传代培养后主动脉内皮细胞差异表达基因cDNA序列的动脉粥样硬化相关性分析

目的筛选并分析传代培养后血管内皮细胞上表达下调基因。方法通过菌落原位杂交技术筛选用抑制消减杂交法构建的传代培养前后主动脉内皮细胞差异表达基因消减cDNA文库,用聚合酶链反应(PCR)方法进一步筛选出有插入片段的阳性克隆,将阳性克隆进行DNA测序和同源性比较分析,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法对部分cDNA序列进行初步鉴定。建立兔动脉粥样硬化模型,采用RNA点杂交技术鉴定部分筛选到的cDNA序列的动脉粥样硬化相关性。结果从消减文库中随机挑取的750个白色克隆中筛选出88个阳性克隆,DNA测序获得61个cDNA序列,其中26个为已知牛基因序列,19个与已知人基因具有高度同源性,其他16个是未知基因片段,选择4个已知基因采用RT-PCR验证了基因筛选的可靠性。5个新基因具有动脉粥样硬化相关性。结论用抑制消减杂交法构建的传代培养前后主动脉内皮细胞差异表达基因消减cDNA文库富含动脉粥样硬化相关基因。     

应用抑制消减杂交技术克隆人胰腺癌差异表达基因

目的应用抑制消减杂交技术克隆胰腺癌差异表达基因。方法提取胰腺癌和癌旁正常胰腺组织中的RNA和mRNA并合成双链cDNA,经Rsa1酶切后,将胰腺癌双链cDNA分为2组,分别加上不同的接头,再与正常胰腺组织cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物克隆至T／A载体,并转化大肠杆菌TOPIOF’构建消减cDNA文库。随机挑选有插入片段的阳性克隆进行测序及同源性分析。结果文库扩增后得到251个白色克隆,随机挑取53个白色克隆进行PCR扩增分析,其中50个克隆有插入片段,克隆阳性率为96％。片段大小主要集中在300—600bp之间。对50个有插入片段的阳性克隆进行测序,得到45个可用序列。同源性分析发现44个为已知基因,1个为无任何功能线索的未知基因,可能代表了新基因。结论应用SSH技术成功构建了人胰腺癌抑制消减cDNA文库,并筛选出1条差异表达基因可能为新的胰腺癌相关基因。为进一步研究胰腺癌发生,发展的分子机量提供了新的线索。     

应用抑制性消减杂交技术筛选HBVe抗原结合蛋白1反式激活基因

目的：筛选与克隆HBe抗原(HBeAg)结合蛋白1(HBEBP1)新基因的反式激活基因。了解其可能存在的调节功能线索。方法：应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学技术筛选并克隆HBEBP1反式激活的新型靶基因．以HBEBP1表达质粒pcDNA3．1(-)-HBEBP1转染HepG2细胞。以空载体pcDN3．1(-)为平行对照。制备转染后的细胞裂解液。提取mRNA并逆转录为cDNA。经RasI酶切后。将实验组cDNA分成两组。分别与两种不同的接头衔接。再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR)。将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增。随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析．结果：成功构建人HBEBP1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库．文库扩增后得到85个阳性克隆。进行菌落PCR分析。均得到200～1000bp插入片段。对26个插入片段测序。并通过生物信息学分析获得其全长基因序列。结果共获得14种编码基因。包括13种已知基因和1种未知基因．结论：筛选到的cDNA全长序列。包括一些与细胞生长调节、信号转导、肿瘤免疫发生及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因。推测。HBEBP1可能存在的调控机制的线索。     

二烯丙基二硫诱导人胃癌细胞差异表达基因cDNA文库的建立

目的　建立二烯丙基二硫 (DADS)诱导人胃癌细胞MGC80 3细胞差异表达基因的cDNA文库。方法　采用抑制消减杂交技术 ,筛选DADS处理人胃癌细胞MGC80 3细胞后差异表达的相关基因。经过抑制消减杂交和巢式聚合酶链反应扩增 ,获得富集的差异表达的cDNA文库 ,PCR检测插入片断的阳性克隆。结果　建立DADS诱导人胃癌MGC80 3细胞差异表达基因的cDNA文库 ,并从消减文库中随机挑取的 10 0个白色克隆中筛选个阳性克隆 ,发现插入片断为 10 0～ 6 0 0bp。结论　应用抑制消减杂交方法可有效筛选DADS处理人胃癌细胞MGC80 3细胞后差异表达的相关基因 ,其消减cDNA文库的建立 ,为进一步寻找胃癌发生相关新基因 ,深入揭示DADS对肿瘤细胞的作用机制提供了新的重要线索。     

抑制性消减杂交技术筛选干扰素α转染HepG2细胞中上调的表达基因

目的:应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术筛选干扰素α(IFN-α) 真核表达质粒转染HepG2细胞后差异表达上调的基因。方法:首先构建IFN-α真核表达载体pcDNA3．1(-) -IFN-α,并转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)转染的HepG2细胞为对照;制备转染后的细胞裂解液, 提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制多聚酶链反应(PCR),将产物与T／A载体连接,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增鉴定,进行测序及同源性分析。结果:构建了pcDNA3．1(-)-IFN-α真核表达质粒,并成功构建了该质粒转染HepG2细胞后差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后得到200个白色克隆,随机挑取70个进行菌落PCR分析,结果显示均含有插入片段,将含有200-1000 bp插入片段的35个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得17种已知基因序列和1个染色体序列。结论:应用SSH技术成功构建了pcDNA3．1(-)-IFN-α转染的HepG2细胞中差异上调表达基因的cDNA消减文库。该文库的建立为进一步阐明IFN-α作用的分子生物学机制提供了重要的理论依据。     

人参植物皂苷生物合成相关新基因的筛选与鉴定

为从人参根中分离出人参皂苷生物合成相关基因，采用抑制差减杂交技术，构建4年和1年生人参根组织mRNA群体间正向差减cDNA文库。对从差减文库中筛选的40个阳性cDNA克隆进行酶切、PCR与逆向Northern斑点杂交鉴定、DNA测序以及核苷酸序列同源性比较。     

利用抑制消减杂交技术研究一氧化碳对小鼠小脑基因表达的影响

目的　筛选 2 5mmol·L- 1一氧化碳小鼠吸入染毒 72h后 ,小鼠小脑中的差异表达基因。方法6 0只成年雄性昆明种小鼠随机分为对照组和染毒组 ,30只 /组。由Qiagen公司mRNAMiniKit直接提取小脑组织的mRNA ,PCR SelectTM cDNASubtractionKit构建消减文库 ,GenBank分析差异表达基因。结果　实验中共得到 2 0个阳性克隆 ,抽提重组质粒后测序 ,除去 3条重复的克隆片段 ,获得了 17个表达序列标签。其中 ,16条序列同源分数较高 ,是已知序列或与已知的表达序列标签有部分重叠的。 1条(T15 )同源分数较低。结论　抑制消减杂交是一种优良的寻找新基因的方法。一氧化碳主要影响的差异表达基因的类别包括细胞间通讯的基因差异表达、线粒体看家基因异常表达、胎盘组织蛋白酶J基因异常表达等     

重组β-干扰素上调HepG2细胞表达基因抑制性消减杂交技术筛选

目的利用抑制性消减杂交技术筛选重组β-干扰素（IFN-β）上调HepG2细胞表达基因。方法以重组IFN-β 2 000 U·mL^-1刺激对数生长期HepG2细胞，设经0.9%氯化钠注射液作用的HepG2细胞为阴性对照组；制备HepG2细胞裂解液，从中提取mRNA并逆转录合成cDNA，经RsaⅠ酶切后，将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与阴性对照组cDNA进行两次消减杂交和两次抑制性聚合酶链反应(PCR)，将产物与T/A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠埃希菌进行基因文库扩增，随机挑选克隆PCR后进行测序及同源性分析。结果成功构建了重组IFN-β作用HepG2后差异表达的cDNA消减文库。扩增后得到50个200～1 000 bp插入片段的克隆，随机挑选其中31个插入片段测序，通过生物信息学分析获得其全长基因序列，共获得20种编码基因，其中1种为未知功能的新基因。结论通过该方法可筛选得到IFN β作用于HepG2细胞后上调表达的部分基因，包括与细胞生长调节、物质代谢和细胞凋亡密切相关的一些蛋白编码基因。     

小鼠短指/缺指畸形肢体cDNA消减文库的构建

目的　为筛选、克隆小鼠短指 /缺指畸形肢体的特异表达基因 ,构建了GD18小鼠畸形肢体 (短指 /缺指 )与正常肢体的差异表达的cDNA消减文库。方法　应用抑制消减杂交技术 (SSH ) ,结合PCRcDNA合成法 ,将从总RNA中合成的双链cDNA ,酶切成平均大小为 4 0 0～ 6 0 0bp的片段 ,经接头连接 ,两次消减杂交和两次抑制性PCR后 ,将产物与T/A载体连接构建cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 ,菌液PCR筛选有插入片段的SSH克隆。结果　成功地构建了GD18小鼠畸形肢体(短指 /缺指 )差异表达的cDNA消减文库 ,从中挑取2 75个克隆进行菌液PCR分析 ,结果显示其中 2 5 5均得到 2 0 0～ 6 0 0bp插入片段。结论　SSH与PCR合成双链cDNA ,是一种自微量总RNA中构建高特异性的差异表达cDNA消减文库的有效方法。消减文库的构建 ,有助于筛选、克隆小鼠短指 /缺指畸形肢体的特异表达基因     

食管癌患者手术前后免疫相关差异表达基因的筛选

目的采用抑制消减杂交技术，分析食管癌手术前后免疫相关的基因表达差异，了解手术治疗对食管癌患者免疫功能的影响。方法选5例食管肿瘤患者，在手术治疗前和结束时每例患者分别取10ml外周静脉血，样本采集后马上进行外周血单个核细胞（PMBC）分离及提取RNA。分为2组，手术前组和手术后组。每组5个人的RNA混合后做cDNA合成。治疗后组和治疗前组进行正向比较，cDNA经两轮杂交与PCR扩增后T／A克隆构建文库，并对克隆进行PCR扩增，选取部分阳性克隆测序，与GenBank同源比较，分析其生物学意义。结果用SSH法建立食管癌手术前后免疫相关的差异表达基因的cDNA文库，通过筛选，发现在食管癌手术后，含有与免疫相关的基因，如IL-2、化学趋化因子受体4等表达较前增强，提示食管癌手术改善患者的免疫功能。另外还发现肿瘤相关基因CHES1表达较前增强，另外还发现了3个未知序列。结论成功通过SSH建立了食管癌手术前后免疫相关的差异表达基因的消减文库，核酸序列分析结果表明其中部分基因为与炎症相关的基因，部分基因与癌症形成相关，还发现了一些未知序列。     

体外凝集性生长状态下毛乳头细胞特异表达基因分析

目的克隆并分析毛乳头细胞凝集性生长状态下差异表达基因。方法应用抑制性消减杂交技术构建毛乳头细胞在凝集性生长状态下特异表达基因的消减cDNA文库,通过PCR、eDNA斑点杂交技术筛选和验证差异表达基因,并通过同源性检索对其进行分析。结果体外凝集性生长状态下的毛乳头细胞可以特异表达与细胞同源凝集、生长调控、分化发育及信号转导相关的基因,包括已知基因（如加帽蛋白、palladin,VEGF基因）、造血干细胞分化相关基因（HSPC011、HSPC016基因）及1段新基因。这些基因多是首次发现在毛乳头／毛囊中有表达。结论多种基因可能协同作用参与毛乳头细胞的凝集生长、增殖和细胞周期调控。在这些基因产物中,加帽蛋白和palladin可能与凝集生长相关,VEGF和HSPC可能与毛乳头细胞的增殖和分化相关。     

核因子-κB p50亚基同源结构域相互作用多肽的筛选

目的应用酵母双杂交技术筛选获得与NF-kB p50亚基同源结构域(RHD)相互作用的多肽。方法应用酵母双杂交技术,以NF-kB p50 RHD为诱饵,筛选16肽cDNA文库,寻找与其相互作用的多肽,应用β-GAL实验、酵母交配实验及一对一酵母回复性杂交等方法筛除假阳性克隆,确定阳性克隆。结果经酵母双杂交及反复的排查,共获得8个阳性克隆。通过GenBank进行搜寻,未发现与之相匹配的蛋白序列。结论获得8个与NF-kB p50 RHD相互作用的新型多肽cDNA,多肽的功能需进一步验证。     

Differential gene expression detected by suppression subtractive hybridization in the ethylene glycol monomethyl ether-induced testicular lesion.

The solvent ethylene glycol monomethyl ether (EGME) produces the same testicular lesions in rodents and human testis cultures, whose onset is characterized by apoptosis of pachytene spermatocytes. To identify gene changes early in the lesion and determine the possible involvement of cells other than the spermatocytes, we employed a suppression subtractive hybridization technique using whole testes from mice treated 8 h previously with 500 mg/kg EGME to generate two subtracted mouse testis cDNA libraries enriched for gene populations either up-regulated or down-regulated by EGME. A total of 70 clones were screened, and 6 of them were shown by Northern blotting to be differentially expressed in the EGME lesion. The three clones with increased expression after EGME treatment were identical to t-complex testis expressed gene 1 (tctex1), a gene encoding ribosomal protein S25, and a heretofore uncharacterized mouse testis expressed sequence tag. Three other genes suppressed by EGME were tctex2, alpha-2,6-sialyltransferase gene, and another uncharacterized mouse testis expressed sequence tag. Predicted peptide sequences of these clones contain multiple motifs for phosphorylation, glycosylation, and myristoylation. In situ hybridization with the antisense RNA probes further supported the expression changes of these six clones and localized the changes in multiple germ cell stages as well as other cell types (Sertoli, interstitial and peritubular cells). These data at the gene expression level are the first to demonstrate the early involvement in this lesion of cell types other than the dying spermatocytes.     

Sensitization to the conditioned rewarding effects of morphine modulates gene expression in rat hippocampus

Opiates addiction is characterized by its long-term persistence. In order to study the enduring changes in long-term memory in hippocampus, a pivotal region for this process, we used suppression subtractive hybridization to compare hippocampal gene expression in morphine and saline-treated rats. Animals were subjected to an extended place preference paradigm consisting of four conditioning phases. Sensitization to the reinforcing effects of the drug occurred after three conditioning phases. After 25 days of treatment rats were euthanized and the complementary DNA (cDNA) from the hippocampus of morphine-dependent and saline-treated animals were then screened for differentially expressed cDNAs. The selected 177 clones were then subjected to a microarray procedure and 20 clones were found differentially regulated. The pattern of regulated genes suggests impairments in neurotransmitter release and the activation of neuroprotective pathways.     

黄芪甲苷合成差异基因克隆和鉴定

黄芪甲苷(AstragalosideIV,ASI)是黄芪中的有效成分之一,具有抗炎,改善心肌,脑缺血,促淋巴细胞繁殖,促抗体生成等作用。但由于其在黄芪中含量低,以及缺乏必要的化学合成中间体,限制了其临床药用,通过基因工程方法提高其表达量将有助于其应用。本文应用了差减杂交方法(SSH)结合斑点杂交,从黄芪甲苷合成差异株系中分离鉴定了19个黄芪甲苷合成差异基因片断,其中7个具有同源序列,同源性约80%以上,而另外12个未发现同源序列,推测可能是新基因片断或者是全长cDNA的3’末端序列。     

具有自激活切割活性肠激酶轻链基因设计、表达及活性研究

目的获得Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列+牛EKL的cDNA序列,实现EKL基因在大肠杆菌中的融合表达和自切割。方法用Trizol法从牛十二指肠组织中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增其cDNA片段,将此片段克隆于表达载体pGEX-2T,并在其前引入肠激酶(EK)识别序列。结果所表达蛋白经SDS-PAGE分析,相对分子质量约为61 000,经GST-Sepharose亲和色谱柱纯化后得到单一蛋白,SDS-PAGE显示单一条带,用微量EK引发自切割,切断GST标签蛋白和Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列,采用对氨基苯甲脒-Sepharose亲和色谱获得了轻链EK的单体。结论成功地克隆、表达了牛EK轻链基因,采用自激活、切割获得了EK单体,每1 L培养基获得EK5 mg,为进一步进行重组牛EK活性的研究及应用奠定了基础。