LPS诱导MC3T3-E1成骨细胞增殖并增加NF-κB p65蛋白的表达

目的： 研究LPS-NF-κB信号通路在骨形成过程中的作用。方法: MC3T3-E1成骨细胞常规培养,待细胞融合率为80%时,分别加入100 μg/L和500 μg/L LPS处理6 h。流式细胞仪检测细胞周期,计算细胞DNA相对增殖指数;RT-PCR法检测LPS处理成骨细胞后NF-κB mRNA的表达;蛋白质印迹法（Western blotting）检测LPS处理成骨细胞后NF-κB p65蛋白的表达;细胞免疫荧光法检测LPS处理成骨细胞后NF-κB p65的核易位情况;电泳迁移率变动分析（EMSA）LPS处理MC3T3-E1细胞后NF-κB活力的变化情况。结果: 100 μg/L和500 μg/L LPS可诱导MC3T3-E1成骨细胞增殖;LPS处理成骨细胞后NF-κB mRNA的表达与正常组比较无显著变化（P>0.05）,而NF-κB p65蛋白的表达明显高于对照组（P<0.01）;LPS处理成骨细胞后免疫荧光法可明显观察到NF-κB p65从细胞质转移入细胞核,且EMSA结果显示LPS处理组细胞核内NF-κB结合活性增加。结论: 低浓度的LPS可促使成骨细胞增殖,此过程中并不影响NF-κB p65的基因表达水平,但能增加NF-κB p65蛋白的表达并提高细胞核内NF-κB的结合活性。     

基于转录组测序分析微重力环境下MC3T3-E1成骨细胞miRNA/mRNA表达谱及功能变化

目的探讨微重力环境对MC3T3-E1成骨细胞分化的影响。方法采用转录组测序技术(RNA-seq)观察微重力培养前后MC3T3-E1成骨细胞miRNA/mRNA表达谱变化,测序结果采用q-PCR验证。采用生物信息学方法进一步研究差异性表达的miRNA/mRNA。结果与对照组(CON)相比,模拟微重力组(SMG)共有160条miRNA和1 912个mRNAs发生显著改变;根据生物信息学结果,筛选出10个关键性基因(3条miRNA、7个mRNA),其中miR-9_6666-5p为微重力敏感miRNA,可能在微重力环境下成骨细胞分化过程中起到重要的作用。结论在微重力环境下,成骨细胞分化受到抑制可能与miRNA/mRNA表达谱的改变有关。研究结果将有助于深入理解miRNA与mRNA在微重力环境下调控成骨分化与骨生成的分子机制。     

牵张应力介导细胞成骨分化及相关基因的表达

背景：ERK1/2信号通路和核因子κB信号通路是否参与了牵张应力作用下MC3T3-E1细胞成骨分化及相关基因表达的调控,尚不清楚。 目的：观察机械牵张应力对作用下ERK1/2和核因子κB通路对成骨细胞碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨钙蛋白、白细胞介素6表达的影响,探讨ERK1/2与核因子κB信号通路对成骨细胞分化的调控作用。 方法：体外培养的MC3T3-E1细胞,以ERK1/2通路特异性抑制剂PD098059及核因子κB通路抑制剂PDTC分别处理30 min后加载12%的拉伸应变率24 h,以正常细胞及单纯加载12%牵张应力24 h为对照。采用ELISA及Real-time PCR方法检测细胞加载前后碱性磷酸酶活性、Ⅰ型胶原、骨钙蛋白及白细胞介素6 mRNA的表达。 结果与结论：在12%牵张应力作用下,MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、白细胞介素6的表达受ERK1/2信号通路的调控,而骨钙蛋白基因表达的变化不受ERK1/2通路的影响。核因子κB信号通路抑制剂PDTC可显著抑制机械牵应张力作用下MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶活性的降低,同时抑制白细胞介素6基因的表达,而Ⅰ型胶原、骨钙蛋白基因表达的变化不受核因子κB信号通路的影响。结果表明牵张应力可以通过ERK1/2和核因子κB通路影响MC3T3-E1细胞的成骨分化及相关基因表达。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

ER-α-ERK5信号通路介导流体剪切力促进MC3T3-E1细胞增殖

目的:研究雌激素受体α(ER-α)在流体剪切力促进细胞外信号调节激酶5(ERK5)活化以及ER-α-ERK5信号通路在成骨细胞增殖中的具体分子机制。方法:给予成骨MC3T3-E1细胞孵育特异性ER-α抑制剂MPP(methyl-piperidinopyrazole,1μmol/L),孵育高选择性ERK5活性抑制剂XMD8-92(5μmol/L),和/或加载12 dyn/cm~2流体剪切力处理。采用MTT实验检测成骨细胞的增殖活性,采用蛋白免疫印记实验检测ER-α、P-ERK5、ERK5、Cyclin D1(细胞周期蛋白)和CDK4(细胞周期蛋白依赖性激酶)蛋白的表达水平。结果:生理强度(12 dyn/cm~2)的流体剪切力作用于成骨MC3T3-E1细胞60 min后能显著促进成骨细胞增殖,促进Cyclin D1和CDK4的表达;同时ER-α和P-ERK5的表达显著增加。成骨细胞孵育MPP抑制ER-α后,P-ERK5的表达显著下降,Cyclin D1和CDK4表达也显著降低。孵育XMD8-92抑制ERK5活性后,流体剪切力促进成骨细胞中Cyclin D1和CDK4表达水平显著下降。结论:流体剪切力通过ER-α-ERK5信号通路上调Cyclin D1和CDK4的表达水平,最终导致成骨MC3T3-E1细胞增殖。     

穿心莲内酯通过抑制TNF-α活化的NF-KB信号途径保护和促进成骨分化

目的探索穿心莲内酯是否能够抵抗TNF-α激活的NF-κB信号通路活化,从而保护和促进骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的成骨分化作用。方法碱性磷酸酶染色和茜素红染色观察穿心莲内酯对BMSCs在有或无TNF-α环境下对成骨分化的保护和促进作用。通过real time PCR分析穿心莲内酯对BMSCs在有或无TNF-α环境下Runx2、Opn和Col1的调节作用。通过免疫荧光染色分析穿心莲内酯对TNF-α激活下NF-κB信号通路活化的影响,从而确定穿心莲内酯保护TNF-α对BMSCs细胞成骨分化影响的机制。结果与对照组相比,穿心莲内酯通过促进BMSCs中Runx2、Opn和Col1的表达,从而促进BMSCs成骨分化。同时,穿心莲内酯能够抑制TNF-α对NF-κB信号途径的激活作用,并能保护TNF-α对BMSCs成骨分化的抑制作用。结论穿心莲内酯通过抑制TNF-α激活的NF-κB信号途径保护和促进BMSCs成骨分化。     

mTORC1 信号促进前成骨细胞MC3T3-E1 的分化成熟

目的:研究mTORC1 信号对前成骨细胞MC3T3-E1 向成骨细胞分化成熟的调控作用。方法:通过向MC3T3-E1 转染pcDNA3.1-Raptor,对mTORC1 信号相关蛋白Raptor 进行过表达。向MC3T3-E1 转染Raptor siRNA,对mTORC1 信号蛋白Raptor 进行基因沉默。通过Real-time PCR 方法测定Raptor 的基因表达,通过蛋白免疫印迹法测定Raptor 蛋白水平,并通过茜素红染色检测成骨矿化情况,以测定成骨分化程度。通过Real-time PCR 检测成骨分化指标的基因表达。结果:与对照组相比,Raptor 过表达组的Raptor mRNA 和蛋白水平明显增加;茜素红染色结果显示Raptor 过表达组染色更深,说明成骨矿化程度更高;荧光定量PCR 结果显示,Raptor 过表达组的成骨分化标记基因以及成骨转录因子的表达量均高于对照组。与对照组相比,Raptor siRNA 组的Raptor mRNA 和蛋白水平明显降低;茜素红染色结果显示Raptor siRNA 组染色更浅,说明成骨矿化程度更低;荧光定量PCR 结果显示,Raptor siRNA 组的成骨分化标记基因以及成骨转录因子的表达量均低于对照组。结论:mTORC1 信号促进前成骨细胞MC3T3-E1 向成骨细胞分化成熟。     

猪苓多糖对膀胱癌细胞TLR2/4-NF-κB信号通路相关基因影响

目的:研究猪苓多糖(PPS)对膀胱癌细胞(T739)TLR2/4-NF-κB通路相关基因表达的影响及其与TLR2/4关系.方法:应用qRT-PCR、Western blot和流式细胞术(FCM)等方法检测PPS作用T739细胞后IKKB、NF-κB p65、ICAM1和CCL2 mRNA与蛋白表达变化;应用标记探针结合酶联免疫吸附法检测PPS作用T739细胞后NF-κB p65 DNA结合活性改变;应用免疫组化方法观察PPS作用T739细胞后NF-κBp65胞核表达变化.结果:PPS作用T739细胞后,IKBKB(IKKβ)、Rel A(NF-κB p65)、ICAM1和CCL2 mRNA表达均显著下降,IKKB、CCL2蛋白表达也下调,ICAM1蛋白表达无明显变化,并且沉默TLR4后能抑制上述基因表达下调,沉默TLR2作用不明显.同时PPS能减弱T739细胞胞核的NF-κBp65 DNA结合活性及下调NF-κB p65胞核表达;沉默TLR4后能抑制NF-κB p65的DNA结合活性的降低与NF-κB p65胞核表达的下调.结论:猪苓多糖主要经TLR4信号通路抑制相关基因表达、NF-κB p65 DNA结合活性与胞核表达,TLR2信号通路也参与了2个基因表达的介导作用.     

PGE2和NF-кB信号途径在骨再生中的相互作用

目的 本研究旨在利用MC3T3-E1成骨细胞株与大鼠骨折模型来研究骨折愈合过程中PGE2和NF-кB信号途径的相互作用.方法 利用PGE2与NF-кB抑制剂BAY 11-7082处理MC3T3-E1成骨细胞和大鼠骨折模型,采用碱性磷酸酶活性测定、Western blot分析、EMSA分析以及ELISA测定等研究手段,研究PGE2、NF-кB、BMP-7、Id2以及SOD2在骨再生中的作用.结果 利用10 μmol/l PGE2处理MC3T3-E1细胞10 min,30 min和2h后,能够显著地促进成骨细胞增殖与分化,当细胞用5μmol/L BAY 11-7082处理后,PGE2诱导作用受到抑制,表明PGE2增加ALP的表达是通过NF-kB途径来介导.局部注射NF-kB抑制剂后PGE2的生物合成明显减少;此外,抑制骨折部位ALP的活性,在骨折的损伤修复过程中,NF-кB、BMP-7以及SOD2的表达均明显上升,而Id2的表达明显下降；加入NF-кB活性抑制剂后,BMP-7与Id2的表达恢复到正常水平,而SOD2的表达没有改变. 结论 PGE2能够同时通过抑制Id2细胞因子和激活NF-кB信号途径诱导成骨细胞分化.     

聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合物对MC3T3-E1细胞增殖活性的影响

背景:研究表明聚乳酸/羟基磷灰石复合材料与自然骨结构和性能相似,具有骨传导性和良好的生物相容性。目的:观察聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合物与成骨细胞株MC3T3-E1的生物相容性。方法:分别采用普通完全培养基(对照组)与聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合物浸提液(实验组)培养第3代成骨细胞株MC3T3-E1,培养3,5,7 d,采用CCK-8法检测细胞的吸光度值;在培养第7,14天检测细胞碱性磷酸酶、骨钙素、Ⅰ型胶原、核心结合因子α1/成骨特异性转录因子表达。将聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合物与第3代成骨细胞株MC3T3-E1共培养,培养7,14 d细胞骨架染色及扫描电镜观察细胞在支架材料上的形态。结果与结论:随着时间的延长,成骨细胞株MC3T3-E1的吸光度值明显增加,两组细胞吸光度值比较差异无显著性意义。实验组培养第7天细胞碱性磷酸酶活性高于对照组(P0.05),培养第14天细胞碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、核心结合因子α1/成骨特异性转录因子表达高于对照组(P0.05)。种植7 d后细胞在材料上贴附生长,细胞呈多角形;种植14 d后细胞较7 d前数目明显增多,且完全伸展,呈多角形和梭形。表明聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合物对成骨细胞有良好的生物相容性,无细胞毒性。     

Dlx2基因过表达与前成骨细胞系MC3T3-E1成骨分化过程中的细胞凋亡和周期调控*****◆

背景：Dlx2基因在颅神经嵴细胞迁徙进入第一鳃弓过程和颅颌面骨骼发育中起重要作用,但Dlx2基因对成骨细胞分化过程中细胞凋亡和细胞周期调控的影响尚未见报道。 目的：观察Dlx2基因过表达对前成骨细胞系MC3T3-E1成骨分化过程中细胞凋亡和细胞周期调控的影响。 方法：构建反转录病毒pMSCV-puro-Dlx2并转染矿化诱导液培养下的MC3T3-E1细胞,构建稳定过表达Dlx2基因的细胞系MC3T3-E1-Dlx2。RT-PCR和Western blot验证Dlx2基因过表达细胞系的建立。Annexin V/PI双染色后流式细胞分选检测细胞凋亡,PI/RNase双染色后流式细胞分选检测细胞周期变化。 结果与结论：实验成功构建稳定过表达Dlx2基因的细胞系MC3T3-E1-Dlx2。发现Dlx2基因过表达促进细胞凋亡(P < 0.05),同时阻滞细胞周期于G1/G0期(P < 0.05),减低细胞增殖性,促进细胞分化行使功能。 关键词：成骨细胞分化;Dlx2基因;稳定过表达;细胞凋亡;细胞周期 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.10.022     

左归丸含药血清通过ERK/TGF-β/Smads信号级联调控MC3T3-E1细胞增殖与分化

目的:研究细胞外信号调节激酶(ERK)/转化生长因子β(TGF-β)/Sma和Mad相关蛋白(Smads)信号级联在左归丸含药血清干预成骨前体细胞系MC3T3-E1细胞增殖与分化中的作用。方法:以倍美力为阳性对照药,对Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠灌服高、中、低剂量的左归丸混悬液,7 d后腹主动脉取血分离含药血清。采用噻唑蓝(MTT)法检测左归丸含药血清对MC3T3-E1细胞的增殖作用,采用改良钙钴染色法检测碱性磷酸酶(ALP)表达,采用茜素红染色法检测钙化结节,采用Western blotting法检测核结合因子α1(Cbfα1)和Ⅰ型胶原(ColⅠ)蛋白表达,采用real-time RT-PCR法检测TGF-β₁、Smad4和Smad2 mRNA表达。结果:左归丸含药血清对MC3T3-E1细胞的促增殖作用呈剂量和时间相关性,其中以低剂量且体积分数为15%作用48 h后对MC3T3-E1的促增殖作用最大;左归丸含药血清能促进MC3T3-E1细胞ALP表达,增强细胞基质钙化,提高Cbfα1和ColⅠ蛋白分泌,上调TGF-β₁、Smad4和Smad2 mRNA表达;加入ERK1/2信号通路特异性阻滞剂PD98059后,MC3T3-E1细胞增殖降低,ALP表达下降,细胞基质钙化减弱,Cbfα1和ColⅠ蛋白分泌降低,Smad4和Smad2 mRNA表达下调,TGF-β₁ mRNA表达进一步上调。结论:左归丸可能通过干预ERK/TGF-β/Smads信号级联而调控成骨细胞的增殖和分化,这可能是其防治骨质疏松症的机制之一。     

淫羊藿素通过雌激素受体和骨形态发生蛋白信号诱导MC3T3-E1 subclone 14细胞分化

目的: 观察淫羊藿素(ICT)对MC3T3-E1 subclone 14前体成骨细胞株增殖、分化的影响,以及雌激素受体(ER)和骨形态发生蛋白(BMP)信号在分化中的作用。方法: WST-8、BrdU法检测ICT对MC3T3-E1 subclone 14细胞活力和增殖的影响;ICI182780阻断ER受体信号后,检测ICT和noggin对MC3T3-E1 subclone 14细胞碱性磷酸酶(ALP)活性、I型胶原(Col I)和骨钙素(BGP)的影响;实时荧光PCR检测ICT对BMP-2、4、7 mRNA表达的影响;Western blotting检测ER受体信号阻断后,ICT对Smad1/5/8蛋白磷酸化的影响。结果: ICT(0.1 μmol/L、1 μmol/L)可以提高MC3T3-E1 subclone 14细胞ALP、Col I、BGP和矿化结节数量(P<0.01或P<0.05),表明ICT有促分化的作用,但对细胞活力和增殖指数无明显影响;阻断ER受体信号后,ICT促分化作用明显下降(P<0.01);ICT可以提高BMP-2、4 mRNA的表达(P<0.01),但对BMP-7 mRNA无作用(P>0.01);阻断ER信号后,ICT 促Smad1/5/8磷酸化明显减弱(P<0.01)。进一步阻断BMP/Smad信号可以抑制ICT促分化的作用(P<0.01)。结论: ICT可以通过ER受体激活BMP/Smad信号通路,进而促进MC3T3-E1 subclone 14细胞的分化。     

盐酸小檗碱通过PI3K/Akt信号通路促进小鼠前成骨细胞MC3T3-E1的分化

目的:研究盐酸小檗碱对小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1分化与矿化的调控作用及其机制。方法:MC3T3-E1细胞给予不同浓度(0、1、5、10和20 mg/L)的盐酸小檗碱刺激3 d,CCK-8法检测细胞活性。不同浓度的盐酸小檗碱分别干预3 d和7 d,检测细胞碱性磷酸酶(ALP)活性。进一步将实验随机分为4组:对照组、盐酸小檗碱组、盐酸小檗碱+LY249002(PI3K/Akt通路抑制剂)组及LY249002组。干预2 d后,采用real-time PCR检测成骨细胞分化相关因子ALP、骨钙素(OCN)、骨桥蛋白(OPN)及Runt相关转录因子2(Runx2)的mRNA表达情况,采用Western blot检测PI3K/Akt信号通路相关蛋白p-Akt的表达水平。将MC3TC-E1细胞用矿化培养基诱导21 d,茜素红染色检测其矿化情况。结果:与对照组相比,不同浓度的盐酸小檗碱对细胞活性的影响没有明显差异;不同浓度的盐酸小檗碱处理MC3T3-E1细胞后ALP活性有不同程度升高。Real-time PCR结果表明,盐酸小檗碱(5 mg/L)促进ALP、OCN、OPN及Runx2的mRNA表达(P 0. 01),而LY294002能抑制这些分化相关因子的表达。Western blot检测结果表明,盐酸小檗碱(5 mg/L)促进p-Akt蛋白的表达(P 0. 01),其作用被LY249002抑制。茜素红染色发现盐酸小檗碱组矿化明显,但LY294002能抑制盐酸小檗碱的促进作用。结论:盐酸小檗碱可以促进小鼠前成骨细胞的分化与矿化,其机制可能与其激活PI3K/Akt信号通路有关。     

高糖对成骨细胞MC3T3-E1凋亡和氧化应激的影响

目的评价高糖环境对成骨细胞MC3T3-E1凋亡和氧化应激的影响,为临床治疗糖尿病骨质疏松症提供实验基础。方法在细胞培养瓶中加入不同浓度高糖溶液(0、20、40、80 mmol/L)培养成骨细胞株MC3T3-E1,24 h后分别采用CCK-8测定其细胞存活率、细胞凋亡率,线粒体膜电位试剂盒测定其去极化程度,半胱天冬酶-3(Caspase-3)试剂盒检测其活性,DCFH-DA荧光探针检测ROS的生成。在80 mmol/L高糖环境暴露,MC3T3-E1细胞在抗氧化剂NAC作用下,采用上述方法测其线粒体膜电位和Caspase-3含量。结果与对照组相比,成骨细胞MC3T3-E1在高糖暴露下的存活率和线粒体膜电位下降,细胞凋亡率、细胞活性氧水平和Caspase-3活性增强,且都存在剂量依赖性;抗氧化剂NAC抑制高糖引起MC3T3-E1细胞线粒体膜电位降低和Caspase-3增高。结论高糖环境下,NAC通过抑制高糖引起的氧化应激,降低细胞凋亡率,保护成骨细胞MC3T3-E1。     

Caveolin-1介导流体剪切应力调控MC3T3-E1成骨细胞增殖和凋亡

背景：流体剪切应力在成骨细胞增殖和凋亡中起着重要作用。然而,Caveolin-1(Cav-1)是否参与成骨细胞中流体剪切应力诱导的增殖与凋亡过程尚不清楚。目的：探讨Cav-1在流体剪切应力调控成骨细胞增殖和凋亡中的作用。方法：选择生长状态良好的MC3T3-E1成骨细胞,加载不同时间(0,30,60,90 min)且强度为1.2 Pa的流体剪切应力,观察Cav-1蛋白的表达,筛选出时间为60 min的条件进行实验。将MC3T3-E1细胞分为：对照组、流体剪切应力组、流体剪切应力+pcDNA 3.1组(对照)、流体剪切应力+pcDNA Cav-1组(过表达质粒),分别采用流体剪切应力和过表达Cav-1等方式干预,通过q RT-PCR和Western blot检测MC3T3-E1细胞内增殖以及凋亡相关分子的表达量;通过CCK-8与Ed U实验检测MC3T3-E1细胞增殖活性;采用Hoechst 33258染色以及流式细胞术检测MC3T3-E1细胞凋亡情况。结果与结论：加载流体剪切应力后MC3T3-E1细胞中Cav-1的表达显著下调,且加载60 min表达水平最低。过表达Cav-1减弱了流体剪...     

OFSS抑制MC3T3成骨细胞对TNF-α的反应性

目的:研究OFSS对小鼠MC3T3成骨细胞TNF-α反应性的影响,为骨力学负荷的抗炎性骨丢失作用提供实验室证据。方法:利用特制的细胞OFSS加载实验装置,在应用TNF-α+CHX诱导MC3T3细胞凋亡之前或过程中,向细胞施加OFSS(10~12 dynes/cm2,1 Hz),观察细胞形态学变化、以及应用SDS-PAGE结合Western blot方法分析凋亡标志性蛋白和IκBα信号的变化,分析OFSS对MC3T3细胞TNF-α反应性的影响。结果:2 h OFSS预处理几乎完全抑制TNF-α诱导的Caspase-3激活和Parp降解,而且Caspase-3的上游关键分子Caspase-8的激活几乎完全抑制;细胞凋亡形态学变化被抑制;TNF-α诱导的IκBα磷酸化也被显著抑制,表明OFSS可作用于IκBα信号上游。此外,在TNF-α/CHX诱导凋亡2 h后开始施加OFSS仍可有效抑制caspase-8的激活、从而抑制细胞凋亡,提示OFSS还可能直接作用于凋亡诱导通路而发挥细胞保护作用。结论:OFSS抑制MC3T3成骨细胞的TNF-α反应性,可能减轻炎症性骨丢失,其作用机制可能涉及多个环节。     

Vaspin对HUVECs中TNF-α介导的NF-κB和PI3K/Akt信号通路的影响

目的探讨Vaspin对TNF-α介导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)NF-κB和PI3K/Akt信号通路的影响。方法体外分离并培养HUVECs。NF-κB荧光酶报告质粒瞬时转染HUVECs,用不同浓度(0~320μg/L)Vaspin预培养,随后用10μg/L的TNF-α作用于HUVECs,荧光酶报告分析法测定NF-κB的转录活性。Western blot测定磷酸化的Akt水平。ELISA测定细胞上清液中IL-1及IL-6的浓度。Real-time PCR、Western blot检测细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)及单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的mRNA和蛋白表达水平。结果在HUVECs中,Vaspin抑制TNF-α介导的NF-κB转录活性(P0.05),并且NF-κB下游因子IL-1、IL-6、ICAM-1、VCAM-1和MCP-1的表达降低(P0.05)。Vaspin增加了炎性因子TNF-α介导的磷酸化的Akt水平(P0.05)。结论 Vaspin抑制HUVECs中TNF-α介导的NF-κB信号通路,增强TNF-α介导的PI3K/Akt信号通路的传导。     

TRAF3抑制NF-κB引起的肾囊腔形成作用

目的:研究肿瘤坏死因子受体相关因子3(TRAF3)对多囊肾集合管上皮细胞中核因子κB(NF-κB)信号通路及其下游产物表达的影响;观察TRAF3基因过表达的多囊肾集合管上皮细胞形成管状分支结构的变化,探讨TRAF3在多囊肾囊腔形成的发生发展中可能产生的作用。方法:Western blot检测多囊肾集合管上皮细胞和TRAF3基因过表达多囊肾集合管上皮细胞中NF-κB信号通路的变化,同时检测下游凋亡因子Bax及Bid的表达及caspase-3活性变化;通过Annexin V-FITC/PI双染法检测各组细胞的凋亡情况;应用三维(3D)培养法观察多囊肾集合管上皮细胞形成管状分支结构变化的差异。结果:TRAF3的过表达能显著抑制多囊肾集合管上皮细胞中NF-κB信号通路的活性,使下游的Bax及Bid表达显著下调,细胞凋亡明显减少;TRAF3基因过表达多囊肾集合管上皮细胞管状分支结构较多囊肾集合管上皮细胞组明显增多。结论:TRAF3可能通过调节NF-κB信号通路降低Bax及Bid活性,抑制细胞凋亡,从而抑制多囊肾囊腔形成。     

miR-210-3p通过自噬调控MC3T3-E1细胞成骨分化的机制研究

目的:探讨微小RNA-210-3p(microRNA-210-3p, miR-210-3p)通过自噬对小鼠成骨细胞系MC3T3-E1成骨分化的影响。方法:(1)采用脂质体转染法构建miR-210-3p过表达或沉默的MC3T3-E1细胞模型,设置阴性对照(negative control, NC) mimic组、miR-210-3p mimic组、NC inhibitor组和miR-210-3p inhibitor组,Western blot、RT-qPCR和免疫荧光法检测MC3T3-E1细胞成骨分化相关指标及自噬相关指标的变化,茜素红染色法观察矿化结节形成情况。(2)用雷帕霉素(rapamycin, RAPA)和3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)分别构建自噬激活和抑制模型,设置control组、RAPA组和3-MA组,Western blot、RT-qPCR和免疫荧光法检测自噬激活或抑制后MC3T3-E1细胞成骨分化相关指标的变化,茜素红染色法观察矿化结节形成情况。(3)设置NC mimic组、NC mimic+RAPA组和miR-210-3p mimic+R...     

过表达SIRT1抑制脂多糖诱导的胰岛β细胞炎症因子表达及NF-κB信号通路激活

目的研究沉默信息调节因子1(SIRT1)对脂多糖(LPS)诱导的胰岛β细胞炎症因子表达及核因子-κB(NF-κB)信号通路激活的影响。方法用LPS处理胰岛β细胞,qRT-PCR和Western blot测定细胞中SIRT1表达变化。用pcDNA3.1-SIRT1慢病毒感染胰岛β细胞,qRT-PCR检测细胞中白细胞介素-6(IL-6)mRNA和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA表达水平,流式细胞术测定细胞凋亡变化,Western blot检测细胞中Bcl-2相关X蛋白(Bax)、活化型Caspase-3(cleaved Caspase-3)、核因子-κBp65亚型(NF-κBp65)、Toll样受体4(TLR4)蛋白表达水平。结果 LPS处理后的胰岛β细胞中SIRT1表达水平降低。pcDNA3.1-SIRT1慢病毒感染可以提高LPS条件下胰岛β细胞中SIRT1表达水平。LPS处理后的胰岛β细胞中IL-6 mRNA和TNF-αmRNA表达水平升高,凋亡率升高,细胞中Bax、Cleaved Caspase-3、NF-κBp65、TLR4蛋白表达升高。过表达SIRT1可以降低LPS条件下胰岛β细胞中IL-6 mRNA和TNF-αmRNA表达水平,抑制细胞凋亡,减少细胞中Bax、cleaved Caspase-3、NF-κBp65、TLR4蛋白表达。结论 SIRT1减少LPS诱导的胰岛β细胞炎症因子表达并下调细胞中NF-κB信号激活水平。