霜天蛾昆虫变应原的变应原性及免疫原性分析

目的 分析霜天蛾主要变应原的变应原性和免疫原性,为进一步制备霜天蛾标准化变应原疫苗和基因工程重组霜天蛾昆虫变应原奠定基础.方法 应用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳对霜天蛾变应原蛋白成分进行分离,对9例霜天蛾过敏患者血清分别进行IgE、IgG免疫印记分析,并对比分析IgE、IgG反应变应原成分.结果 霜天蛾提取液经SDS-PAGE染色后显示出20余种蛋白质成分,相对分子质量12 000～128 000.免疫印迹分析结果显示具有变应原性的蛋白相对分子质量及反应率分别为:74 000(88.9%),66 000(22.2%),49 000(22.2%),36 000(77.8%),25 000(33.3%),具有免疫原性的蛋白相对分子质量及反应率分别为:79 000(33.3%),74 000(66.7%),66 000(22.2%),49 000(22.2%),36 000(44.4%),25 000(55.6%).结论 霜天蛾变应原中具有较强变应原活性的蛋白质相对分子质量为74000和36000,具有较强免疫原活性的蛋白质相对分子质量为74 000和25 000的蛋白质,是霜天蛾过敏患者特异性过敏诊断和治疗的主要成分.     

美洲大蠊若虫变应原的基因克隆及序列测定

目的　对美洲大蠊若虫cDNA表达文库进行免疫学筛选 ,分离和鉴定美洲大蠊若虫特异性重组变应原克隆 ,并测定其基因序列 ,从而为美洲大蠊若虫重组变应原疫苗候选基因的筛选提供科学依据。方法　选用对美洲大蠊若虫过敏的变态反应疾病患者 (如哮喘、过敏性鼻炎 )阳性血清 ,对美洲大蠊若虫cDNA文库进行免疫学筛选。使用按照重组载体入ExCellNotI/EcoRI/CIP臂插入位点邻近区域的上、下游碱基序列设计的引物 ,扩增阳性噬菌斑中插入的cDNA片段。并对cDNA插入片段进行序列测定。结果　经用阳性血清对 2 3× 10 4 噬菌体斑的免疫学筛选 ,获得了 5个阳性克隆 ,PCR直接序列分析表明这 5个阳性克隆均为美洲大蠊若虫变应原未知基因克隆。结论　该研究发现了美洲大蠊若虫变应原新基因 ,为进一步开展美洲大蠊若虫特异性重组变应原的研究奠定了基础     

樟树花粉泛变应原基因的克隆与序列分析

目的从樟树花粉中克隆泛变应原基因。方法通过对多个植物泛变应原基因进行序列同源性比对,根据保守区域序列设计简并性引物,利用RT-PCR结合RACE技术对樟树花粉中的泛变应原基因进行克隆。结果从樟树花粉中克隆到一个新的基因。序列分析显示:所克隆到的基因与其它植物的泛变应原肌动蛋白结合蛋白基因有很高的同源性,因此认为该基因为泛致敏原基因,命名为Cinc1。其在GenBank数据库中的登录号为DQ335252。结论采用简并引物从樟树花粉中克隆到一泛变应原基因,为进一步研究该变应原奠定了理论基础。     

荔枝果实中泛变应原profilin基因的克隆及序列分析

目的克隆荔枝果实中泛变应原肌动蛋白抑制蛋白(profilin)同源基因。方法采用生物信息学方法对多个植物泛变应原基因进行序列同源性比对,根据序列保守区域设计并合成简并性引物,通过RT-PCR和3'-RACE技术克隆荔枝果实中泛变应原profilin的全长基因,并进行序列分析。结果获得了一个全长的新基因(689bp)。该基因开放阅读框为396个碱基,编码131个氨基酸残基,经分析该蛋白等电点为4.98,分子量约为14060。此序列已被GenBank收录,登陆号为DQ309464。序列分析结果显示所克隆到的基因与许多水果和花粉的泛变应原profilin基因有很高的同源性(与桦树和橡胶花粉泛变应原profilin的同源性分别为80%和84%,与桃子profilin的同源性为85%),因此认定其为泛变应原基因。结论从荔枝果实中成功地克隆出了一个泛变应原基因,为进一步的蛋白表达奠定了基础。     

屋尘螨和粉尘螨主要变应原的筛选和分析

目的研究尘螨主要变应原组分及性质。方法用SDS—PAGE、Western印迹和LC—MS／MS方法,对屋尘螨和粉尘螨的主要变应原组分进行筛选、分析和鉴定。结果两种尘螨的三个样本均有数条在蛋白大小和含量方面较为独特的条带,其中屋尘螨和粉尘螨抗原间蛋白质构成差别较大,两个粉尘螨样本间蛋白带差别较小。屋尘螨主要变应原大小约为12～15kDa和94～98kDa;粉尘螨主要变应原大小约为49～53kDa和94～98kDa,但其中一粉尘螨样本在49～53kDa和94～98kDa位置却未出现反应带。用LC—MS／MS方法从主要变应原条带中鉴定出屋尘螨变应原蛋白约64个,粉尘螨变应原蛋白约84个。它们包括一些已知的尘螨变应原、酶类、translation elongation factor、ribosomal protein、外膜（脂）蛋白、Keratin、Glycine cleavage systemprotein、binding protein、Heatshock protein、regulation protein、hypothetical protein、polpolypmtein和pol protein等蛋白质类别。结论屋尘螨和粉尘螨主要变应原构成及其免疫学反应强度均存在一定区别。针对中国人的尘螨主要变应原可能包括Derp2、Derp14、Dert3,Derf15和Derf17等,上述鉴定的其它蛋白质的一些也可能是潜在的变应原。     

二球悬铃木花粉主要变应原蛋白编码基因克隆的制备

目的:构建含二球悬铃木花粉主要变应原蛋白编码基因的重组质粒。方法:用PCR扩增二球悬铃木花粉主要变应原编码基因的cDNA序列,将扩增的目的片段用双酶切法与质粒pET32a连接,CaCl2法转入工程菌DH5α制备基因克隆。碱裂解法提取质粒DNA,测序鉴定目的片段存在。结果:构建了含二球悬铃木花粉主要变应原编码基因的重组质粒。结论:用天然二球悬铃木花粉可成功地制备含有其主要变应原编码基因的重组质粒,用于变应原蛋白诱导表达。     

当归肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

目的 对当归肌动蛋白（Actin）基因进行克隆及序列分析。方法 根据已经克隆的植物Actin基因的保守序列设计一对简并性引物,以当归根部总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增Actin基因片段并连接到pMD19-T载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序。结果 得到一段598 bp的序列,序列分析表明,该片段编码198个氨基酸,与高等植物Actin基因核苷酸序列同源性在83%以上,与其他肌动蛋白氨基酸序列同源性达94%以上。结论 首次从当归中克隆出了Actin基因,为有效利用该基因奠定了基础。     

桑黄肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

目的 对桑黄肌动蛋白（Actin）基因进行克隆及序列分析。方法 搜索网上已知数据库中Actin基因,与本实验室测得的桑黄转录组数据进行生物信息学比对,找到转录组数据中与Actin相似性最高的片段,并根据其设计引物,提取桑黄菌丝体总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增Actin基因片段并对PCR产物进行测序。结果 得到一段839 bp的序列,序列分析表明,该片段编码279个氨基酸,与其他物种Actin基因核苷酸序列同源性在87%以上。结论 首次从桑黄中克隆出了Actin基因,为有效利用该基因奠定了基础。     

党参肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

目的 对党参肌动蛋白（actin）基因进行克隆及序列分析。方法 根据已经克隆的植物actin基因的保守序列设计一对简并性引物,以党参根部总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增actin 基因片段并连接到pMD19-T Simple载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序。结果 得到一段603 bp的序列,序列分析表明,该片段编码200个氨基酸,与高等植物actin基因核苷酸序列同源性在78%以上,与其他肌动蛋白氨基酸序列同源性达90%以上。结论 首次从党参中克隆出了actin基因,为有效利用该基因奠定了基础。     

美洲大蠊主要变应原Cr-PI基因同源性分析

目的 探索研制美洲大蠊重组变应原疫苗的新途径，对美洲大蠊主要变应原Cr-PI基因序列进行同源性分析。方法 选用从本室构建的美洲大蠊若虫cDNA库中筛选到的5个阳性克隆，在测序的基础上，通过互联网进入NCBI主页，采用Blastn程序，将测得的美洲大蠊主要变应原基因序列与GenBank中的基因序列进行同源性分析。结果 所筛选到的美洲大蠊若虫5个新基因中，一个为核糖体蛋白基因（AF314962），一个为美洲大蠊主要变应原Cr-PI基因（AF314963），且中国大陆美洲大蠊主要变应原Cr-PI基因序列与不同地理分布的美洲大蠊Cr-PI基因序列有一定差异。结论 不同地理区域的美洲大蠊同一种变应原其基因序列有一定差异，编码的美洲大蠊Cr-PI相同。本研究提示在临床变态反应疾病的诊断和脱敏治疗中，为了提高其诊断的特异性和治疗疗效，应尽可能使用具有我国区域特色（即本地化）的变应原。     

烟草MAR的克隆及序列分析

目的克隆烟草核基质结合区（matrix attachment region,MAR）序列。方法根据MAR序列特征设计2对富含A/T引物,以提取的烟草基因组DNA为模板进行PCR扩增,经琼脂糖凝胶电泳鉴定后与T-载体连接,测序并进行序列分析。结果PCR扩增出三条DNA带,将其命名为TM1、TM2和TM3。与GenBank中注册的MAR进行序列同源性比较,结果显示TM1与Rb7之间DNA同源性高达99%。结论序列分析表明,三段DNA均具备MAR序列特征,其中TM2和TM3是两个新的MAR。     

HIV-1基因限制性显示片段的克隆与序列分析

目的　克隆并分析经限制性显示－聚合酶链反应（ＲＤ－ＰＣＲ）扩增的ＨＩＶ－１基因片段。方法　将所有ＨＩＶ－１基因片段 分成１０组并进行ＲＤ－ＰＣＲ扩增,纯化各组ＰＣＲ产物后将之克隆至Ｔ载体上并快速鉴定。从阳性克隆中提取质粒,扩 增靶片段并测序。结果　序列分析表明,所扩增的片段均属于ＨＩＶ基因。结论　改良了一种多片段的克隆及鉴定方法并 用于限制性显示扩增片段的克隆。     

人乳头瘤病毒11型主要衣壳蛋白L1基因的克隆及序列分析

目的 从临床尖锐湿疣标本克隆人乳头瘤病毒（HPV）11型主要衣壳蛋白L1基因,进行序列测定及序列分析比较,以为研究该临床病毒株的免疫原性及流赞美同学奠定基础。方法 以临床尖锐湿疣标本总DNA为模板,用L1基因保守区简并引物以PCR方法分段扩增衣壳蛋白L1基因在部,重组入pGEM-3zf(-)质粒载体,以双脱氧法双向测定插入片段序列,拼接出L1基因序列,通过BLAST2.0与已报道序列进行比较。结果 从西安地区一尖锐湿疣临床标本克隆到的一株HPV11型L1蛋白编码序列与一文献报道大部分相同,但有些位点有点突变,结论 构建的pGEM-3zf(-)重组质粒为进一步通过杂交、体内分段表达等手段研究研究该株病毒L1蛋白的免疫学和流行病学性质创造了条件。     

人尿酸转运蛋白基因的克隆与序列分析

目的 获得编码人尿酸转运蛋白(humanuricacidtransporter,hUAT)的全长基因。方法 从人肾小管上皮细胞株(HK-2)中提取总RNA,根据Genbank中hUAT基因序列设计特异性引物,然后通过RT-PCR法扩增目的片段。所得目的片段酶切后与载体pEGFP-C1连接,经酶切及序列分析鉴定。结果 成功扩增出980 bp的hUAT全长基因,克隆到pEGFP-C1载体后酶切分析结果与预期一致,序列分析结果与Genbank上公布的hUAT序列完全一致。结论 成功克隆出hUAT基因,序列分析结果完全正确,为对该基因进一步研究奠定了基础。     

抗人树突状细胞单克隆抗体可变区基因克隆和序列分析

目的:为了将抗树突状细胞(dendritic cells,DC)抗体应用于临床疾病治疗,计划克隆获得抗人DC单克隆抗体(McAb)的可变区序列,在此基础上进一步获得人源化的抗人DC抗体.方法:运用RT-PCR技术,从分泌抗人DC McAb的杂交瘤细胞株(H1E11)中,克隆出VH和VL基因片段,并对VH和VL进行了测序分析.所测得的重链和轻链在基因库中与相关的Ig的VH和VL基因序列进行经Blast同源性比较.结果:通过碱基和蛋白序列的比较确认为小鼠IgG的VH和VL基因.运用Dnasis软件对VH和VL基因进行阅读框分析和模拟翻译,并参照Kabat等人(1991)编写的Ig蛋白质编码序列图谱,根据其FRs和CDRs的序列特征进行Ig的家族分析,发现VH共有414 bp,编码138个氨基酸序列,属于小鼠IgG重链Ⅲ(A)家族;VL由396 bp编码,产生132氨基酸,属于轻链κV家族.结论:成功克隆抗人DC McAb重链和轻链的可变区.     

蚊防御素基因的克隆及序列分析

目的克隆我国重要蚊媒的防御素基因并对其序列进行分析。方法分别提取埃及伊蚊、白纹伊蚊、致乏库蚊、中华按蚊的基因组DNA和总RNA。根据国外已发表的防御素基因序列设计、合成引物,进行PCR和RT-PCR。结果分别从埃及伊蚊、白纹伊蚊、中华按蚊基因组DNA中扩增出预期片段,将片段切胶纯化后进行序列分析并与已发表的防御素基因比较,显示埃及伊蚊和白纹伊蚊的扩增片段与已发表的防御素基因序列有很高的同源性,而中华按蚊的扩增片段则与已发表的防御素基因序列的同源性较低,且不具备特征性的6 个半胱氨酸序列。结论克隆出埃及伊蚊和白纹伊蚊的防御素基因,蚊虫防御素基因的同源性高低与其遗传分类距离有一定的平行关系。     

新城疫病毒V4株NP基因的克隆及测序

目的 研究新城疫病毒（NDV）核衣壳蛋白（NP）基因的生物学作用及其抗人喉鳞癌的作用。方法 以提纯的NDV V4株基因组RNA为模板,化学合成NP基因的特异核苷酸引物,RT－PCR扩增NP基因cDNA,得到1条1.5kb的DNA带,与DNAVP基因大小一致,平端连接克隆到pUC119质粒中,结果 阳性克隆经酶切鉴定及序列分析表明已获得NDV V4株NP基因克隆。结论 将NDV V4株NP基因碱基序列与已发表的NDV Beaudette C株、La Sota株、D26株的NP基因的碱基序列比较,同源性分别为90.64%、90.17%、98.03%,氨基序列差异率是4.50%、5.93%、2.45%。NDV V4株NP基因与已发表的NDV Beaudette C株、La Sota株、D26株的NP基因有所不同,但具有高度同源性。     

人源性肝细胞生长刺激因子cDNA克隆和序列分析

目的 :阐明人源性肝细胞生长因子 (HDSSF)的本质 ,为进一步基因克隆奠定基础。方法 :以简并PCR扩增获取目的基因片断 ;杂交筛选人胎肝cDNA文库 ;末段终止法进行HDSSF核苷酸序列分析。结果 :简并PCR扩增出接近HDSSF分子量 6 0 0bp片断 ;人胎肝cDNA文库经初筛和复筛获得含有目的基因的单克隆噬斑 ;测定了HDSSF基因序列 ,其cDNA链为 74 8bp ,含有 5 94bp的完整开放读码框架和 5′及 3′末端非编码区序列。序列分析显示HDSSF应为一含有 1 98个氨基酸残基的新的促肝细胞生长物质。结论 :本研究成功获得目的基因HDSSF克隆 ,人HDSSF克隆成功为开展人源性HDSSF的重组产品研制奠定了基础     

结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因的克隆与序列分析

目的：克隆结核分枝杆菌减毒株H37Ra培养滤液蛋白10（CFP10）基因,并对其进行序列分析。方法：自结核菌H37Ra株抽提基因组DNA为模板,以已知结核菌H37Ra株CFPIO基因设计引物。通过聚合酶链反应（PCR）技术扩增出结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因,将其克隆至pTG19-T载体后,经PCR和双酶切鉴定后进行DNA序列测定,并以BLAST在线软件进行序列比对分析。结果：PCR产物电泳显示扩增片段约为300bp,测序获得的片段开放编码框由303bp组成,与H37Rv株CFP10基因同源性为100％,推导出编码氨基酸序列同源性为100％。结论：成功克隆结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因,其基因序列与H37Rv株CFPIO基因序列无差异。