蛋白酶体抑制剂对肾间质成纤维细胞凋亡和增殖的影响

目的:探讨泛素蛋白酶体抑制剂MG-132对大鼠肾间质成纤维细胞(NRK-49F)及其在转化生长因子β1(TGF-β1)诱导下的细胞凋亡和增殖情况,并初步探索其机制。方法:采用5ng/ml的TGF-β1作用于NRK-49F,不同浓度(0~5μM)的蛋白酶体抑制剂MG-132预处理NRK-49F细胞,应用MTT法检测其增殖情况,LDH法检测细胞毒性,应用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡率,Hoechst 33258染色观察细胞凋亡形态学变化,Western blot检测p-IκB,IκB蛋白的变化。结果:TGF-β1(5ng/ml)能促进NRK-49F的增殖(0.661±0.04vs0.495±0.06),MG-132(0.25~5μM)呈剂量依赖型抑制这种效应;MG-132(0.1~5μM)对NRK-49F有一定的细胞毒性作用,在0.5μM时达高峰;TGF-β1单独不能促使NRK-49F的凋亡[(3.8±0.4)%vs(4.7±1.6)%],但加用MG-132(0.1~2.5μM)干预后呈剂量依赖关系促进细胞凋亡,MG-132单独也有促进细胞凋亡作用;MG-132(0~1μM)作用于TGF-β1诱导的NRK-49F后,其S期比例呈剂量依赖关系显著减少,G1期细胞比例增加;Hoechst 33258染色显示MG-132(0.5μM) TGF-β1组及MG-132组细胞核均出现核固缩、核碎裂、凋亡小体等凋亡特异形态学改变;Western blot结果显示,TGF-β1及MG-132(2.5μM) TGF-β1均能以时间依赖方式诱导p-IκB、IκB蛋白表达增加,且MG-132能上调TGF-β1诱导下的p-IκB,IκB蛋白表达。结论:泛素蛋白酶体抑制剂MG-132对正常及病理状态下的NRK-49F都有促凋亡作用,并可能通过G1期阻滞过程来抑制其增殖作用。其机制可能与MG-132阻断IκB蛋白的泛素化降解有关。     

过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂对TGF-β1诱导肾成纤维细胞细胞外基质表达的影响

目的:研究过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)激动剂对转化生长因子β1(TGF-β1)致肾间质纤维化作用的影响,探讨其抗肾间质纤维化的潜在作用.方法:体外培养大鼠肾成纤维细胞株(NRK/49F),利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)观察PPARγ配体15d-PGJ2及其激动剂曲格列酮和齐格列酮对TGF-β1诱导的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、结缔组织生长因子(CTGF)、纤维连结蛋白(FN)和Ⅲ型胶原(ColⅢ)mRNA表达的影响,利用Western Blot方法观察PPARγ激动剂对TGF-β1诱导的FN蛋白表达的影响.结果:TGF-β1能显著增加NRK/49F细胞CTGF、FN和ColⅢmRNA表达,并呈剂量依赖和时间依赖效应.与TGF-β1刺激组相比,10 μM 15d-PGJ2、曲格列酮和齐格列酮预处理组α-SMA、CTGF、FN和ColⅢmRNA表达量显著减少,FN蛋白表达量显著下降.结论:PPARγ激动剂可抑制TGF-β1诱导的肾间质成纤维细胞CTGF表达和细胞外基质(ECM)合成.     

MMPs／TIMPs、TGF—β1细胞外基质与糖尿病肾病

转化生长因子β1可刺激系膜细胞外基质(ECM)蛋白的合成，抑制基质金属蛋白酶的酶解活性，并增加其抑制剂组织型金属蛋白酶抑制剂的活性，从而促进ECM的沉积，在糖尿病肾病的发生发展中具有重要作用。     

过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂对TGF-β1诱导肾成纤维细胞细胞外基质表达的影响水

目的：研究过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）激动剂对转化生长因子β1（TGF-β1）致肾间质纤维化作用的影响，探讨其抗肾间质纤维化的潜在作用。方法：体外培养大鼠肾成纤维细胞株（NRK／49F），利用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）观察PPARγ配体15d-PGJ2及其激动剂曲格列酮和齐格列酮对TGF-β1诱导的α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、结缔组织生长因子（CTGF）、纤维连结蛋白（FN）和Ⅲ型胶原（ColⅢ）mRNA表达的影响，利用Western Blot方法观察PPARγ激动剂对TGF-β1诱导的FN蛋白表达的影响。结果：TGF-β1能显著增加NRK／49F细胞CTGF、FN和ColⅢmRNA表达，并呈剂量依赖和时间依赖效应。与TGF-β1刺激组相比，10μM 15d-PGJ2、曲格列酮和齐格列酮预处理组叶SMA、CTGF、FN和ColⅢmRNA表达量显著减少，FN蛋白表达量显著下降。结论：PPA脚激动剂可抑制TGF-β1，诱导的肾间质成纤维细胞CTGF表达和细胞外基质（ECM）合成。     

肝素对糖尿病大鼠肾小球转化生长因子β1及细胞外基质表达的影响

糖尿病性肾小球硬化的实质是肾小球细胞外基质(ECM)的过度聚积。转化生长因子 β(TGF- β)对 ECM代谢起着重要的调节作用。有研究表明 ,肝素能抑制 ECM的生成 [1 ] 。为此我们运用免疫组化方法观察了糖尿病大鼠肾小球两种 ECM成分 ,层粘蛋白 (L N)、纤连蛋白 (FN )的表达与TGF- β1的关系 ,以及肝素对其表达的调控 ,以进一步了解糖尿病肾病的发生机制及肝素是否对糖尿病肾病具有一定的防治作用。一、对象和方法1.对象 :2月龄 Wistar雄性大鼠 (同济医学院实验动物中心提供 ) 30只 ,体重 15 0～ 2 0 0 g,随机分为正常对照组、糖尿病…     

大黄酸抑制TGF—β1诱导的肾小管上皮细胞肥大及细胞外基质产生

目的观察大黄酸对TGF-β1诱导的近端肾小管上皮细胞细胞肥大及细胞外基质(ECM)的影响。方法在体外以TGF-β1（2μg／L）刺激LLC-PK1细胞,诱导细胞肥大和ECM合成增加。与此同时,以不同浓度的大黄酸处理细胞,检测细胞体积,蛋白质含量以及3H-亮氨酸掺入以观察细胞肥大的变化;检测细胞孵育24h后上清的纤维连接蛋白(FN)含量,3H-脯氨酸掺入以及细胞胶原Ⅳ及FNmRNA的表达以观察大黄酸对ECM的影响。结果TGF-β1（2μg／L）刺激可以导致LLC-PK1细胞出现细胞肥大,表现为细胞体积,细胞内蛋白量及3H-亮氨酸掺入量明显增加。大黄酸处理后细胞体积及细胞内蛋白量明显降低。TGF-β1也明显增加LLC-PK1细胞3H-脯氨酸掺入量、培养上清中FN含量、以及细胞内胶原Ⅳ和FNmRNA的表达。大黄酸则抑制上述ECM合成的增加,明显降低细胞内胶原Ⅳ,FNmRNA表达水平。结论大黄酸可以逆转TGF-β1诱导的近端肾小管上皮细胞肥大,抑制TGF-β1刺激的ECM合成。这可能是大黄酸预防或改善糖尿病肾脏病变,延缓糖尿病肾病进展的作用机制之一。     

Ciglitazone抑制人肝星状细胞外基质蛋白表达的分子机制

目的探讨过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARγ）配体是否通过阻断肝星状细胞的TGF β1型受体（TGF βR1）信号途径，阻止Smad3磷酸化而抑制纤溶酶原激活物抑制剂1（PAI-1）、胶原蛋白1αI的表达，发挥其抗纤维化的作用。方法用促进脂肪细胞分化的培养液预处理人肝星状细胞LX-2，使其呈现脂肪细胞的某些表型，从活化状态转为静止型，分别加用TGF β1或TGF β1加TGF βR1激酶抑制剂SB431542或TGF β1加PPAR γ配体Ciglitazone处理LX-2细胞。分别用荧光实时定量PCR、Western blot、荧光素酶分析的方法检测PPAR γ配体对LX-2细胞用TGF β1诱导前后Smad3磷酸化水平、PAI-1的mRNA与蛋白表达水平和PAI-1启动子活性、胶原蛋白1αI mRNA表达水平的影响。结果诱导脂肪细胞分化的培养液可使LX-2细胞出现脂质沉积与静止型肝星状细胞的标志物之一PPAR γ表达的增加。TGFD1以剂量和时间依赖的方式增加细胞外基质蛋白的表达，胶原蛋白1aI和PAI-1 mRNA的表达在3h内增加3倍，PAI-1蛋白的表达在6h内增加8倍。TGF β1诱导的Smad3磷酸化导致胶原蛋白1aI和PAI-1表达增加。PPARγ配体Ciglitazone与TGF βR1激酶抑制剂SB431542，均以剂量依赖的方式阻断TGF β1的上述作用，10μmol／L SB431542、10μmol／L的Ciglitazone可以阻断TGF β1诱导的Smad3磷酸化、胶原蛋白1αI mRNA、PAI-1 mRNA和蛋白的表达。结论PPAR γ配体Ciglitazone抗纤维化作用可能与其对TGF β1-TGF βR1信号传导、Smad3磷酸化的阻断作用有关，进而抑制胶原蛋白1αI和PAI-1的表达。     

成纤维细胞生长因子受体在肾间质成纤维细胞的表达

在肾小管间质纤维化的发生发展过程中，损伤和再生的肾小管上皮细胞可以合成和分泌多种细胞因子和生长因子，成纤维细胞生长因子（ＦＧＦ）就是其中的一种。研究ＦＧＦ的靶细胞或细胞受体（ＦＧＦＲ），对于揭示ＦＧＦ在肾小管间质纤维化中的作用有重要意义。１　材料和方法１．１　材料　Ｗｉｓｔａｒ大鼠，雌性，体重２００～２５０ｇ（北京医科大学实验动物提供）。并选用了１９９６年至１９９７年北京医科大学病理系肾穿刺标本有增生硬化性改变的肾小球肾炎２０例，均伴有肾小管间质纤维化，５例轻度系膜增生性肾小球肾炎作为对照。１．…     

肾脏细胞外基质代谢的调控

细胞外基质(ECM)对细胞粘附、增殖及表型转换均起重要作用。体内有多种因子及酶能调节ECM合成及降解，使其处于动态平衡，一旦失衡出现合成增强和(或)降解受阻即能致ECM蓄积，在肾脏即引起。肾小球硬化及。肾间质纤维化。本文就与肾脏ECM代谢调控有关的转化生长因子-β、结缔组织生长因子、骨成形蛋白-7、纤溶酶原激活物抑制剂、基质金属蛋白酶及金属蛋白酶组织抑制剂等的研究进展作一综述。     

MMPs/TIMPs、TGF-β1、细胞外基质与糖尿病肾病

转化生长因子 β1 可刺激系膜细胞外基质 (ECM)蛋白的合成 ,抑制基质金属蛋白酶的酶解活性 ,并增加其抑制剂组织型金属蛋白酶抑制剂的活性 ,从而促进ECM的沉积 ,在糖尿病肾病的发生发展中具有重要作用     

转化生长因子β,肾小球细胞外基质及肾脏病理改变

转化生长因子β、肾小球细胞外基质及肾脏病理改变黄宁昌自ＤｅＬａｒｃｏ和Ｔｏｄａｒｏ于１９７８年首先发现ＴＧＦ－β以来，人们对其作了大量的研究，发现它具有调节细胞生长、分化，以及免疫抑制、兔疫趋化等多种生物学功能，参与了机体许多生理和病理过程，其中尤以...     

尾加压素Ⅱ对肾间质成纤维细胞的促增殖作用及其机制

目的探讨尾加压素Ⅱ(UⅡ)对大鼠肾间质成纤维细胞促增殖作用及其机制。方法体外培养大鼠NRK-49F细胞,采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MT)法、流式细胞仪(FCM)法分别观察不同浓度UⅡ作用下,NRK-49F细胞数及其细胞周期的变化。RT-PCR法检测UⅡ组转化生长因子(TGF)-β1的表达。结果 UⅡ可以促进NRK-49F细胞的增殖活性,随着UⅡ作用浓度的增加,MTT吸光度值呈先升高后降低的趋势,其中1×10-9和1×10-8mol/L UⅡ组作用显著(P0.01);在UⅡ的作用下,NRK-49F细胞S期细胞百分率较对照组明显增加,而G0~G1期细胞百分率较对照组明显降低(P0.01);细胞培养24 h后正常对照组胞质中仅见少量TGF-β1的表达,而经UⅡ作用后,TGF-β1的表达明显增多。结论 UⅡ能促进大鼠NRK-49F细胞增殖,影响细胞周期,这可能与致纤维化因子TGF-β1的提高有关,提示UⅡ在肾纤维化发生和发展过程中发挥着重要的作用。     

MMPs/TIMPs、TGF-β1、细胞外基质与糖尿病肾病

转化生长因子β1可刺激系膜细胞外基质(ECM)蛋白的合成,抑制基质金属蛋白酶的酶解活性,并增加其抑制剂组织型金属蛋白酶抑制剂的活性,从而促进ECM的沉积,在糖尿病肾病的发生发展中具有重要作用.     

人重组骨形成蛋白-7对高糖诱导的肾系膜细胞转化生长因子-β1及结缔组织生长因子表达的影响

目的 探讨人重组骨形成蛋白-7(rhBMP-7)对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞转化生长因子-β1(TGF-β1)、结缔组织生长因子(CTGF)基因表达及细胞外基质(ECM)成分Ⅳ型胶原(ColⅣ)和纤维黏连蛋白(FN)分泌的影响.方法 体外培养大鼠肾小球系膜细胞,分为四组:正常对照组(DMEM培养基含1 000 mg/L葡萄糖)、高糖组(DMEM培养基含4 500 mg/L葡萄糖)、rhBMP-7低剂量组(DMEM培养基含4 500 mg/L葡萄糖+50 nmol/L rhBMP-7)、rhBMP-7高剂量组(DMEM培养基含4 500 mg/L葡萄糖+100 nmol/L rhBMP-7).RT-PCR技术检测TGF-β1和CTGF基因表达水平,ELISA技术检测上清液中TGFβ1、ColⅣ、FN含量.结果 高糖组系膜细胞TGF-β1和CTGF mRNA水平明显高于正常对照组(P<0.01),TGF-β1、ColⅣ和FN分泌增多,与正常对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);与高糖组比较,rhBMP-7不同剂量(50、100 ng/ml)TGF-β1和CTGF mRNA表达明显降低,培养上清中TGF-β1、ColⅣ及FN分泌量亦明显减少,且差异显著(P<0.05).结论 RhBMP-7通过抑制高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞TGF-β1、CTGF基因表达和ECM的分泌可能起到抗纤维化作用.     

蛋白酶体抑制剂Bortezomib对宫颈癌Hela细胞的体外作用

目的探讨蛋白酶体抑制剂Bortezomib对宫颈癌Hela细胞存活率的影响。方法 MTT检测Bortezomib对宫颈癌Hela细胞体外生长及增殖的影响;并用Western印迹、RT-PCR检测NF-κB(P65)蛋白和mRNA表达水平的变化。结果 (1)MTT检测结果显示:与对照组相比,Borte-zomib 1.25μmol/L组〔(84.9±0.08)%〕、Bortezomib 2.50μmol/L组〔(67.1±0.12)%〕、Bortezomib 5.00μmol/L组〔(51.6±0.11)%〕、Bortezomib10.00μmol/L组〔(41.3±0.13)%〕及Bortezomib 20.00μmol/L组〔(20.8±0.12)%〕Hela细胞增殖率明显降低(P<0.05)。(2)Western印迹检测结果表明:随着Bortezomib浓度的增高,NF-κB(P65)蛋白表达量有剂量依赖性的降低趋势(P<0.05)。(3)RT-PCR结果显示,与对照组相比,随着Bortezomib浓度的增加,NF-κB(P65)mRNA的表达水平明显降低(P<0.05)。结论蛋白酶体抑制剂Bortezomib能够体外抑制宫颈癌Hela细胞的短期增殖,其机制与下调NF-κB(P65)的表达密切相关。     

miR-26对TGF-β2诱导的人Tenon氏囊成纤维细胞迁移、细胞外基质蛋白表达的调控作用及其机制

目的 观察miR-26对转化生长因子β₂(TGF-β₂)诱导后人Tenon氏囊成纤维细胞(HTFs)的细胞迁移及细胞外基质(ECM)蛋白表达的调控作用,并探讨其可能的作用机制。方法 切取青光眼手术患者的结膜囊组织,以组织贴壁法体外培养HTFs。取传至第3～5代的HTFs,随机分为空白组(不予转染)、TGF-β₂组(不予转染)、TGF-β₂+miR-26 mimics组(转染miR-26类似物)、TGF-β₂+mimics NC组(转染miR-26类似物阴性对照物),TGF-β₂+miR-26 inhibitors组(转染miR-26抑制物),TGF-β₂+inhibitors NC组(转染miR-26抑制物阴性对照物),转染24 h后除空白组外均加入TGF-β₂5μg/L刺激48 h。采用划痕实验检测细胞迁移率,Western blotting法检测Ⅰ型胶原蛋白(COLⅠ)、纤维连接蛋白(Fibronectin)...     

氯沙坦抑制环孢素A诱导的系膜细胞增生和细胞外基质形成

目的：观察免疫抑制剂环孢素A(CsA)对系膜细胞(MC)增生及细胞外基质(ECM)分泌的影响以及氯沙坦的干预作用，初步探讨环孢素致肾小球硬化的机制。方法：体外培养大鼠肾小球MC，用氚标胸腺密暖核苦(^3H-TdR)掺入法测定CsA对MC增生的影响，用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定细胞上清液中转化生长因子β1(TGF—β1)及ECM成份纤维连接蛋白(fibronectin,Fn)的分泌，用逆转录-聚合酶链反应(RT—PCR)方法测定TGF—β1、I型前胶原、基质金属蛋白酶2(MMP—2)的基因表达。结果：CsA对MC的增生有明显的抑制作用，并呈现时间和剂量依赖效应，氯沙坦对细胞的增生无明显作用；环孢素能明显促进TGF—β1及Fn的分泌，并能促进TGF—β1、I型前胶原mRNA的表达，下调MMP—2 mRNA的表达，氯沙坦能下调环孢素诱导的TGF—β1及Fn的表达。结论：环孢素影响MC增生和ECM分泌从而引起肾小球硬化，肾素—血管紧张素—醛固酮系统可能部分参与了这一过程。     

肝细胞生长因子抑制高糖诱导肾间质成纤维细胞胶原合成和转化生长因子-β1的表达

目的:探讨重组人肝细胞生长因子(rhHGF)对高糖诱导肾间质成纤维细胞损伤的影响.方法:体外培养肾间质成纤维细胞,在高糖环境下加入rhHGF,以酶联免疫吸附法检测培养上清中Ⅲ型胶原浓度,RT-PCR检测细胞HGF和TGF-β1基因表达,Western blot方法检测TGF-β1蛋白合成.结果:高糖预处理的细胞Ⅲ型胶原合成增加(同正常对照组相比,P＜0.01).高糖作用早期HGF表达升高,随着作用时间延长,其分泌量下降,而TGF-β1 出现持续高表达.此外,HGF可以抑制TGF-β1基因和蛋白表达,结果显示,加入HGF后,TGF-β1基因表达显著下降,表达量下降了50%,并且HGF以剂量依赖形式抑制TGF-β1表达,相关分析证实r=-0.8726,P＜0.01.同时HGF对Ⅲ型胶原合成产生抑制作用.结论:高糖环境促进Ⅲ型胶原合成和TGF-β1持续高表达.rhHGF可以部分抑制Ⅲ型胶原和TGF-β1表达.     

肝再生增强因子对肾间质纤维化发病的干预作用机制及其治疗应用研究进展

肾间质纤维化是慢性肾脏病发生发展过程中的重要病理特征之一.在肾损伤的过程中,分布于肾脏细胞内的肝再生增强因子表达上调,通过免疫调控、提高氧化酸化能力和巯基氧化酶等作用参与肾损伤调控.肝再生增强因子可从抗肾小管细胞凋亡、抑制转化生长因子β信号通路、抑制细胞外基质合成、刺激细胞外基质降解、阻断信号通路及抑制炎症反应等多个方...