穿心莲甲羟戊酸5-焦磷酸脱羧酶基因的克隆与表达

穿心莲内酯是穿心莲的主要药效成分,广泛用于抗炎。为了对它的生物合成进行遗传调控,提高内酯类成分的合成量,作者在转录组数据分析的基础上,获得了穿心莲内酯生物合成途径中甲羟戊酸5-焦磷酸脱羧酶基因的3个克隆,包含的ORF均长1 260 bp,分别在4个位点具有单碱基的差异。它们编码由419个残基组成的氨基酸序列;保守结构域中均具有11个高度保守的氨基酸,分别决定催化反应的特异性和活性;N端不含有质体定位的信号肽;与丹参的MVD蛋白(Gen Bank号AEZ55675.1)一致性较高。在穿心莲茎和叶片中,MVD基因的表达量分别在花蕾期和初花期最高,但各时期表达量的倍数差异不大。该研究获得的MVD基因,为后续进行详细的功能解析,并进一步应用于穿心莲内酯的遗传调控,奠定了基础。     

三七香叶基香叶基焦磷酸合酶基因的克隆及表达分析

基于三七转录组测序结果,选择萜类代谢骨架上香叶基香叶基焦磷酸合酶基因(GGPPS),结合RACE技术,克隆得到全长1 203 bp的cDNA序列,最长开放阅读框为1 035 bp,命名为PnGGPPS,GeneBank登录号为KM486564,PnGGPPS基因全长2 370 bp,包含1个内含子和2个外显子,该基因编码344个氨基酸,与蓖麻Ricinus communis、丹参Salvia miltiorrhiza等植物GGPPS的同源性达到73%以上,具有富天冬氨酸区等多个结构域,属于类异戊二烯合成酶超家族。实时荧光定量PCR结果显示,PnGGPPS在一至三年生三七的根、茎、叶和三年生的花等不同器官组织中均有表达,但以三年生叶中具有显著水平的高表达量,暗示其既具有调节三七生长发育的基本功能,也与三七叶绿素和类胡萝卜素的合成、叶绿体的发育、阴生适应性,以及品质的形成有关。     

马蓝色氨酸合成酶基因的克隆及表达分析

目的 克隆马蓝Baphicacanthus cusia吲哚类生物碱合成途径的色氨酸合成酶（tryptophan synthase,TSB）基因,命名为BcTSB（GenBank登录号AYM45644.1）,对其生物信息学和表达进行分析。方法 基于前期马蓝转录组数据库,获得BcTSB基因开放阅读框（ORF）,运用生物信息学手段对基因功能做出初步预测,构建pET32a-BcTSB原核表达载体,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE检测。通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测马蓝不同组织（根、茎、叶）中TSB表达水平。结果 克隆的BcTSB基因ORF长度为1 452 bp,编码483个氨基酸,生物信息学预测为亲水性蛋白,定位于叶绿体,该蛋白相对分子质量为51 665.89,pET-32a载体包含18 000的标签。SDS-PAGE分析在70 000处出现目的蛋白条带,与理论预期值大小一致。qRT-PCR分析显示BcTSB基因在马蓝不同组织中均有表达,且在茎中的表达量最高。结论 通过对BcTSB基因的克隆及表达分析,为进一步研究该基因功能及调控奠定了实验基础。     

影响穿心莲片中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯含量测定的因素

目的:确定影响穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的提取因素.方法:以穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯含量为指标,采用高效液相色谱法进行含量测定.结果:穿心莲片的最佳提取条件为甲醇浸泡1 h后超声0.5 h、过中性氧化铝柱并以15 mL甲醇洗脱.结论:此方法适合穿心莲的分析.     

唇形科植物牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶编码基因及其氨基酸序列的生物信息学分析

牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPS)是二萜类物质合成途径中的一个关键酶。该文采用生物信息学方法对9种唇形科植物的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶的核苷酸及其编码的氨基酸序列的结构、理化性质、信号肽、导肽、跨膜结构域、疏水性/亲水性和亚细胞定位特征、二级结构、蛋白质功能域、三级结构和进化关系进行了初步预测和分析,并构建了牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶蛋白家族的系统进化树。结果表明,9种唇形科植物的GGPS氨基酸序列理化性质基本一致,主要表现为亲水性蛋白,有叶绿体转运肽,不存在信号肽,没有跨膜结构域;大多数定位于叶绿体,少数定位于线粒体。蛋白质二级结构中最主要的结构元件是α-螺旋和无规则卷曲,含有多聚异戊二烯基合成酶的活性结构域、2个天冬氨酸富集区结构域、活性位点残基盖结构域和镁离子结合位点结构域。研究结果将为GGPS的酶学特性及二萜类生物合成的分子机制研究提供理论参考。     

罗汉果法呢基焦磷酸合成酶基因的克隆及其序列分析

目的 对罗汉果甜苷V生物合成途径的关键酶法呢基焦磷酸合成酶(Farnesyl pyrophosphate synthase,FPPS)基因的全长cDNA序列进行克隆,为研究罗汉果甜苷V生物合成与基因调控奠定基础.方法 根据植物FPPS基因保守功能域设计简并引物,通过PCR和RACE方法克隆罗汉果FPPS基因的全长cDNA.结果 获得罗汉果FPPS (SgFPPS)基因的全长cDNA序列共1354个核苷酸,包含一个1026核苷酸的开放阅读框架(open reading frame,ORF),cDNA编码的蛋白包含342个氨基酸,推断蛋白质相对分子质量为3.92×104.NCBI Blastx结果显示,SgFPPS基因编码的蛋白与苹果树来源FPPS具有最高同源性,氨基酸一致度达85.1％.SgFPPS具有异戊烯基转移酶的5个典型保守功能域.进化树分析结果显示,SgFPPS基因与苹果树的FPPS具有较近的亲缘关系.结论 首次克隆SgFPPS基因的全长cDNA序列,为分析SgFPPS基因表达特性及其在罗汉果甜苷V生物合成中的功能奠定基础.     

雷公藤牻牛儿基焦磷酸合酶基因TwGPPS克隆与表达分析

根据雷公藤悬浮细胞转录组数据设计特异引物,采用cDNA末端快速扩增技术克隆雷公藤牻牛儿基焦磷酸合酶基因TwGPPS1,TwGPPS2全长cDNA,并进行生物信息学分析和蛋白表达研究。首次克隆得到TwGPPS1核苷酸的完整开放阅读框长度为1 278 bp,编码425个氨基酸蛋白,预测蛋白等电点为6.68,相对分子质量为47.189 kDa;TwGPPS2核苷酸的完整开放阅读框长度为1 269 bp,编码422个氨基酸蛋白,预测蛋白等电点为6.71,相对分子质量为46.774 kDa;进一步构建了原核重组表达载体pET-32a-TwGPPS1,pET-32a-TwGPPS2,并成功诱导出TwGPPS1,TwGPPS2重组蛋白,为深入研究此关键酶基因功能和雷公藤萜类生物合成途径奠定基础。     

刺五加法尼基焦磷酸合酶基因的克隆、 生物信息学及表达分析

目的:克隆刺五加的法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase,FPS)基因,并对其进行生物信息学和表达分析.方法:采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆刺五加FPS基因的全长cDNA序列.运用生物信息学方法对该基因进行分析,预测其编码蛋白的结构与功能.并通过RT-PCR法检测FPS在不同器官中的表达情况.结果:刺五加FPS基因的cDNA全长为1 499 bp,开放阅读框长1 029 bp,编码342个氨基酸的蛋白,包含2个富含天冬氨酸(DDXXD)的保守功能域.FPS蛋白无跨膜区域,定位于细胞质中.RT-PCR的结果显示,刺五加FPS基因在各器官中均有表达,但表达最具有显著差异(P＜0.05).结论:首次分离并报道了刺五加FPS的cDNA克隆,并证实其在不同器官中的表达量不同,为进一步研究FPS对刺五加皂苷合成的影响和表达调控奠定了基础.     

穿心莲片中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的药代动力学研究

目的:研究穿心莲片中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的药代动力学.方法:采用已建立的LC/MS/MS法测定大鼠血浆中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的浓度,计算其药代动力学参数.结果:穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯在该条件下分离良好,保留时间分别为1.9 min和3.0 min.穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的线性范围均为0.05～10 μg/mL.定量下限均为0.05 μg/mL.结论:该方法简便、灵敏、专属性强,适合于穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯在大鼠体内的药代动力学研究.     

穿心莲片生产过程中脱水穿心莲内酯的含量变化

目的:了解穿心莲片在生产过程中化学成分的含量变化。方法:采用TLCS,TLC,HPLC法对穿心莲片生产过程中的各阶段产物的有效成分含量进行监测,并观察热对其化学成分的影响。结果:穿心莲片按现有的药典工艺生产,穿心莲内酯损失殆尽,只能检测到脱水穿心莲内酯,引致化学变化的主要因素是工艺过程中的加热。结论:避免热处理或缩短热处理时间是减少有效成分损失的有效因素。     

穿心莲糖苷水解酶基因ApGH的克隆、生物信息学分析及表达研究

目的 对穿心莲糖苷水解酶（ApGH）基因进行克隆、生物信息学分析、原核表达和相对表达量分析。方法 取穿心莲新鲜叶片,提取RNA并反转录为互补脱氧核糖核酸（cDNA）作为模板,以穿心莲转录组中筛选到的糖苷水解酶ApGH基因开放阅读框（ORF）设计特异性引物,进行聚合酶链式反应（PCR）扩增,经测序后获得的基因序列利用生物信息学软件预测基因编码蛋白特征,构建原核表达载体在大肠埃希菌中诱导表达目的蛋白质,并利用实时荧光定量PCR分析ApGH基因的表达模式。结果 克隆所得ApGH基因的ORF全长1734 bp,编码577个氨基酸（GenBank登录号：OR887606）。ApGH为稳定亲水蛋白质,无信号肽和跨膜结构域,属于糖苷水解酶家族;系统进化分析表明,ApGH归属于GH1家族。将ApGH基因构建到原核表达载体HIS-MBP-pET28a上,在大肠埃希菌Transetta（DE3）中成功表达出重组蛋白质。实时荧光定量PCR检测结果表明,ApGH基因在叶中表达量最高,茎和根中表达量较低。结论 克隆得到穿心莲ApGH基因并对其蛋白质序列特征进行了系统分析,证明其在大肠埃希菌中成功表达重组蛋白质,且主要在穿心莲叶中表达。研究结果为进一步探索穿心莲糖苷水解酶的催化功能提供了依据。     

不同生长期穿心莲活性成分及关键酶基因差异表达研究

目的对主产地广东遂溪、福建漳浦及引种栽培地区江苏南京、淮安的不同生长期穿心莲Andrographis paniculata活性成分及关键酶基因表达情况进行分析,研究穿心莲活性成分积累动态,探讨其最佳采收期及分子机制。方法用HPLC法测定穿心莲内酯及脱水穿心莲内酯量,并用实时荧光定量PCR技术从m RNA水平比较研究不同生长期穿心莲关键酶ent-柯巴基焦磷酸合酶(CPS)基因的表达情况。结果不同产地穿心莲生长过程基本一致,在营养生长时期生长迅速,进入生殖生长后生长趋于平缓。4个产地穿心莲样品中活性成分变化趋势相近,穿心莲内酯量均在始花期达到最高,脱水穿心莲内酯量变化较平缓;穿心莲CPS基因的相对表达量在蕾期至始花期相对较高,与穿心莲内酯量呈显著正相关。4个产地穿心莲的穿心莲内酯与脱水穿心莲内酯之和均达到《中国药典》2010年版标准。结论穿心莲最佳采收期应以物候期为评判依据,其最佳采收期为始花期。     

穿心莲提取物中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯大鼠肠吸收特性研究

目的研究穿心莲提取物中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的大鼠在体肠吸收特性。方法采用大鼠在体肠灌注实验模型,以紫外分光光度法测定酚红质量浓度,高效液相色谱法测定灌注液中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯质量浓度,分别研究质量浓度、p H值和吸收部位对穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯肠吸收的影响。结果随着穿心莲提取物(111.22~335.78μg/m L)质量浓度的增加,穿心莲内酯的吸收速率常数(Ka)和单位时间吸收率(P)均降低;随着p H值由5.34升至6.38,穿心莲内酯的Ka和P略微增加,随着p H值由6.38升至7.40,穿心莲内酯的Ka和P均降低;穿心莲内酯在不同肠段中均有吸收,各肠段的P按十二指肠、空肠、回肠、结肠顺序依次下降。穿心莲提取物在111.22~222.78μg/m L随着质量浓度增大,脱水穿心莲内酯的Ka和P均下降;穿心莲提取物在222.78~335.78μg/m L随着质量浓度增大,脱水穿心莲内酯的Ka和P基本无变化;p H值5.34时吸收较好,随着p H值由5.34升至7.40,脱水穿心莲内酯的Ka和P呈略微下降的趋势;P按回肠、空肠、结肠、十二指肠顺序依次下降。结论穿心莲提取物中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯在小肠的吸收均不是简单的被动扩散,还包括载体媒介转运;吸收均受p H值的影响;十二指肠为穿心莲内酯的最佳吸收部位,回肠为脱水穿心莲内酯的最佳吸收部位;肠吸收时穿心莲提取物中其他成分对穿心莲内酯的吸收基本无影响,但对脱水穿心莲内酯的吸收有一定的促进作用。     

UPLC-Q-TOF-MS筛选穿心莲中亲和Caco-2细胞的活性成分

目的采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)技术筛选穿心莲与Caco-2细胞亲和的活性成分。方法利用Caco-2细胞进行药物摄取结合药物吸收转运实验共同筛选穿心莲的亲和活性成分,采用UPLC-Q-TOF-MS测定亲和前后的细胞样品。根据各化学成分的保留时间、质谱信息,并结合提取离子流图与对照品、相关文献质谱数据对比鉴定各亲和活性成分。结果从穿心莲中共筛选出10种能与Caco-2细胞亲和的活性成分,分别为12,13-双氢穿心莲内酯(1)、黄芩黄酮I-2′-O-葡萄糖苷(2)、穿心莲内酯(3)、14-脱氧-11,12-二脱氢穿心莲内酯苷(4)、7-羟基脱水穿心莲内酯(5)、新穿心莲内酯(6)、3-去氧脱水穿心莲内酯苷(7)、去氧穿心莲内酯(8)和脱水穿心莲内酯(9)和1种未知成分。结论结合UPLC-Q-TOF-MS技术建立的筛选穿心莲中与Caco-2细胞亲和活性成分的方法,可用于筛选中药复杂体系中的活性成分,为进一步研究活性成分群间的协同配伍效应奠定基础。     

穿心莲转录因子ApNAC1的克隆、亚细胞定位及原核表达

从穿心莲叶片中克隆了1个NAC家族的转录因子,命名为ApNAC1,Gen Bank注册号为KY196416。生物信息学分析表明该基因的完整编码区包含972 bp,编码1个323个氨基酸的多肽,预测蛋白相对分子质量为35.9 k Da,等电点为6.14。原生质体瞬时表达研究证实了ApNAC1-GFP融合蛋白特异定位在穿心莲叶肉细胞的细胞核中,是一个核定位蛋白。实时定量PCR结果表明ApNAC1基因表达与穿心莲内酯的积累模式一致:主要在穿心莲的叶片里表达,而且茉莉酸甲酯处理能急剧上调其表达水平。ApNAC1基因在大肠杆菌中进行异源表达,并且被成功纯化。该研究为进一步探索ApNAC1蛋白参与穿心莲内酯生物合成的研究奠定了基础。     

影响穿心莲颗粒溶出行为的关键颗粒物理特性参数研究

 目的 研究颗粒的关键物理特性参数对穿心莲颗粒溶出行为的影响。方法 以穿心莲提取物为模型药物,采用不同的工艺分别与微晶纤维素/淀粉按质量比1∶1混合,分别采用摇摆挤压与高速搅拌湿法制粒,后测定颗粒的溶出行为。以脱水穿心莲内酯平衡溶出量与溶出速率常数为指标评价颗粒溶出行为,并采用逐步回归分析方法研究颗粒关键物理特性参数对溶出行为的影响。结果 颗粒的粒径、临界相对湿度、含水量、孔体积、密度是影响穿心莲颗粒中脱水穿心莲内酯溶出行为的关键物理特性参数。结论 穿心莲颗粒中脱水穿心莲内酯的平衡溶出量与颗粒d50及临界相对湿度呈负相关,与颗粒含水量成正相关;溶出速率常数与颗粒等体积平均径D及PV呈负相关,与振实密度成正相关。     

穿心莲化学成分的研究

目的研究穿心莲Andrographis paniculata的化学成分。方法利用硅胶柱色谱、聚酰胺柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、ODS柱色谱、反相制备色谱等技术进行分离,并根据理化性质和波谱学手段对分得的化合物进行结构鉴定。结果分离得到10个化合物,分别鉴定为穿心莲酸(1)、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸丁酯(2)、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸乙酯(3)、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(4)、金合欢素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(5)、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(6)、异高黄芩素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(7)、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷(8)、6-C-β-D-葡萄糖-8-C-β-D-半乳糖芹菜素(9)、绿原酸(10)。结论化合物2～7、9、10为首次从穿心莲属植物中分离得到。     

穿心莲化学成分的研究（II）

目的研究穿心莲Andrographis paniculata地上部分的化学成分。方法采用反相硅胶柱色谱、聚酰胺柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、反相制备高效液相色谱等技术对穿心莲水提取物进行分离纯化,并根据理化性质和波谱学手段进行结构鉴定。结果从穿心莲地上部分70%乙醇浸膏的水提物中分离得到15个化合物,分别鉴定为5,4′-二羟基-7-甲氧基-8-O-β-D-葡萄糖黄酮苷(1)、芹菜素(2)、木犀草素(3)、6,8-二-C-β-D-葡萄糖白杨素(4)、异高黄芩素(5)、5-咖啡酰基奎宁酸(6)、3,4-二咖啡酰基奎宁酸(7)、3,4-二咖啡酰基奎宁酸甲酯(8)、3,4-二咖啡酰基奎宁酸丁酯(9)、4,5-二咖啡酰基奎宁酸甲酯(10)、咖啡酸(11)、对羟基桂皮酸(12)、阿魏酸(13)、原儿茶酸(14)、富马酸单乙酯(15)。结论化合物4～6、9、10、14、15为首次从穿心莲属植物中分离得到。     

布渣叶查耳酮合酶基因全长cDNA克隆及其表达模式分析

目的克隆布渣叶查耳酮合酶基因(Mp CHS)全长c DNA,并对其在不同部位和不同生长阶段叶片中的表达模式进行分析。方法以布渣叶叶片总RNA逆转录合成c DNA为模板,根据其转录组数据设计特异引物序列,PCR扩增Mp CHS基因全长c DNA,经质粒连接、转化、扩培,挑选阳性克隆测序、分析并构建原核表达载体。同时,采用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)对Mp CHS基因的表达模式进行分析。结果成功克隆得到Mp CHS基因全长c DNA(Gen Bank:KY472608)。生物信息学分析表明其开放阅读框为1 176 bp,编码含391个氨基酸的蛋白,其相对分子质量为42 700,理论等电点6.11,具有CHS家族蛋白3个保守的功能活性位点(165 C、304 H和337 N)和特征多肽标签序列RLMMYQQGCFAGGTVLR和GVLFGFGPGL。系统进化树分析发现Mp CHS与可可、陆地棉等木本植物的亲缘关系比较近。RT-q PCR结果表明,Mp CHS基因在不同部位均有表达,在叶片中的表达量随着生长过程逐步降低。结论首次克隆得到Mp CHS基因,并分析了Mp CHS基因在布渣叶不同部位和不同生长阶段叶片中的表达模式,为Mp CHS基因的原核表达和功能验证奠定了基础,也为进一步解析布渣叶黄酮类生物合成途径提供了参考。