血管内皮生长因子受体结合肽介导颗粒酶靶向性抗肿瘤血管生成

目的：观察血管内皮生长因子受体（VEGFR）结合肽－颗粒酶B（GraB）融合蛋白抗血管生成的作用。方法：抽提人外周血淋巴细胞总RNA，进行RT－PCR克隆GraBcDNA；抽提LoVo细胞总RNA，进行RT－PCR克隆VEGFR结合肽cDNA，用限制性酶切和DNA测序进行鉴定，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）分析表达产物，表达产物经亲和层析纯化后，以人血管内皮细胞（ECV304）和鸡胚尿囊膜血管测定其生物学活性。结果：表达产物以可溶性分子形式存在于菌体中，具有良好的抗原性和特异性，且具有抑内管内皮细胞增殖及破坏鸡胚尿囊膜血管形成的活性，结论：VEGFR结合肽－GraB融合蛋白具有抑制血管生成的功能，在肿瘤生物靶向治疗中有一定潜在价值。     

应用endostatin蛋白治疗裸鼠SHG44脑胶质瘤的实验

目的　克隆小鼠内皮抑素 (endostatin)基因 ,检测其表达蛋白生物学活性 ,应用该蛋白治疗裸鼠 SHG44脑胶质瘤 .方法　从小鼠胶原 c DNA用 PCR法克隆 endostatin基因 ,重组入 p UC19,测序后构建非融合表达载体 p DH- En-dostatin,使其在 DH5 α内经温度诱导表达 ,纯化该表达蛋白并用鸡胚绒毛膜尿囊膜实验和内皮细胞抑制实验检测其活性 .经荷瘤裸鼠皮下注射该蛋白治疗其脑内胶质瘤 .结果　成功获得 endostatin基因 ,测序正确 .诱导表达蛋白 Mr为2 0× 10 3 ,具有抑制血管生成的活性 .该蛋白可抑制荷瘤裸鼠脑内胶质瘤生长 .结论　 endostatin基因的表达和初步应用 ,为采用抗血管生成方法治疗脑胶质瘤等实体瘤研究奠定了实验基础 .     

重组腺病毒rAdCDglyES的ES基因生物活性鉴定

目的:对构建的含融合自杀基因CDglyES的重组腺病毒中的ES基因是否具有独立的生物活性功能进行鉴定,为rAdCDglyES用于治疗恶性肿瘤奠定理论依据。方法:用重组腺病毒rAdCDglyES培养上清,在体外进行内皮细胞ECV-304生长抑制实验,同时做鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验,观察血管生成抑制。结果:重组腺病毒rAdCDg-lyES培养上清对内皮细胞ECV-304的生成有抑制作用(抑制率78.7%),而在鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验中加入培养物上清的实验组与对照组相比鸡胚尿囊膜血管密度稀疏,平均血管数差异明显(P<0.01)。结论:构建的重组腺病毒rAdCDglyES表达产物具有独立的ES功能即抑制内皮细胞增殖,抑制新生血管形成的生物功能。     

软骨抗癌活性成分抑制血管生成机理的研究

目的:为了阐明从牛软骨中提取的抗癌活性成分:软骨抗肿瘤制剂(CATP)、软骨血管生成抑制剂(CAIP)和软骨血管生成抑制因子(CAIF)的作用机理。方法:参照Takigawa法和付生法等方法,分别测定了CATP、CAIP、CAIF对血管内皮细胞DNA合成、内皮细胞迁移运动以及鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的影响。结果:CATP、CAIP和CAIF对内皮细胞的DNA合成和细胞迁移运动以及鸡胚绒毛尿囊膜血管生成具有明显的抑制作用。结论:提示从软骨中提取的这些抗癌活性成分有可能为临床开辟一条以抑制肿瘤血管生成为特色的抗癌治疗的新途径。     

内皮抑素基因重组腺病毒载体的构建及其对新生血管的影响

目的构建腺病毒介导的小鼠内皮抑素并观察其在体内、外的表达及对血管的抑制作用。方法以mEndostatin质粒为模板通过PCR方法扩增回收mEndostatin基因，将mEndostatin基因连接到腺病毒载体DC315中，构建PDC315-mEndo表达质粒。将此表达质粒与腺病毒重组质粒pBGHE3通过lipofectamine 2000共同转染293细胞，经同源重组产生重组腺病毒Ad-mEndo，用氯化铯密度梯度超速离心法纯化。用50%组织培养感染剂量法测定病毒滴度。体外转染骨肉瘤细胞株MG-63，用western印迹检测感染的骨肉瘤细胞上清夜mEndostatin的表达并通过鸡胚绒毛尿囊膜实验（chorioallantoic membrane，CAM）观察其抑制血管生成的活性。结果酶切、PCR及DNA测序鉴定表明成功构建了携带内皮抑素（Endostatin，ES）融合基因的重组腺病毒载体，而在鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验中加入培养物上清的实验组与对照组相比鸡胚尿囊膜血管密度稀疏，平均血管数差异明显（P〈0.01）。结论腺病毒介导的小鼠内皮抑素基因在体外获得高效表达，并可显著抑制血管生成。     

人血管内皮抑制素vasostatin120-180在大肠杆菌中的表达纯化及初步的抗血管生成活性研究

目的:在大肠杆菌中克隆和表达人源血管内皮抑制素vasostatin120-180(VAS)基因,并进行分离纯化及抑制新生血管生成活性鉴定。方法:根据大肠杆菌偏爱密码子,应用化学合成和分子克隆方法得到人源血管内皮抑制素120-180片段(即VAS)的编码基因。通过PCR和限制性内切酶消解,将VAS编码基因克隆入大肠杆菌表达载体pET28a中,并在BL21(DE3)菌株中经IPTG诱导、表达带有His融合标签的His-VAS重组蛋白。VAS蛋白的表达水平大约占细菌总蛋白的45%,大多数目的蛋白以包涵体形式存在,经过体外包涵体变性、复性及纯化,采用SDS-PAGE分析鉴定,用鸡胚尿囊膜血管生成抑制试验进行重组蛋白活性的生物活性鉴定。结果:经DNA序列分析鉴定,重组质粒pET28a-VAS构建成功,IPTG诱导后的融合蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,Western blotting分析并鉴定了VAS的分子属性。通过鸡胚尿囊膜试验验证,重组VAS蛋白能够很好地抑制微血管生成。结论:获得高效表达的、高纯度的VAS,为VAS进一步的功能分析和抑制血管生成活性研究奠定了基础。     

人canstatin基因的克隆、表达、纯化及其生物活性测定

目的:克隆人Canstatin cDNA,在E.coli中融合表达和纯化,并测定表达产物抑制新生血管生成活性.方法:从中国人胎盘组织提取总RNA,RT-PCR扩增出Canstatin cDNA,克隆入pTYB1载体中并测序,构建原核表达载体pTYB1-hCAN,IPTG诱导表达,几丁质亲和纯化,鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成实验进行活性测定.结果:RT-PCR产物约为700bp,测序结果与文献报道序列一致.构建了人Canstatin原核表达载体vTYB1-hCAN,在大肠杆菌中表达.纯化的融合蛋白在CAM实验中能明显抑制血管生成.结论:克隆、表达了具有生物学活性的人canstatin蛋白.     

血管内皮生长因子受体Flt-1结合小肽抑制肿瘤生长的实验研究

目的：检测从十二肽库中筛选获得的能与血管内皮细胞生长因子（VEGF）受体Flt-1结合的小肽的生物学活性。方法：免疫细胞化学方法检测小肽融合蛋白DHFR-F56/F90与人脐静脉内皮细胞的结合活性;鸡胚尿囊膜血管增生抑制实验检测DHFR-F56/F90能否抑制鸡胚新生血管形成;裸鼠成瘤实验检测DHFR-F56/F90对荷瘤裸鼠中肿瘤的生长抑制;免疫组织化学方法检测DHFR-F56/F90能否定位于肿瘤组织。结果：小肽融合蛋白DHFR-F56/F90能与人脐静脉内皮细胞结合,DHFR-F56能抑制鸡胚尿囊膜新生血管的形成,且DHFR-F56能与肿瘤细胞结合,促进肿瘤组织坏死及显著抑制肿瘤生长。结论：十二肽F56是VEGF结合Flt-1的有效拮抗剂,具有抑制VEGF诱导的新生血管形成而抗肿瘤生长和转移的潜在应用前景。     

VEGF165的载体构建、表达及其生物学活性

目的:构建血管内皮生长因子(VEGF)165原核表达载体,在大肠杆菌中表达,获得重组VEGF165,并通过细胞和鸡胚尿囊膜试验鉴定其生物学活性.方法: 本实验室保存的T-VEGF165质粒,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切,将其克隆至原核表达载体pET28a( )中,获得含人VEGF165全序列基因的表达载体pET28a( )-VEGF165,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,对表达产物进行纯化,获得VEGF165蛋白.通过体外促进HUVEC细胞增殖及鸡胚尿囊膜血管增生实验鉴定其生物学活性.结果:成功构建了VEGF165蛋白的原核表达载体,表达纯化了VEGF165蛋白,经过细胞增殖试验及鸡胚尿囊膜血管增生实验,证明该蛋白具有良好的促进血管内皮细胞增殖的生物学活性.结论:成功地获得了人VEGF165重组蛋白,并证实了该蛋白具有促进血管内皮细胞增殖活性.     

椿皮对鸡胚尿囊膜血管生成的影响

目的:研究收涩中药椿皮对鸡胚尿囊膜血管生成的影响。方法:建立鸡胚绒毛尿囊膜血管模型,观察椿皮含药血清对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的影响。结果:椿皮对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管数目有一定抑制作用。结论:椿皮对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成具有抑制作用。     

颗粒酶B的表达纯化和鉴定

目的：克隆颗粒酶B(GraB)，构建GraB的原核表达载体，从而建立其原核表达体系，获得高效表达的重组GraB。方法：抽提人外周血淋巴细胞总RNA,进行RT-PCR克隆GraB cDNA，构建GraB原核表达载体，用限制性酶切和DNA测序进行鉴定；异丙基-1-硫代-β-呋喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析表达产物。表达产物亲和层析纯化并用免疫印迹法鉴定，以GraB底物测定其活性。结果：表达产物以可溶性分子形式存在于菌体中，具有良好的抗原性和特异性，并能作用于GraB特异性底物。结论：建立了GraB原核表达系统。     

人肝脏再生增强因子cDNA的克隆、表达及纯化

克隆人肝脏再生增强因子（ｈＡＬＲ）ｃＤＲＮＡ,构建重组表达载体并对其诱导表达,纯化。方法：提取胎儿肝组织总ＲＮＡ,利用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增出ｈＡＬＲｃＤＮＡ,克隆于载体ｐＧＥＭ－Ｔ,酶切鉴定后亚克隆至表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－３,测序证实序列正确并转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,ＩＰＴＧ诱导表达融合蛋白ＧＳＴ－ｈＡＬＲ,表达物通过谷胱甘肽Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析纯化后进行Ｔｈｒｏｍｂｉｎ酶切,     

人Era和人Era C端蛋白在大肠杆菌中的高表达

目的 在大肠杆菌中的高表达人Era和人EraC端蛋白。方法 PCR扩增人era基因（h-era)的全长cDNA和h-eraDNA的C端区域基因,h-eracDNA克隆到（His)6融合表达载体pRSET－C中,构建融合表达质粒并转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达（His)6-h-Era融合蛋白;h-eracDNA的C端区域基因克隆到非融合表达载体pDH中P1启动子下游,转化大肠杆菌ATP106,42℃热诱导表达人EraC端蛋白（h-Era-C),SDS-PAGE电泳、凝胶薄层扫描检测蛋白的表达。结果 表达的（His)6-h-Era融合蛋白产物占全工力总蛋白的80％;人EraC端蛋白占全菌总蛋白的40％。结论 人Era蛋白和EraC端蛋白在大肠杆菌中获得了高表达。     

人破骨细胞形成抑制因子成熟肽基因在大肠杆菌中的融合表达

目的:在大肠杆菌中高效融合表达人破骨细胞形成抑制因子(osteoclastogenesis inhibitory factor,OCIF)成熟肽基因.方法:利用PCR从人肝细胞文库中扩增得到OCIF成熟肽编码基因序列,将其与pMD18-T连接,转化大肠杆菌K802,筛选得到阳性重组克隆载体pMD18-OCIFm,双酶切重组克隆质粒pMD18-OCIFm得到OCIF成熟肽基因,将其定向插入pMAL-c2载体中,转化大肠杆菌TB1.筛选得到阳性重组表达子后进行诱导表达.结果:所获得的OCIF成熟肽基因编码序列经测序与GenBank报道的完全一致.所表达的产物经SDS-PAGE分析可见在相对分子质量80000处出现一条特殊条带,与预期的相对分子质量一致.Western印迹证实了表达产物的正确.表达产物在高剂量(＞120ng/L)时可诱导体外培养小鼠成熟破骨细胞的凋亡.结论:成功获得了人OCIF成熟肽基因的克隆并实现了其在大肠杆菌中的融合表达.     

人黑色素瘤抗原MAGE-A10的基因克隆及原核表达

目的:扩增和克隆人黑色素瘤抗原MAGE-A10(melanoma antigen A10)cDNA,构建原核表达载体并在大肠杆菌表达. 方法:从人黑色素瘤细胞系LiBr中提取总RNA,用RT-PCR从中扩增出MAGE-A10 cDNA,插入载体pMD18-T中. 测序正确后,克隆至原核表达载体pGEX-4T-3中,构建重组表达载体pGEX-4T-3-MAGE-A10,转化大肠杆菌BL21株进行表达. 经IPTG诱导表达,谷胱甘肽亲和层析获得重组目的蛋白. 结果:成功获得MAGE-A10编码基因并构建原核表达载体,测序结果与GenBank收录序列相一致. 可以获得部分可溶性的原核重组蛋白,经亲和层析和分析,证实融合蛋白占总量的58.9%. SDS-PAGE分析其相对分子质量(Mr)为67 000,Western blot证实为目的蛋白. 结论:成功获得MAGE-A10 cDNA,构建得原核表达载体并获得高效表达. 本研究为制备MAGE-A10 mAb及研究MAGE-A10可能参与肿瘤发生发展的机制奠定了基础.     

大鼠RGS4基因的克隆及在原核中的表达

目的构建pGEX4T-1-RGS4载体,并检测融合蛋白GST-RSG4在原核中的表达水平。方法采用RT-PCR方法,将克隆SD大鼠G蛋白信号转导调节因子(regulator of G protein signaling4,RGS4)基因全长编码区的cDNA连接到原核表达载体pGEX4T-1中,IPTG诱导原核表达,通过Western blot检测融合蛋白GST-RSG4的表达水平。结果成功构建了pGEX4T-1-RGS4载体;经IPTG的诱导,RGS4可与GST以融合蛋白的形式高效表达。pGEX4T-1-RGS4在原核内表达产物相对分子质量约为50×103,与预期融合蛋白大小一致。结论构建的重组质粒能够在大肠杆菌中高效表达。     

人心肌肌钙蛋白I基因的克隆及其在大肠埃希菌中的表达

目的从人心肌组织中克隆出心肌肌钙蛋白Ⅰ（cardiac troponinⅠ，cTnI）的cDNA。构建成表达重组体导入特定宿主菌，以期大量表达并获得高纯度的心肌肌钙蛋白Ⅰ，为临床检测心肌损伤及预后提供诊断试剂材料。方法利用RT—PCR方法从人心肌细胞的总RNA中克隆出编码人心肌肌钙蛋白Ⅰ的cDNA片段，将其插入原核表达载体形成重组体并导入宿主菌BL21（DE3）中，经异丙基硫代-β-半乳糖苷（IPTG）诱导，表达出带6个组氨酸标签的融合蛋白，Ni-NTA树脂纯化后行Western blot进行鉴定。结果成功获取了人cTnI的cDNA，并在大肠埃希菌中高效表达。经Ni—NTA树脂纯化后获得的产物可与其特异性单克隆抗体反应。结论成功克隆了cTnI基因，构建的重组体能够在大肠埃希菌中高效表达，经纯化可获得电泳单点纯的cTnI蛋白。     

胃癌相关基因GCRG213的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的：利用硫氧还蛋白融合表达系统表达胃癌相关基因GCRG213。方法：采用PCR技术从pGEM-T质粒上扩增出含完整ORF的GCRG213 cDNA序列，将其克隆至硫氧还蛋白融合表达载体pET102／D-TOPO中，转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导表达重组融合蛋白，SDS-PAGE分析表达产物。结果：高效表达出相对分子量约29.4ku的重组融合蛋白。薄层凝胶扫描显示，其表达量占菌体总蛋白质的28.7％。结论：在大肠杆菌中成功表达了Thioredoxin-GCRG213融合蛋白，为后续功能研究、蛋白制备及其抗体研制奠定了基础。     

抗前列腺特异抗原重链可变区单域抗体基因的构建及表达

目的：扩增出抗前列腺特异抗原（PSA）单克隆抗体（MAb)的重链可变区（VH）单域抗体基因,并在大肠杆菌中表达。方法从分泌抗PSAmAb的杂交瘤细胞系E4B7中提取总RNA,经RT－PCR扩增VH单域抗体基因,将其克隆到融合蛋白表达载体pGEX-4T-1中进行表达。结果VH单域抗体基因全长363bp,含起始码和终止码,将其克隆到pGEX-4T-1内,转化大肠杆菌DH5α,获得高效表达,表达量占全菌总蛋白质的38％,以包涵体形式存在,经初步纯化和复性后,用谷胱甘肽（GST）亲和色谱纯化,再经凝血酶水解获得抗PSA VH单域抗体,竞争结合抑制实验证明,该表达产物具有前列腺要和活性。结论构建成功抗PSA的VH单域抗体,为进一步临床应用奠定基础。     

表皮生长因子受体蛋白酪氨酸激酶的表达、纯化及活性测定

目的:采用原核表达体系对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)受体型酪氨酸激酶(recep-tor tyrosine kinase,RTK)进行体外表达、纯化及活性鉴定.方法:以包含EGFR cDNA的pRK5质粒为模板,PCR选择扩增编码EGFR-RTK的cDNA片段,插入pQE30质粒后转染大肠杆菌M15.IPTG诱导表达融合蛋白,包涵体蛋白经复性后亲和层析法纯化,ELISA方法测定蛋白活性.结果:成功地将933 bp的EGFR-RTK cDNA片段插入载体pQE30中,构建了表达载体pQE30-RTK.经诱导在原核表达系统中以包涵体形式高效表达了相对分子质量为37 000的EGFR-RTK融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白的65.2%.复性、纯化后的EGFR-RTK蛋白经ELISA检测,结果发现随着加入蛋白量的增加,酶促反应产物磷酸化酪氨酸的量也逐渐增加,两者具有线性关系.结论:本实验成功地利用原核表达系统表达了具有生物学活性的EGFR-RTK,较传统的昆虫细胞表达系统更为简便、经济.