结论：转染JAK2 基因的人脐血CD34+ 细胞协同其他细胞因子可以体外长期扩增脐血干祖细胞，对今后开展干细胞治疗某些遗传性血液病有潜在的应用价值。     

LY294002对小鼠体内调节性T细胞的影响

背景：研究已证实,磷酸肌醇3激酶特异性阻滞剂LY294002在体外具有剂量依赖性抑制细胞活性的作用,可以用于诱导肿瘤细胞凋亡,但LY294002对正常免疫系统的影响尚不清楚。 目的：观察抗肿瘤药物LY294002对C57BL/6小鼠体内调节性T细胞的影响。 设计、时间及地点：以调节性T细胞比例为观察对象,分组对比实验,于2008-08/12在广州南方医科大学珠江医院移植免疫研究所完成。 材料：14只8周龄SPF级C57BL/6小鼠随机分成实验组与对照组,每组7只。LY294002购自广州英韦创津公司。 方法：实验组腹腔注射LY294002溶液200 μL(0.1 mg),对照组给予等体积PBS。10 h后后眼眶静脉从采血,并分离脾脏、胸腺,制备单细胞悬液,流式细胞术检测小鼠外周血、脾细胞和胸腺细胞中的CD4+CD25high T 细胞。 主要观察指标：小鼠外周血、脾细胞和胸腺细胞中CD4+CD25high T 细胞的比例。 结果：实验组小鼠外周血、脾脏、胸腺中CD4+CD25high T细胞比例分别为(0.787±0.036)%,(0.921±0.063)%,(1.230± 0.131)%,对照组小鼠外周血、脾脏、胸腺中CD4+CD25high T细胞比例分别为(0.640±0.030)%,(0.639±0.046)%,(0.857±0.077)%,实验组和对照组比较差异有显著性意义(P < 0.01,P < 0.05)。 结论：腹腔注射LY294002可提升小鼠体内调节性T细胞的比例,提示其有可能会抑制机体免疫反应,从而不利于治疗。     

白细胞介素3基因cDNA克隆与转导及其在脐血CD34+细胞中的表达

背景：单份脐血难以满足成人造血干细胞移植的要求,需对其进行体外扩增,这不仅需要较长的时间和较高的培养条件,而且容易导致干细胞自身分化,从而影响移植效果。 目的：克隆人白细胞介素3基因cDNA,构建其真核表达载体并转导脐血CD34+细胞,观察白细胞介素3的表达情况。 设计、时间及地点：细胞-基因组学体外实验,于2008年在承德医学院完成。 材料：健康成人外周血由承德市中心血站提供,脐血由承德市妇幼保健院提供,提供者对实验均知情同意。 方法：采集健康成人外周血,应用Ficoll密度梯度法分离单个核细胞,免疫磁珠法分离脐血CD34+细胞。提取白细胞介素3 mRNA,应用RT-PCT扩增白细胞介素3 cDNA,构建真核表达载体pcDNA3/IL-3。设立2组：实验组利用基因枪技术将pcDNA3/IL-3导入脐血CD34+细胞中,对照组未行转染。 主要观察指标：采用人白细胞介素3 ELISA试剂盒检测脐血CD34+细胞上清液中白细胞介素3水平。 结果：扩增的白细胞介素3基因cDNA理论上应为616 bp,实际PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后,紫外线下可见预期大小的条带,反转录合成的cDNA完整。BamHⅠ和XbaⅠ双酶切后,电泳可见616 bp的插入片段,与白细胞介素3基因序列相同。转染第1~7天,实验组脐血CD34+细胞上清液中白细胞介素3水平明显高于未转染对照组(t=3.46,P < 0.05)。 结论：白细胞介素3基因cDNA克隆成功,并成功构建了真核表达质粒pcDNA3/IL-3,pcDNA3/IL-3能在脐血CD34+细胞中短期有效表达。     

胶质细胞源性神经营养因子基因修饰CD34+细胞静脉移植治疗高血压大鼠脑梗死

背景：近年来,已有实验证实经颅直接给予胶质细胞源性神经营养因子(glial cell-derived neurotrophic factor,GDNF)或携带GDNF基因病毒载体有显著减少脑梗死体积、促进神经功能恢复的疗效,但其治疗方法有创,临床应用有限。 目的：观察GDNF基因转染的人脐血CD34+细胞经静脉移植对自发性高血压大鼠脑梗死的疗效,并探讨其机制。 方法：分离人脐血CD34+细胞,脂质体方法转染pEGFP-GDNF质粒和pEGFP空载体至CD34+细胞制备pEGFP-GDNF-CD34+和pEGFP-CD34+细胞;制备60只雄性自发性高血压大鼠大脑中动脉栓死模型并随机分为3组：pEGFP-GDNF-CD34+细胞移植组(基因细胞组)、pEGFP-CD34+细胞移植组(单纯细胞组)、生理盐水组。改良神经功能损害评分评价神经功能恢复状况;图像分析法观察TTC染色脑梗死体积;酶联免疫法检测细胞培养液与脑组织匀浆GDNF水平,荧光显微镜及免疫组织化学检测绿色荧光蛋白标记CD34+细胞及其人神经胶质纤维酸性蛋白和人神经元核抗原表达。 结果与结论：经静脉移植pEGFP-GDNF-CD34+细胞向自发性高血压大鼠脑缺血区域迁移、存活、并向神经细胞定向分化,促进神经功能恢复。GDNF基因转染CD34+细胞在脑组织存活、向神经细胞分化及对大脑神经功能保护作用优于CD34+细胞。脑组织GDNF水平可能是GDNF基因转染CD34+细胞和单纯CD34+细胞移植治疗自发性高血压大鼠局灶性脑缺血疗效差异机制之一。     

卵黄囊移植人脐血CD34+细胞构建人源化血液系统小鼠模型

背景：与较为成功的羊等大型动物宫内移植方法相比，利用小鼠等小型动物宫内移植异种造血干细胞仍面临困境，在外周血内检测到的异种血液细胞重建率仍在1%以下。 目的：观察小鼠卵黄囊移植人脐血来源CD34+造血干细胞后的异种造血重建效率，并与腹腔移植的效果进行比较。 设计、时间及地点：细胞学体内移植实验，于2007-10在北京大学干细胞与再生生物学实验室完成。 材料：健康新生儿脐血取自北京海淀区妇幼保健院。ICR小鼠由北京大学医学部实验动物中心提供，孕8.5 d鼠8只，孕 12.5 d鼠9只。藻红蛋白标记的抗人CD45单克隆抗体与流式细胞仪均为BD公司产品。 方法：采用Ficol1法梯度离心获得人脐血单个核细胞，经磁珠分选系统纯化获得CD34+细胞。将孕8.5 d鼠麻醉后，打开腹腔并暴露子宫，显微镜下抽取5~10 μL脐血CD34+细胞（5×104个），缓慢注入胎鼠的卵黄囊中。相同操作条件下将等量脐血CD34+细胞注射到孕12.5 d胎鼠的腹腔中。快速抽针，将孕鼠子宫归位并缝合腹腔，继续妊娠，等待分娩。待小鼠出生后3个月，经尾静脉取血，在避光状态下加入藻红蛋白标记的抗人CD45单克隆荧光抗体，流式细胞仪检测血细胞表面标记CD45的表达，通过其阳性率判断人血液细胞在小鼠体内的重建效果。 主要观察指标：不同移植方式对小鼠造血重建的影响。 结果：CD34+细胞通过卵黄囊移植方式共获得健康出生小鼠52只，3个月后86.5%（45/52）小鼠CD45呈阳性表达，嵌合率高达4.34%。通过腹腔移植方式共获得健康出生小鼠48只，3个月后81.3%（39/48）小鼠CD45呈阳性表达，明显低于卵黄囊移植方式（t=2.363, P < 0.05）。 结论：早期卵黄囊移植可以获得人造血干细胞在小鼠体内的长期重建，效果优于腹腔移植，同时也证明了通过胎鼠卵黄囊移植人脐血造血干细胞取得人源化造血系统小鼠模型的可行性。     

脐带间充质干细胞对脐血CD34+细胞体外扩增的影响

背景：体外扩增是目前解决脐带血干细胞移植所面临的单份脐血造血干祖细胞数不足问题的主要手段。已有许多关于不同来源的间充质干细胞联合不同细胞因子支持脐血造血干祖细胞体外扩增的报道,而单独应用间充质干细胞对人脐血CD34+细胞体外扩增的报道仍很少。 目的：观察应用脐带源间充质干细胞作基质层的体外培养体系对脐血CD34+细胞体外扩增的支持作用。 设计、时间及地点：对比观察实验,于2006-03/2007-05在中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所、实验血液学国家重点实验室完成。 材料：经产妇知情同意,采集健康足月分娩胎儿脐带9份。 方法：应用贴壁培养的方法从正常足月出生儿脐带中分离培养间充质干细胞,通过细胞形态学、免疫表型、分化实验进行鉴定。利用免疫磁珠分离法从正常足月出生儿脐带血中分离CD34+细胞。应用3种不同培养体系进行脐血CD34+细胞的体外扩增：单独应用脐带源间充质干细胞作基质层、细胞因子培养体系和间充质干细胞联合细胞因子培养体系。 主要观察指标：应用细胞计数法、集落培养计数法和流式细胞学检测法对扩增后细胞数量、集落形成能力和免疫表型进行分析比较。RT-PCR检测间充质干细胞中细胞因子的表达情况。 结果：培养第14天后,间充质干细胞组的CD34+细胞比例明显高于细胞因子联合间充质干细胞组;CD34+细胞总数为培养前的(4.19±1.37)倍,明显高于细胞因子组。培养第7天和第14天,间充质干细胞组的CD34+CD38-细胞亚群比例均高于另两组。RT-PCR结果显示,脐带源间充质干细胞体外可表达干细胞因子和血小板生成素早期干细胞效应因子。 结论：单独应用脐带源间充质干细胞可有效地对脐血CD34+细胞进行体外扩增,更有利于保持较早期干、祖细胞的扩增。 关键词：间充质干细胞;脐带;脐血;CD34+细胞;体外扩增     

CD34+细胞联合许旺细胞移植脊髓全横断大鼠：移植细胞的存活分化及后肢运动和痛温觉反应

背景：CD34+细胞和许旺细胞在单独移植情况下均有促进脊髓修复的功能，且各自分泌和表达成纤维细胞生长因子受体及配体。 目的：探讨CD34+细胞与许旺细胞联合移植对脊髓全横断损伤大鼠的后肢运动及感觉功能恢复的影响，并观察体内移植后细胞的存活、迁移、分化及表型变化。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2007-07/2008-09在昆明医学院神经科学研究所完成。 材料：SPF级健康雌性SD大鼠60只，随机分为模型对照组、免疫对照组、CD34+细胞组、许旺细胞组、细胞联合组，12只/组。SPF级6~8周龄ICR小鼠2只，用于分离培养骨髓CD34+细胞。SPF级一两天龄ICR新生鼠30只，用于分离培养许旺细胞。 方法：各组大鼠均建立脊髓全横断损伤模型。造模后2周，CD34+细胞组、许旺细胞组将体外培养并荧光标记好的对应细胞悬液经多点注射入横断瘢痕及瘢痕上下各一个脊髓节段，共6个注射位点，每点注射5 μL，每只大鼠共移植60万个细胞量；细胞联合组移植方法相同，但CD34+细胞、许旺细胞注射量各60万个。移植后除模型对照组外，余4组均使用免疫抑制剂环孢素腹腔给药。 主要观察指标：通过BBB评分判定大鼠后肢运动功能的恢复情况，测定热痛阈值和机械痛阈值的变化，形态学及组织学鉴定移植细胞的存活、迁移、分化、表型变化。 结果：移植后12周内CD34+细胞组BBB评分最高(P < 0.05)，至移植后24周时细胞联合组BBB评分最高，恢复效果最佳，许旺细胞组次之，CD34+细胞组最差(P < 0.05)。与CD34+细胞组比较，移植后12周细胞联合组热痛阈值明显降低(P < 0.05)，随移植时间延长，各组机械痛阈值均明显降低(P < 0.05)，但热痛阈值没有发现类似规律。CD34+细胞在有许旺细胞参加的情况下存活数量较多，在移植后12周尤为明显。移植后4周荧光细胞集中在针道附近，第12周荧光细胞迁移到瘢痕上下一两个节段，且较集中分布于脊髓灰质，白质中少见。与CD34+细胞组比较，移植后4，8，12周细胞联合组成熟神经元特异性标记物Neu-N阳性率、胶质纤维酸性蛋白阳性率均明显升高(P < 0.05)，成熟少突胶质细胞标记物APC阳性率明显下降(P < 0.05)；CD34+细胞组、细胞联合组早期少突胶质细胞标记物O4阳性率均明显下降(P < 0.05)。移植后4，8，12周，许旺细胞胶质纤维酸性蛋白阳性表达率逐渐增高。 结论：CD34+细胞联合许旺细胞移植对脊髓全横断大鼠后肢功能及感觉功能恢复效果优于单纯CD34+细胞移植，并得到了体内实验的证实。     

Therapeutic neovascularization by transplantation of mobilized peripheral blood mononuclear cells for limb ischemia. A comparison between CD34+ and CD34- mononuclear cells

Autolougous transplantation of granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF)-mobilized human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) improves limb ischemia in patients with arteriosclerosis obliterans of lower extremities and with diabetic foot. However, the mechanism of action of PBMNCs remains elusive. Here, we studied comparatively the effects of the G-CSF-mobilized PBMNCs and CD34-depleted G-CSF-mobilized PBMNCs in an ischemia model of athymic nude mice. Fluorescence- labeled human PBMNCs [1 x 10(6)] were intramuscularly injected into the unilateral ischemic hindlimbs of mice. Laser Doppler imaging analysis revealed a significantly augmented blood perfusion at day 7, 14 and 28 after operation. The capillary density was also markedly increased and the rate of limb loss was significantly reduced in cell-transplanted groups when compared with those in PBS group. In comparison with G-CSF-mobilized PBMNCs, the therapeutic efficiency of G-CSF-mobilized PBMNCs deprived of CD34+ cells was impaired. Transplanted cells were found to accumulate around arterioles and scatter in capillary networks. Incorporation of transplanted cells into new capillaries was observed in the G-CSF-mobilized PBMNCs group, but was not detected in the group deprived of CD34+ cells. There was an elevated expression of VEGF in ischemic tissue. Colocalization of VEGF and transplanted mononuclear cells within adductor tissue was demonstrated. These findings indicate that G-CSF-mobilized PBMNCs promote vascular growth not only by incorporating into vessel walls but also by supplying angiogenic factors. The depletion of CD34+ cells attenuated the therapeutic efficiency of G-CSF-mobilized PBMNCs in response to ischemia-induced neovascularization.     

自体造血干细胞移植治疗恶性淋巴瘤后大剂量白细胞介素2过继免疫对长期生存的影响

背景：过继免疫治疗是目前肿瘤免疫治疗的热点,白细胞介素2是一种具有多种生物学活性的细胞因子,在机体的抗肿瘤免疫中起到重要作用。 目的：评价比较淋巴瘤自体造血干细胞移植治疗后应用与不应用大剂量白介素2行免疫治疗的临床疗效。 方法：回顾分析30例恶性淋巴瘤患者(治疗组)自体造血干细胞移植后行大剂量白细胞介素2 治疗,与随机挑选30例患者(对照组)自体造血干细胞移植后未行白细胞介素2治疗进行对比,检测两组患者外周血T淋巴细胞亚群,观察两组免疫功能的变化,并对所有患者进行随访观察。 结果与结论：自体造血干细胞移植后白细胞介素2治疗组外周血T淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平明显提升。随访结束时统计复发率：治疗组13.3%,对照组26.7%;中位生存期：治疗组14~98 (42±2)个月,对照组8~78 (28±2)个月。提示恶性淋巴瘤自体造血干细胞移植后行大剂量白细胞介素2治疗能提高患者的免疫功能,减少移植后复发率,并有望延长生存期。     

睾丸内胰岛移植对CD4+ CD25+调节性T细胞分布的影响

背景：CD4+ CD25+调节性T细胞是维持机体免疫耐受的重要调控者，参与了多种移植免疫耐受的诱导。 目的：拟观察小鼠睾丸内胰岛移植后CD4+ CD25+调节性T细胞分布的特点。 设计、时间及地点：观察对照动物实验，2007-04/2008-01在江西省实验动物中心完成。 材料：成年Balb/c小鼠。 方法：分离小鼠胰岛细胞，采用胰管内注射胶原酶水浴消化及Ficoll 400不连续密度梯度离心法纯化，以双硫腙染色，计算胰岛细胞纯度，以体外葡萄糖刺激胰岛素分泌试验判定胰岛细胞功能。将胰岛移植至小鼠睾丸或肾包膜下，每只移植300~400个胰岛。在胰岛移植24 h后麻醉处死小鼠，取脾脏、睾丸及淋巴结，制成细胞悬液，免疫磁珠法分离CD4+CD25+ T细胞，通过流式细胞仪分析计数。 主要观察指标：胰岛细胞的纯度及功能，CD4+ CD25+调节性T细胞的分布。 结果：纯化后每只胰腺获得(478±53)个胰岛细胞，纯度为(81.5±12.3)%，纯化后细胞形态完好，活度大于90%。睾丸内胰岛移植时，睾丸、淋巴结及脾脏中CD4+CD25+调节性T细胞均显著增多（P < 0.05~0.01）。 结论：睾丸内胰岛移植能明显上调睾丸、淋巴结及脾脏中CD4+ CD25+调节性T细胞数量。     

Development of innervation within syngeneic thymus tissue transplanted under the kidney capsule of the nude mouse: a light and ultrastructural microscope study

The developing thymus, prior to the onset of its functional and structural organization, is innervated by the autonomic nervous system (ANS). The present study extends these earlier findings by analyzing at the light and ultrastructural microscope level the distribution of ANS nerves within normal 18-day-old embryo thymus, adult thymus, and thymic tissue transplanted under the kidney capsule of syngeneic nude mice. The results of this study showed that prior to birth the murine thymus is innervated by AChE-positive fibers that are distributed at the corticomedullary boundaries and throughout the adjacent cortex, as well as to cells beneath the thymic capsule. This pattern of distribution remains constant during adult life. The examination of the various thymic tissues by ultrastructural analysis demonstrated that myelinated and nonmyelinated fiber bundles penetrate the thymic capsule and the interface between the kidney and the thymus transplant. The myelinated fibers measured 2 micron or less in diameter; the nonmyelinated fibers were 1 micron in diameter. Myelination did not accompany the nerves into the parenchyma of the normal gland but was observed in the intralobular trabeculae of the transplanted thymus. Subcapsular nerves form a network that terminates among the thymocytes, whereas intrathymic nerves enter the parenchyma in bundles along the vasculature and interlobular septa before penetrating into the deeper layers of the thymic cortex. Some larger nerve fibers terminate in the corticomedullary boundaries and in the interlobular septa. Smaller fibers form en passant boutons near parenchymal cells. The innervation of both the normal thymus and the transplanted thymus prior to the onset of thymic immune function supports a role for ANS innervation in the development of thymic competency.     

Influence of human myasthenia gravis thymus on the differentiation of human cord blood stem cells in SCID mice

The normal thymus contributes to T lymphocytes differentiation and induction of tolerance to self-antigens. Myasthenia gravis (MG) is characterized by abnormal thymic hyperplasia. To assess the potential influence of MG-thymus on the differentiation of T lymphocytes differentiation, we used the MG-thymus transplanted severe combined immunodeficiency (SCID) mice model to evaluate the human cord blood stem cells differentiation. Thymus fragments from MG patient and human cord blood stem cells were transplanted into SCID mice successively. SCID mice were observed to develop sustained human T lymphocytes and a functional anti-tumor immune. The levels of various T cell subsets in SCID mice with MG-thymus were different from that of control group. Among that, the frequency of CD4⁺CD25⁺ T cells was significant lower in SCID mice with MG-thymus. The deficiency of CD4⁺CD25⁺ T cells seens to contribute to the pathogenesis of MG.     

EAE大鼠胸腺CD4~+ CD25~+ Foxp3~+ Treg细胞的动态变化及α-硫辛酸的干预作用

目的探讨实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)大鼠不同病程中胸腺CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞变化情况及α-硫辛酸对EAE大鼠胸腺的干预作用。方法取不同时期对照组、自然病程EAE组及α-硫辛酸EAE组大鼠的胸腺组织做流式细胞学,动态检测CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的变化情况。结果 EAE组大鼠急性期、复发期CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞较同时期对照组明显减少(P<0.05),缓解期有所上升;α-硫辛酸组与同期EAE组相比CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞无明显变化;半年期三组大鼠胸腺CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞都明显下降,各组间无统计学差异。结论 CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞参与了EAE的发病,与病程的发展密切相关;α-硫辛酸对EAE大鼠的干预作用并非通过CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞发挥其治疗作用;随着年龄的增长,胸腺不再是机体的主要免疫器官。     

肝移植后受者淋巴细胞亚群表达与免疫平衡

背景：有文献报道,肝移植后受者外周血淋巴细胞的变化较肝脏酶学的改变更为敏感,其特异性有待进一步研究。 目的：分析淋巴细胞亚群中CD3-/HLA-DR+,CD3+/CD25+和CD3+/HLA-DR-与肝移植受者机体免疫状况和并发症的关系。 方法：应用全自动生化分析仪和流式细胞分析仪检测56例肝移植受者移植后肝功能和淋巴细胞亚群,依照肝功能情况划分为肝功能正常组52例和肝功能异常组27例,肝功能异常组中分为急性排斥组7例、药物反应组11例和原因不明组9例。分析各组肝移植受者CD3-/HLA-DR+,CD3+/CD25+和CD3+/HLA-DR 表达水平与其并发症的关系。 结果与结论：肝功能正常组CD3-/HLA-DR+和CD3+/CD25+的表达水平低于肝功能异常组(P=0.011,0.002),CD3+/HLA-DR-的表达高于肝功能异常组(P=0.012)。CD3-/HLA-DR+和CD3+/CD25+在急性排斥组的表达水平明显高于药物反应组(P=0.039,0.048),急性排斥组CD3+/HLA-DR-的表达水平低于药物反应组(P=0.007)。提示CD3-/HLA-DR+,CD3+/CD25+和CD3+/HLA-DR-的表达水平与肝移植后受者机体免疫状况及并发症密切相关,可作为判断肝移植后受者并发症的辅助指标以及进行免疫干预的参考依据。 关键词：肝移植;CD3-/HLA-DR+;CD3+/CD25+;CD3+/HLA-DR-;排斥;药物反应     

人羊膜间充质干细胞静脉移植治疗阿尔茨海默病APP+转基因鼠的

目的：评估人羊膜间充质干细胞静脉移植治疗阿尔茨海默病APP转基因鼠的有效性和安全性。 方法：饲养转基因APP+胎鼠,定期合笼,利用PCR技术快速鉴定转基因鼠,以刚果红染色法观察脑组织切片中的β-淀粉样蛋白沉积。严格无菌条件下取正常足月剖腹产胎儿的羊膜,体外分离培养羊膜间充质干细胞,至第3代经尾静脉移植。Morris水迷宫测试移植前后小鼠学习、记忆能力。移植当天开始称重,每隔三天一次,持续三周。移植后解剖小鼠,收集全血并分离血清,进行心、肝、肾功能的血液生化和12项肿瘤标记物检测,对该细胞治疗的安全性作综合评价。 结果：移植后小鼠学习、记忆能力明显增强。移植组动物的体重增长趋势与对照组相比无明显差异（P＞0.05）,未见肿瘤和死亡发生。血液生化和12项肿瘤标记物各指标无明显差异（P＞0.05）。 结论：人羊膜间充质干细胞尾静脉移植治疗阿尔茨海默氏症小鼠明显促进小鼠学习、记忆能力,未见致死致瘤现象发生,心、肝、肾功能未受影响。利用该种干细胞移植治疗阿尔茨海默氏病是安全可行的。