将含有报告基因LacZ的重组腺病毒载体从大鼠鼻腔转移至脑的实验研究

目的探讨将携带有报告基因的腺病毒载体由鼻腔转移至脑途径的可行性。方法将携带半乳糖苷酶报告基因（LacZ）的5型重组腺病毒载体（Ad5 CMV LacZ）注入SD大鼠鼻腔黏膜,分别在注射3d、7d、14d、21d及28d切取大鼠鼻腔黏膜以及与嗅觉信息传导途径相关的脑组织,进行冰冻切片和β-半乳糖苷酶（β-gal）免疫组织化学反应显色,判断该载体是否转染和表达蛋白质产物。结果β-gal免疫组化染色反应显示,该病毒载体从第3天起即可在鼻腔黏膜与嗅球内的细胞转染和表达,在第7天至第21天病毒载体逐渐向颅内深部的室管膜下区、杏仁核及齿状回细胞转移和表达,持续性表达蛋白质产物达28d之久。结论经鼻腔黏膜注入腺病毒载体不仅可将外源性基因转移到脑实质内,还可确保外源性基因转染和表达成功。     

成年大鼠腺病毒表达载体介导Lac Z基因从腓肠肌沿坐骨神经转移至脊髓的研究

目的 探索将具有报告基因的重组腺病毒载体从下肢效应器沿其支配的脊神经转移至脊髓的途径.方法 将携带半乳糖苷酶报告基因(Lac Z)的5型重组腺病毒载体(Ad5 CMV LacZ)注入到成年Wistar大鼠的腓肠肌(病毒滴度为1.01×105 pfu/mL),分别在注射后第3天、7天、14天、21天及28天灌注固定动物,选取腓肠肌、与腰骶神经丛相连的脊髓节段以及对应的脊神经节作为观察对象,用β-半乳糖苷酶免疫组织化学反应鉴定被转染和表达蛋白质的细胞.结果 在注射腓肠肌3 d后,该肌肉内有被转染及表达产物的细胞;7 d后在脊神经节内出现被转染和表达的细胞;14 d后在脊髓白质的后索及外侧索内出现上述细胞;21～28 d后在脊髓灰质的后角、中间带及前角出现被转染和表达的细胞.结论 随注射时间推移,腺病毒表达载体可从下肢骨骼肌沿着受支配的脊神经转移到脊髓,所携带的报告基因也成功地表达产物,故这是一条具有潜在应用价值的微创性基因治疗脊髓疾病的途径.     

重组腺病毒转染兔心肌细胞的实验研究

目的:观察腺病毒载体转染兔心肌细胞的有效性和外源性基因表达的时相性.方法:用Adv5-CAG粘粒(对照组)或Adv5-CAG/LacZ质粒(治疗组)转染兔心肌,转染后第3、7、14、28天取被转染心肌组织行X-gal染色及β-半乳糖苷酶活性检测.结果:X-gal染色示,治疗组转染后第3、7、14、28天注射部位心肌均见蓝染,尤以第7、14天明显,而对照组所有心肌均无蓝染;β-半乳糖苷酶活性检查示治疗组转染后第3天心肌中即有β-半乳糖苷酶表达,第7、14天表达达高峰,28天表达量明显减少.结论:重组腺病毒载体可成功转染兔心肌细胞,外源性基因在兔心肌细胞中能有效地表达并能维持1个月左右.     

腺病毒载体携外源基因转染人培养静脉的实验研究

目的 :探讨经腺病毒载体介导的标记基因转染人培养大隐静脉后 ,标记基因表达的效率、转染靶细胞表达时相。方法 :从临床手术患者取得大隐静脉后 ,浸于含AdCMV/LacZ或AdCMV的病毒液中 (5× 10 9pfu) ,孵育 1h ,将静脉剪成静脉片 ,分别培养 2 ,7,14d。对转基因静脉片进行组织学检查。结果 :腺病毒载体可有效地将标记基因 (LacZ基因 )转入培养大隐静脉。转染后 2d内皮细胞和外膜细胞即有表达 ,β 半乳糖苷酶组织化学染色可见胞核蓝染阳性细胞 ,7d时表达最高 ,持续表达到第 14d。对照大隐静脉无β 半乳糖苷酶表达。 结论 :腺病毒载体能高效转染人大隐静脉 ,其靶细胞以内皮细胞为主 ,外源性基因的表达至少维持 2周左右     

成年大鼠侧脑室注射与脑实质注射腺病毒表达载体转染脑细胞的比较研究

目的比较观察脑室注射和脑实质注射腺病毒表达载体转染脑细胞的范围及表达产物的程度。方法分别将Ad5CMV LacZ表达载体（20μl,病毒滴度为1．01×10^5pfu／ml）注入成年SD大鼠右侧脑室、尾壳核、内侧隔核-斜角带复合体和背侧海马,在注射后3～28d将大鼠脑制作成为切片,进行X-gal组织化学反应,观察被转染和表达的细胞形态和数目。结果在侧脑室内注射后3d,右侧侧脑室室管膜细胞及其下层开始有病毒载体转染和表达,继之向对侧侧脑室、第三脑室和第四脑室转染和表达产物,脊髓中央管壁偶尔有被转染和表达的细胞;而将等体积和等滴度的AdSCMV LacZ载体注入尾壳核、内侧隔核-斜角带复合体和背侧海马,则均出现直径约2～5mm的转染范围,表达产物的细胞离注射原位最远处约为5—6mm,细胞表达产物很局限并相对集中;而侧脑室注射病毒载体可以随脑脊液流动而使转染范围广,但被转染细胞主要集中在室管膜及其下层,离脑室壁最远处也只在0．5—2mm范围内。结论侧脑室注射病毒表达载体便于基因治疗弥漫性脑疾病;而脑实质注射病毒表达载体则利于基因治疗局部性脑疾病。     

腺相关病毒介导的心肌基因转染在心脏移植中的应用

目的：探讨在不同转导方法下,将外源性基因转入供体心脏的可行性。方法：将携带报告基因半乳糖苷酶基酶（LacZ）的病毒载体经三种办法转导供体心脏方法：直接心肌注射法,经冠状动脉单次灌注法,组织胺预处理＋经冠状动脉单次灌注法。心脏移植21d后,供体心脏进行组织学检查,分析报告基因转染和表达。结果：经冠状动脉单次灌注法,组织胺预处理＋经冠状动脉单次灌注法处理的两组移植心脏中未发现有报告基因的表达,直接心肌注射法组的移植物中发现有高效表达的报告基因。结论：在非生理状态下,经冠状动脉单次灌注病毒载体不能有效转染外源性基因,直接心肌注射法在心脏移植中是可行的。     

重组β—半乳糖苷酶腺病毒载体的构建及其在血管闰滑肌细胞中的表达

目的构建表达β-半乳糖苷酶(β-gal)的重组腺病毒,以期为再狭窄的基因治疗研究提供一个对照载 体和为腺病毒介导的基因转移的安全性、可行性、转染效率的研究提供一有用的工具。方法采用基因重组方法构 建穿梭质粒pAd-β-gal,通过同源重组法制备出重组腺病毒Ad-β-gal,转染的293细胞用X-gal染色鉴定Ad-β -gal的正确与否。通过测定260nm的紫外光吸收值估计病毒高度。原代大鼠血管平滑肌细胞采用组织块培养 法。Ad-β-gal以100moi感染VSMCs并行X-gal染色,以观察β-gal在VSMCs中的表达情况。结果成功构建了 pAd-β-gal穿梭质粒和Ad-β-gal重组腺病毒,转染的293细胞和VSMCs经X-gal染为蓝色,病毒浓度为9×l011 pfu/ml,以100moiAd-β-gal转染VSMCs,其转染效率接近l00%。结论表达β-gal的重组腺病毒构建成功,并在 VSMCs中得到有效表达,本研究为将来再狭窄基因治疗研究提供了一对照载体,也为腺病毒介导的基因转移的安 全性、可行性、有效性的研究提供了一有用的工具。     

腺病毒携带的LacZ基因静脉注射后在大鼠体内的表达

目的 :探讨周围静脉注射的腺病毒载体介导的外源基因在体内不同组织的表达。方法 :将重组LacZ腺病毒经尾静脉注射导入Wistar大鼠体内 ,以X -gal染色法明确腺病毒载体介导的标识基因 (LacZ)在大鼠体内的表达部位和时间。结果 :β- gal表达具有剂量依赖性 ,而且存在器官、组织和细胞三种水平的表达差异。剂量较小时 ,肺、肾、肝、脾优先表达 ,而心肌在 1× 1 0 1 1 pfu/kg剂量组才有少量表达 ,大血管和脑组织始终未见表达。注射后 1～ 2周 ,大鼠的肾、肺、肝、脾、肾上腺高表达 β -半乳糖苷酶 ,3～ 4周表达量减少 ,5周基本消失。 结论 :腺病毒介导的外源基因经静脉途径转移 ,可能是肾、肺、肝的部分疾病基因治疗的有效基因转移途径 ,而对心脑血管疾病不适合。     

含有CD基因的腺病毒载体的构建

目的 :构建携带CD基因和LacZ报告基因的腺病毒载体。方法 :先将真核表达载体质粒 pCI中的转录框架构建入腺病毒载体中 ,后再将CD和LacZ基因分别装配到框架的多克隆位点内。结果 :经过酶切鉴定成功地构建了分别携带CD基因和LacZ报告基因的腺病毒载体 ,对肿瘤的前药转换基因治疗有重要意义。     

不同病毒载体感染内耳组织的比较研究

目的 通过血清5型重组腺病毒和血清2型重组腺相关病毒感染大鼠内耳组织的比较研究,筛选出更适合内耳基因治疗的病毒载体.方法 一定体积的血清5型重组腺病毒液和血清2型重组腺相关病毒液经圆窗膜注入鼓阶外淋巴液,通过荧光共聚焦显微镜、免疫组化、Western免疫印迹及听性脑干反应等方法 对两种载体所携带报告基因的表达部位、表达时程以及两种病毒本身对内耳组织细胞生活状态的影响加以比较.结果 血清5型重组腺病毒和血清2型重组腺相关病毒所携带的增强型绿色荧光蛋白报告基因均可在前庭膜、血管纹、基底膜、盖膜、螺旋神经节区及转染对侧耳表达.rAAV2携带的EGFP蛋白第14天表达开始明显增多,第60天仍可检测到高表达.rAd5携带的EGFP蛋白在耳蜗组织内的表达高峰维持在第1～21天,在30天时表达明显减弱.结论 腺病毒的优势在于其基因表达的迅速和高效,而腺相关病毒载体以其长的表达时程,低组织细胞毒性在内耳基因转染中表现出独特的优势.