体外诱导骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞的实验研究

目的探讨体外诱导骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞的可行性。方法分离培养骨髓间充质干细胞，鉴定其表面抗原，用含2％胎牛血清以及50ng／ml血管内皮生长因子的条件培养基诱导，诱导后细胞通过内皮细胞标志物KDR、FLT-1以及v-WF染色鉴定。结果骨髓间充质干细胞表面抗原CD29、CD44、CD105阳性，CD34、CD45、CD106以及HLA-DR阴性。诱导后细胞形态明显改变，内皮细胞标志物KDR、FLT-1以及v-wF染色结果阳性。结论骨髓间充质干细胞在体外具有分化为血管内皮细胞的能力，可以作为干细胞治疗的一种有效来源。     

兔骨髓间充质干细胞体外诱导血管内皮细胞

目的:探讨兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外诱导为血管内皮细胞(VECs)的方法,为心血管疾病的血管重建提供治疗策略。方法:抽取兔骨髓,采用全骨髓贴壁法加内皮细胞培养液诱导培养细胞,记录并观察诱导后细胞的形态及生长过程,并进行荧光标记;采用免疫细胞化学显色法鉴定诱导后细胞表面标志物CD31、CD34,利用支架材料Matrigel基质胶观察VECs三维血管化形态。结果:兔BMSCs经诱导后48 h,呈小圆形,可见贴壁生长;3～4d可见少量细胞贴壁,多为短梭形;6～8d完全贴壁,多为长梭形、锥形、不规则形;10～12d后细胞呈集落样生长;第15天成片生长的细胞集落相互连接,呈现典型的"鹅卵石样"或"铺路石样"外观;CM-DiI细胞荧光标记显示VECs的胞质、胞膜呈现红色荧光,DAPI细胞荧光标记显示VECs胞核呈蓝色荧光,细胞形态为长梭形,且细胞生长状况良好;免疫细胞化学显色显示CD31、CD34均呈阳性;在Matrigel基质胶上VECs呈现典型的环状或管状。结论:以全骨髓贴壁法和经内皮细胞培养液诱导法可获得VECs。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的研究

目的：探讨胰岛素样生长因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）和软骨细胞培养液体外诱导骨髓间充质干细胞（MSCs）向软骨细胞分化的可能性。方法：采用Percoll分离液分离培养人胚MSCs，体外扩增，用流式细胞仪测定MSCs的CD44、CD71、CD34、CD45表达；在第4代MSCs中加入的条件培养基进行诱导，根据条件培养基的不同分为4组：①IGF-Ⅰ组：培养基中加入100ng／mL IGF-Ⅰ；②软骨细胞培养液组：加入软骨细胞培养液；③联合诱导组：培养液中加入100ng／mL IGF-Ⅰ和软骨细胞培养液；④对照组：培养基中不加入IGF-Ⅰ和软骨细胞培养液。采用倒置显微镜观察、Ⅱ型胶原免疫组化、细胞内蛋白多糖（PG）含量测定等方法判断诱导细胞的形态变化和表达软骨基质的能力。结果：体外培养的MSCs呈现成纤维细胞样形态，流式细胞仪检测结果显示，MSCs阳性表达CD44，阴性表达CD34，CD45；IGF-Ⅰ和软骨细胞培养液联合诱导15d后，MSCs开始呈现软骨细胞的形态特点，Ⅱ型胶原免疫组化呈阳性，而未诱导的MSCs组呈阴性；联合诱导组细胞内PG含量为8．92μg／ml，显著高于IGF-Ⅰ组、软骨细胞培养液组和对照组，但低于正常软骨细胞（P〈0．01）。结论：IGF-Ⅰ和软骨细胞培养液能诱导MSCs向软骨细胞分化。     

人骨髓间质干细胞体外扩增和向内皮细胞定向诱导分化的研究

目的：体外分离、扩增成人骨髓间质干细胞（MSCs）和向内皮细胞（ECs）定向诱导分化，开辟心血管组织工程种子细胞的新来源。 方法： 采用Percoll(1 073 g/L)从正常成人骨髓中分离出MSCs，纯化和扩增后流式细胞仪鉴定其纯度；用血管内皮生长因子(VEGF)诱导MSCs向ECs分化，Ⅷ因子(vWF)免疫组化和透射电镜(TEM)鉴定细胞性质。 结果： 5.0×105个MSCs在体外扩增15代后，获得8.0×1012个MSCs，扩增了约1.6×107倍；MSCs在加入VEGF诱导培养大约14-21 d，80%-90%的诱导细胞对Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应；TEM可观察到胞浆内有Weible-palade小体，证实为ECs。 结论： 成人骨髓MSCs在体外具有定向诱导分化为ECs的潜能，这为心脏组织工程瓣体外构建, 尤其是在小儿先天性心脏病组织工程研究中种子细胞的来源提供了可能性。     

猪骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞的诱导研究

探讨利用血管基质成分将猪骨髓间充质干细胞诱导分化为血管内皮细胞的可能性.其方法为以DMEM作为基础成分,添加制备好的血管基质成分和胎猪血清作为诱导猪骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化的生化条件.结果表明在培养液中观察到了血管内皮细胞.利用血管基质成分将猪骨髓间充质干细胞诱导分化为血管内皮细胞是可能的.     

犬骨髓间充质干细胞定向分化为内皮细胞的研究

应用密度梯度离心法分离狗骨髓间充质干细胞,建立诱导分化内皮细胞的方法及条件。密度梯度离心法分离狗骨髓间充质干细胞后,在体外经血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、内皮细胞生长因子(Endothelial growth factor,EGF)等诱导后,分化形成内皮样细胞。结果表明:光镜下细胞单层融合生长,呈铺路石样形态,单个核位于中央。电镜下可见到Weibel-Palade小体,在细胞胞浆vWF染色阳性。骨髓间质干细胞,在体外可诱导分化成内皮细胞。     

腺病毒介导血管内皮细胞生长因子基因体外转染人脐带间充质干细胞

目的探讨腺病毒介导血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因转染人脐带间充质干细胞(UCMSCs)后目的基因表达情况及对UCMSCs生长增生的影响。方法 UCMSCs传代培养后,以腺病毒介导绿色荧光蛋白(GFP)基因进行体外转染,倒置荧光显微镜下观察细胞转染效果,流式细胞仪检测细胞转染效率,确定最佳的病毒感染复数(MOI)。将实验分为VEGF基因转染组和未转染组。转染组在最佳MOI值条件下以腺病毒介导VEGF基因体外转染UCMSCs;未转染组以PBS代替病毒液。通过免疫荧光染色及Western blotting检测两组UCMSCs VEGF蛋白的表达情况,RT-PCR检测VEGF基因mRNA的表达情况,ELISA检测培养液中VEGF浓度,MTT法评价转染后对UCMSCs生长增生的影响。结果腺病毒介导的GFP基因对于UCMSCs具有较高的转染效率,转染效率与MOI值具有量效关系,当MOI为100倍时,转染效率达95%。转染VEGF基因后2d,UCMSCs在mRNA和蛋白水平上均可有效表达VEGF,免疫荧光染色、RT-PCR、Western blotting显示转染组明显表达VEGF,ELISA检测结果显示7d时达到表达高峰,13d后仍可检测到VEGF的表达。介导VEGF基因转染的腺病毒对UCMSCs的生长增生没有明显影响。结论 UCMSCs是一种较理想的基因载体细胞,腺病毒介导VEGF基因可以有效转染UCMSCs,转染后VEGF基因可获得较高的表达水平。     

热休克内皮细胞诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化

文题释义：血管内皮细胞：研究中一般称内皮细胞,通常指衬于心、血管和淋巴管内表面的单层扁平上皮,它形成血管的内壁。它们具有吞噬异物、细菌、坏死和衰老组织的功能,还参与机体免疫活动功能。 热休克：组织工程中一种细胞处理方法,将细胞置于42 ℃(也有文献报道为47 ℃)中1 h,造成热休克状态。 背景：目前关于间充质干细胞向内皮细胞分化的研究,多采用细胞因子或2种细胞共培养的方法进行诱导,热休克处理的内皮细胞诱导间充质干细胞向内皮细胞分化尚未见报道。 目的：观察热休克处理的人脐静脉内皮细胞诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化的能力,并探究诱导骨髓间充质干细胞形成血管的能力。 方法：将热休克处理后的人脐静脉内皮细胞与人骨髓间充质干细胞体外非接触共培养,诱导14 d后采用流式细胞仪和免疫荧光检测骨髓间充质干细胞中CD144、CD31、VEGFR2、vWF表型的表达;将诱导14 d后的骨髓间充质干细胞、未诱导的骨髓间充质干细胞移植到裸鼠皮下,14 d后取移植物做苏木精-伊红染色,观察体内血管形成能力;Matrigel成血管实验观察诱导14 d后的骨髓间充质干细胞和未诱导的骨髓间充质干细胞的体外血管生成能力。 结果与结论：①共培养后骨髓间充质干细胞形态改变,呈类似铺路石状排列,流式细胞仪及细胞免疫荧光结果显示共培养后骨髓间充质干细胞VEGFR2、CD31、CD144、vWF表达增加;②体内移植物苏木精-伊红染色显示诱导后的骨髓间充质干细胞排列较对照组规律,有成血管倾向;③体外Matrigel成血管实验显示诱导后骨髓间充质干细胞成血管能力较对照组有所增加;④结果表明,与热休克处理的人脐静脉内皮细胞共培养能促进人骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化,内皮细胞特异性表型转化较明显,具有一定血管形成倾向。 ORCID: 0000-0003-4089-8882(曹百川) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

黑色素瘤细胞诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化的初步研究

目的 体外观察和分析小鼠黑色素瘤细胞B16诱导小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)向血管内皮细胞分化的现象和过程,初步分析肿瘤细胞分泌血管生长因子(VEGF)-a在该诱导过程中的时序关系.方法 利用Transwell系统进行BMSC与B16细胞共培养,利用免疫荧光、蛋白印迹、透射电镜等技术观察BMSC经B16诱导后向内皮细胞分化的过程,利用ELISA检测培养液内VEGF-a的水平.结果 BMSC表型鉴定为CD44+/CD73+/CD90+/CD105+/CD166+/CD34-/CIM5-/CD133-,经B16诱导后出现内皮细胞标志物VEGFR-1、VEGFR-2和第八因子(FⅧ)的表达并随时间延长而增强,共培养48 h后VEGFR-1、VEGFR-2及FⅧ均可见明显表达,72 h时VEGFR-2表达量较48 h时增加了1倍,FⅧ表达量增加了约3倍.共培养体系培养基中可检测到由B16细胞分泌的VEGF-a量随时间增多.结论 B16细胞可能通过分泌VEGF-a来诱导BMSC具备血管内皮细胞表型,提示BMSC在肿瘤血管生成中起了重要的作用.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝细胞

目的 研究HGF、aFGF及OSM诱导MSCs成为肝细胞的能力及其在分化中的作用。方法 用HGF、 aFGF、OSM诱导分化MSCs后,用化学发光法、RT-PCR法及谷氨酸脱氢酶法检测细胞AFP、ALB及尿素的表达情况。结果 除对照组外其余各组细胞均有AFP表达 (P<0.05);对照组及a+O组无ALB、尿素的表达,其余各组出现ALB及尿素的表达(P<0.05)。结论HGF联合aFGF、OSM及aFGF能够诱导MSCs分化为表达AFP、ALB、尿素的肝细胞;aFGF与OSM在没有HGF存在时不能诱导MSCs向较为成熟的肝细胞的分化。     

曲古抑菌素A促进小鼠骨髓间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞

 目的： 观察曲古抑菌素A(TSA)诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的适宜浓度。方法: C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞系体外培养。实验分为5组：对照组（DMSO,A组)和TSA干预组（25 nmol/L,B组;50 nmol/L,C组;100 nmol/L,D组;200 nmol/L,E组）。各组分两阶段用相应的培养基培养10 d后进行检测。双硫腙染色鉴定各组的胰岛素分泌细胞,结果进行半定量分析。免疫荧光染色鉴定各组的胰岛素分泌,比较各组胰岛素平均荧光强度。酶联免疫吸附试验检测各组胰岛素分泌细胞胰岛素的分泌量。结果: TSA作用10 d能够诱导C57BL/6 小鼠骨髓间充质干细胞分化成为胰岛素分泌细胞并分泌胰岛素。 B组胰岛素染色阳性面积、阳性率、胰岛素染色积分吸光度以及胰岛素平均荧光强度显著高于其它干预组,差异有统计学意义（均P<0.05）。 随着各干预组TSA浓度的升高,胰岛素的分泌量减少。B组胰岛素含量显著高于其它干预组,差异有统计学意义（均P<0.05）。结论：TSA处理10 d能诱导C57BL/6 小鼠骨髓间充质干细胞分化成为胰岛素分泌细胞,并且25 nmol/L为TSA的适宜浓度。     

肝细胞生长因子诱导骨髓间质干细胞分化为心肌细胞

目的:探讨肝细胞生长因子(HGF)体外诱导骨髓间质干细胞(MSC)定向分化心肌细胞的一种新方法。方法: 分离SD大鼠骨髓MSC,培养至4-6代后,添加HGF(终浓度10 μg/L)持续培养30 d,倒置显微镜下动态观察分化细胞的自律性搏动和对0.1%异丙肾上腺素和无Ca²⁺孵育液的反应,并行心肌肌凝蛋白表达鉴定。结果: 分化第14-20 d骨髓间质干细胞增殖形成集落,10%-50%克隆中开始出现持续节律收缩的细胞群体,节律频率为70-90次/min,异丙肾上腺素加快其搏动速率,无Ca²⁺孵育液则抑制之。细胞心肌肌凝蛋白表达鉴定为心肌细胞。结论: HGF可诱导骨髓间质干细胞分化为心肌细胞,且有较高的诱导效率。     

催产素体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化

目的探索催产素(OT)体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌细胞分化的可行性。方法取SD大鼠四肢骨骨髓,分离培养MSCs,应用OT定向诱导,相差显微镜观察细胞形态学变化,应用免疫细胞化学、激光扫描共聚焦显微镜技术检测结蛋白,α-横纹肌肌动蛋白、心肌特异性肌钙蛋白T的表达;以半定量RT-PCR方法在诱导后7、21和28 d检测细胞心肌早期转录因子GATA-4和心肌特异性肌凝蛋白重链α-MHC的表达。结果体外分离培养的细胞生长稳定,增殖较快,主要为纺锤形和成纤维细胞状。诱导后1周,细胞以梭形、柱状为主,部分细胞有分支,核卵圆形、居中,类似心肌细胞形态,排列方向渐趋一致。诱导后4周,细胞形态变长、增大,多呈杆状,紧密平行排列生长。分化后细胞结蛋白、α-横纹肌肌动蛋白和肌钙蛋白T均呈现阳性表达。激光共聚焦扫描显微镜观察:可见细胞质内结蛋白的表达呈红色,肌钙蛋白T的表达呈绿色,当两者同时被观察时可见其共表达的部位变成黄色。RT-PCR结果显示,GATA-4于诱导后7 d弱表达,21 d表达增强,28 d表达减弱。α-MHC在诱导后7 d不表达,21 d弱表达,28 d表达明显。结论骨髓间充质干细胞在OT诱导下可定向...     

碱性成纤维细胞生长因子体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

Objective To study the feasibility of basic fibroblast growth factor （bFGF）in inducing bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs) to differentiate into cardiomyocyte-like cells in vitro. Methods SD rat BMSCs were isolated and cultured from rat bone marrow, and then induced by bFGF. The cultured cells were observed by a phase-contrast microscope. The immunohistochemical technique and laser scanning confocal microscope (LSCM) were used for examination of the expression of desmin, α-actin and C-TnT. The ultrastructure of induced cells was observed by a transmission electron microscope. GATA4 andα-MHC expressions were detected by relative quantitative RT-PCR after 7, 21, 28 days of induction respectively. Results After primary cells were cultured for 48 hours,most of them became fusiform fibroblast-like shape with two or three processes and a few of them were flat in shape. The morphology of BMSCs induced by bFGF changed obviously. After being induced by bFGF for one week, the cells became larger and most of them became myocyte-like short column in shape or long shuttle-shape while paralleled. After four weeks, most cells became short column-shape and touched with adjacent cells tightly to form myotube-like structure,with apparent directionality of cell arraying. BMSCs induced by bFGF were identified by the positive staining for desmin, α-sarcomeric actin and C-TnT. Of BMSCs, there were more desmin positive and α-actin-positive cells made up higher of all BMSCs than C-TnT-positive cells. Desmin and α-actin-positive cells were about 33.82% and 58.64%, and C-TnT-positive cells were about 28.94%. Desmin(α-actin ) appeared red, and C-TnT was green under a laser scaning confocal microscopy. Their co-expression appeared yellow. Transmission electron microscope showed that the induced cells were rod in shape and the ovoid nuclei were positioned in the center of the cell. lots of mitochondria, rough endoplasmic reticulum, ribosome and paralleled myofilaments were founded in plasm.RT-PCR assessment showed that the differentiated cells began to express GATA-4 from day 7 to day 28 of differentiation and began to express α-myosin heavy china(α-MHC) fro     

骨髓间充质干细胞与纳米羟基磷灰石支架材料的体外相容性研究

目的　探讨兔骨髓间充质干细胞(rBMSCs)与纳米羟基磷灰石(nano-HA)支架材料的相容性,进一步验证nano-HA材料作为骨组织工程支架材料的可行性。 方法　将rBMSCs与nano-HA支架材料在体外复合培养,通过倒置显微镜、扫描电镜观察细胞与材料的复合情况,用MTT法、碱性磷酸酶活性检测法检测材料对细胞增殖、分化的影响。 结果　rBMSCs可以在nano-HA支架材料表面及孔隙中良好的黏附、迁移、增殖和分化,复合培养5 d后nano-HA支架材料对rBMSCs的增殖分化表现出一定的促进作用。 结论　rBMSCs与nano-HA支架材料具有良好的生物相容性, nano-HA支架材料可以作为rBMSCs良好的载体。     

人骨髓间质干细胞向造血细胞分化潜能的实验研究

目的:在体研究人骨髓间质干细胞(hBMMSCs)向造血细胞分化的潜能。方法:将hBMMSCs经尾静脉注射给环磷酰胺处理的严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠,利用流式激活细胞分析系统(FACS)检测hBMMSCs输注后存活35d的SCID小鼠外周血、骨髓和脾脏中人源性造血细胞的表型和水平。结果:hBMMSCs输注组外周血(PB)、骨髓(BM)和脾脏(spleen)中可检测到人CD45⁺/H-2D^d-、CD34⁺/H-2D^d-细胞,而对照组PB、BM和脾脏均未检测到上述表型的人造血细胞。结论:hBMMSCs具有向造血细胞分化的潜能。     

人骨髓间充质干细胞抵抗化疗性DNA损伤

目的 探讨人骨髓间充质干细胞(BMSCs) 耐受化疗药物损伤的作用机制.方法 分离培养人BMSCs;用免疫荧光等方法检测体外培养的BMSCs对3种化疗药物顺铂、长春新碱和喜树碱处理后的反应;分析凋亡诱导基因家族p53和p73的表达情况.结果 与敏感的肿瘤细胞系K562相比,体外培养BMSCs对3种化疗药物有较高的耐受性...     

大鼠骨髓间充质干细胞体外心肌定向诱导及心肌组织构建研究

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）向心肌定向诱导分化及诱导后BMSCs体外构建工程化心肌组织的可行性。方法用含10μmol／L5-氮胞苷（5-Aza）的完全培养液（LG-DMEM,10％胎牛血清,100U／mL青霉素,100μg／mL链霉素,10μg／L碱性成纤维细胞生长因子）孵育第3代BMSCs24h后改用完全培养基培养4周,采用未处理组作为阴性对照。采用免疫细胞化学方法检测心肌肌钙蛋白T（cTnT）、α-肌动蛋白（α-Actin）的表达;逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测早期心肌形成转录因子GATA-4、Nkx2．5、TDGF-1基因的表达。将已诱导4周的BMSCs接种于多聚赖氨酸包被的脱细胞牛心包生物支架上培养2周后检测。结果诱导组细胞向心肌细胞转化,表达cTnT、α-Actin,对照组不表达cTnT、α-Actin;RT-PCR检测BMSCs诱导后表达早期心肌形成转录因子GATA-4、Nkx2．5、TDGF-1等基因;诱导后的BMSCs黏附于脱细胞牛心包生物支架表面,生长良好。结论大鼠BMSCs可向心肌细胞定向诱导分化,与脱细胞牛心包生物支架黏附良好,有望构建理想的组织工程化心肌。     

Therapeutic effect comparison of hepatocyte-like cells and bone marrow mesenchymal stem cells in acute liver failure of rats

Goals: To evaluate the therapeutic efficacy of rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) induced into hepatocyte-like cells and of un-induced BMSCs in acute liver failure rats. Methods: BMSCs in highly homogenous passage 3 were cultured using the whole bone marrow adherent culture method. Hepatic-related characters were confirmed with morphology, RT-PCR analysis, glycogen staining and albumin (ALB) immunofluorescence assay. Carbon tetrachloride (CCl4) was injected intraperitoneally to establish an acute rat liver failure model. Hepatocyte-like cells or un-induced BMSCs were respectively injected into the models to examine rats’ appearance, liver function assay and liver tissue pathology. Results: Hepatocyte-like morphology, higher expression of cytokeratin 18 (CK18) mRNA and ALB protein, and glycogen accumulation were confirmed in the induced BMSCs. The transplanted DAPI-labeled BMSCs were localized in the liver tissue 3-14 days after transplantation. The levels of liver function indicators (AST, ALT, ALP, and TBIL) from transplanted rats were significant decreased and pathology was improved, indicating the recovery of liver function. However, the differences were statistically insignificant. Conclusion: Both hepatocyte-like cells and un-induced BMSCs had a similarly positively therapeutic efficacy on liver regeneration in rat liver failure model.