HSPC016的表达、纯化与生物学活性分析

目的:测定大肠杆菌中造血干细胞(hematopoietic stem/progenitor cells,HSPC)016融合蛋白的表达,纯化及其生物学活性。方法:采用PCR技术从pET-28a( )/HSPC016中扩增出目的基因HSPC016重组到质粒pET-22b( )中,转化BL21(DE3),IPTG诱导表达,镍离子亲和层析和分子筛法纯化;用胰蛋白酶消化对数期生长的第3代和第9代DPC,细胞记数法记录生长曲线。结果:原核表达载体pET-22b( )/HSPC016在大肠杆菌中高效表达,目的蛋白表达率约28%,纯化后纯度达95%以上;经重组蛋白处理的DPC增殖活跃;细胞记数结果初步证实HSPC016重组蛋白能促进第9代DPC的增殖及其DNA合成,对第3代DPC无明显作用。结论:HSPC016基因在大肠杆菌中得到了高效表达;HSPC016重组蛋白具有促进高传代DPC增殖的作用。     

腺病毒介导的p16~(INK4a)基因沉默对人毛乳头细胞的影响

目的利用RNA干扰技术探讨p16~(INK4a)对人毛乳头细胞(dermal papilla cell,DPC)的促进作用。方法将针对p16~(INK4a)基因设计的RNA腺病毒转染高传代DPC,观察细胞生长活性,电镜下观察细胞形态,western blot检测衰老相关蛋白β-半乳糖苷酶、pRb的表达。结果转染后细胞倍增时间缩短,细胞核分裂增多,高传代DPC中β-半乳糖苷酶、pRb蛋白较低传代DPC均上调,转染后两种蛋白的表达呈下降趋势。结论高传代DPC非凝集性生长与细胞过早性衰老有关,DPC的p16~(INK4a)基因沉默后可延缓DPC衰老,促进DPC增殖。     

血管生成素在人毛囊中的表达及其对毛发生长的影响

目的 探讨血管生成素在人毛囊中的表达及其意义。方法 分离完整的人生长期毛囊,提取总RNA,RT-PCR法检测血管生成素mRNA的表达,同时应用免疫组化法检测血管生成素蛋白在人毛囊中的表达。在此基础上,在体外培养的人毛囊中加入不同浓度的重组人血管生成素（0 ～ 200 ng/mL）,培养6 d后测量毛囊的生长长度。利用两步酶法分离培养人毛乳头细胞,加入不同浓度的重组人血管生成素（0 ～ 200 ng/mL）,48 h后,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期。结果 RT-PCR显示人毛囊表达血管生成素mRNA,免疫组化法发现人毛囊的毛乳头和真皮鞘表达血管生成素蛋白。25 ～ 200 ng/mL重组人血管生成素呈浓度依赖性促进体外培养的人毛囊生长（P < 0.05）,而12.5 ～ 200 ng/mL重组人血管生成素能够明显促进体外培养的人毛乳头细胞增殖（P < 0.05）。流式细胞仪检测12.5 ～ 200 ng/mL重组人血管生成素能够显著增加S期细胞比率和细胞增殖指数（P < 0.05）。结论 血管生成素可能是一种促进毛发生长的因子。     

毛囊各细胞体外的不同分离、培养及其生物学特性

目的进行毛囊各主要生长细胞的体外分离、培养及生物学特性的观察。方法对人头皮毛囊组织进行体外钝行分离、组织块法及酶消化来获得毛囊外根鞘细胞（ORSC）、毛乳头细胞（DPC）、毛囊真皮鞘细胞（DSC）,利用不同的体外培养条件分别对这三种细胞进行体外增殖培养,利用倒置显微镜及免疫组化的方法对细胞来源和生长特性进行观察。结果组织块法培养的上、下段毛囊：上段毛囊来源的ORSC增殖生长速度较下段毛囊ORSC快;酶消化法分离得到的ORSC,利用K-SFM培养液进行培养,整体细胞生长呈典型的“铺路石”样结构,可传4代;酶消化法分离得到的DSC,利用10％～15％低糖培养液进行培养,单个细胞生长状态呈长三角形,可传三代;经酶消化法,每3cm&#215;3cm大小的头皮可以获得约500个完整毛乳头,利用10％～15％低糖培养液进行DPC培养,细胞由毛乳头边缘向四周呈放射状生长,成功传代8代,四代内的细胞“聚集性”生长状态明显。免疫组化细胞鉴定：ORSC CK19免疫组化染色呈阳性;DPC浆抗波形丝蛋白呈阳性显色;DSC胞浆内高表达波形丝蛋白。结论组织块法证明毛囊上段细胞生长情况更为活跃,再次验证毛囊干细胞可能存在于毛囊上段“隆突部”的假说;经钝行分离和酶消化法结合的方法来进行人头皮毛囊相关细胞的分离和培养,所获得三种细胞的细胞活性、生长增殖情况均较好,细胞鉴定证实细胞来源的可靠性。     

无血清培养基培养人毛乳头细胞的研究

目的 探讨无血清培养液培养人头皮毛乳头细胞(dermal papillae cells,DPC)的可行性,并研究其生长特性。方法 预先应用纤维连接蛋白处理细胞培养瓶(板);采用Williams E无血清培养液并补充ITS(牛胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸盐)培养第2代DPC,倒置相差显微镜下观察细胞生长状态,采用MTT评价其增殖状态并绘制其生长曲线。结果 在无血清培养条件下,DPC在2～4h内贴壁。2～3d后细胞可相互融合.未见细胞明显增殖;培养4d后细胞连接开始中断。形成孤立的细胞或细胞团,并可见细胞的脱落;培养1～2周后,细胞大多脱落。给予含4%小牛血清的DMEM培养10h后,在残余的细胞团周围长出放射状排列的细胞;生长曲线显示DPC的生长呈现停滞期和缓慢生长期,未见指数生长期。结论 采用无血清培养基可以培养DPC,但其培养条件有待优化。     

β-溶血型链球菌诱发银屑病发病机理探讨

探讨β-溶血性链球菌诱发银屑病的机制。采用3H-TdR掺入法测定细胞增殖反应,AnnexinV法测定细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞表面抗原表达。结果显示β-溶血性链球菌(SP)刺激淋巴细胞活化增殖,经SP活化的淋巴细胞培养上清液作用于角质形成细胞48h,可促进角质形成细胞增殖,诱导角质形成细胞表达HLA-DR和Fas抗原;再次加入上清液继续作用48h,则诱导角质形成细胞凋亡。SP作为超抗原首先活化T细胞,使之释放细胞因子,后者使角质形成细胞活化增殖,表达和抗原,继而诱导细胞凋亡,此过程可能是银屑病的主要发病机制之一。     

雄激素受体基因腺病毒载体的构建及对人毛乳头细胞增生的影响

目的检测未转染的毛乳头细胞第3、6、9代雄激素受体(androgen receptor,AR)蛋白的表达;构建及鉴定AR基因过表达的腺病毒载体,将其转染进入人毛乳头细胞(dermal papilla cell,DPC),探讨AR基因对人DPC增生的影响。方法应用基因同源重组获得p Adeasy-Adtrack-AR重组腺病毒质粒,腺病毒感染人DPC,采用蛋白质印迹法(Western blot)检测AR的表达,应用CCK-8法检测人DPC的增生。结果未转染前,DPC的AR表达量随着传代逐渐降低;成功构建了AR基因腺病毒载体,腺病毒转染人DPC 48 h后AR蛋白高表达,腺病毒转染24、48、72 h对人DPC的增生无影响。结论人DPC过表达AR基因模型为进一步研究雄激素性脱发提供了一定的实验基础。     

精氨酸对人毛乳头细胞增殖的影响

目的:探讨精氨酸对体外培养的人毛乳头细胞(DPC)增殖的影响.方法:选择不同浓度(0.1、0.5、2.5、12.5及62.5 mmol/L)的精氨酸作用于体外培养的DPC 48 h,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、流式细胞凋亡技术,测定精氨酸对DPC增殖的影响,用PCR技术测定其对血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、5α-还原酶(SRD5A)、雄激素受体(AR)及雌激素受体(ER)的影响.结果:精氨酸浓度为0.1 mmol/L时,明显促进DPC增殖,与对照组比较有统计学意义;当浓度为0.5 mmol/L时,其对DPC的促增殖作用最强.当精氨酸浓度为12.5 mmol/L时,其对DPC的增殖表现为抑制作用.结论:精氨酸对DPC增殖有明显影响,适当浓度的精氨酸能显著促进DPC分泌VEGF、FGF、ER,抑制AR、SRD5A,可能是通过影响相关细胞因子的分泌从而调节毛发生长.     

金黄色葡萄球菌性超抗原诱发银屑病发病机理探讨

目的探讨金黄色葡萄球菌性超抗原诱发银屑病的机制。方法3H-TdR掺入法测定细胞增殖反应,亚二倍体细胞含量测定,片段化DNA分析,膜联蛋白V(AnnexinV)法测定细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞表面抗原表达。结果金黄色葡萄球菌肠毒素B活化的淋巴细胞培养上清液作用于角质形成细胞48h,可促进角质形成细胞增殖,诱导角质形成细胞表达HLA-DR和Fas抗原;再次加入上清液继续作用48h,则诱导角质形成细胞凋亡（P<0.01）。结论金黄色葡萄球菌肠毒素B作为超抗原活化T细胞,使之释放细胞因子,后者使角质形成细胞首先活化增殖,继而凋亡。     

rhFGF-7对体外培养人皮肤角质形成细胞增殖的影响

目的建立一种人皮肤角质形成细胞分离和培养的方法,研究重组人成纤维细胞生长因子7(rhFGF-7)对人皮肤角质形成细胞增殖的影响。方法取环切术后包皮,分别用胰酶和dispaseⅡ酶消化法分离表皮,用无血清培养基进行无滋养层培养,采用免疫细胞化学方法对培养的细胞进行鉴定,并用细胞计数法测定细胞的生长曲线,MTT法检测rhFGF-7对人皮肤角质形成细胞增殖的影响。结果与胰酶消化分离表皮相比,dispaseⅡ酶消化获得的表皮,其细胞贴壁率高,增殖速度快,且成纤维细胞污染少;荧光显微镜下细胞胞浆呈黄绿色,为角蛋白阳性染色;培养的角质形成细胞可持续增殖至第8代,10ng/mL的rhFGF-7促角质形成细胞增殖作用最显著。结论所建立的人皮肤角质形成细胞分离和培养方法,可获得高纯度的人皮肤角质形成细胞,rhFGF-7可促进体外培养人皮肤角质形成细胞的增殖。     

甘草提取物对人毛乳头细胞增殖和分泌血管内皮生长因子的影响

目的：观察甘草提取物对体外培养的人毛乳头细胞增殖和分泌血管内皮生长因子（VEGF）的影响。方法：采用不同浓度的甘草提取物作用于体外培养的人毛乳头细胞72h,用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定细胞增殖活性;ELISA法检测细胞培养上清液中VEGF蛋白含量,反转录（RT）-PCR半定量检测细胞中VEGF mRNA表达。结果：与对照组相比,甘草提取物对毛乳头细胞增殖无明显影响;加药组浓度为2．5、5．0、10．0、15．0μg／mL时,甘草提取物促进细胞分泌VEGF,增加细胞内VEGF mRNA表达,差异有统计学意义。结论：甘草提取物对毛乳头细胞增殖无明显影响,但能显著促进毛乳头细胞分泌VEGF,甘草提取物可能是通过增加毛乳头细胞分泌VEGF来促进毛发生长的。     

表没食子儿茶素没食子酸酯对体外培养的人毛囊生长和毛乳头细胞增殖的影响

目的 研究表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对体外培养的人毛囊生长和毛乳头细胞增殖的影响。方法 显微分离人毛囊，在加入不同质量浓度EGCG （0 ~ 250 mg/L）的Williams E培养基中培养，观察毛囊生长情况；利用两步酶法分离培养人毛乳头细胞，加入不同质量浓度的EGCG （0 ~ 500 mg/L），48 h后，利用噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞周期。结果 与空白对照组比较，0.1，1 mg/L的EGCG对体外培养的毛囊生长有明显促进作用（P < 0.05）；MTT显示15.6，31.2， 62.5 mg/L的EGCG能够明显促进毛乳头细胞的增殖（P < 0.05）；流式细胞仪检测7.8，15.6，31.2和62.5 mg/L的EGCG作用48 h后，S期和G2/M期细胞比率明显增加，G0/G1期细胞比率明显减少，细胞增殖指数明显增加（由5.25％增至5.64％，14.61％，32.51％，37.35％），细胞增殖指数与EGCG浓度呈显著正相关（r = 0.933）。结论 一定浓度的EGCG能够促进体外培养的人毛囊生长及人毛乳头细胞增殖。     

黄芩苷对人毛囊生长和毛乳头细胞分泌血管内皮生长因子的影响

目的 探讨黄芩苷对体外培养的人毛囊生长、毛乳头细胞增殖和分泌血管内皮生长因子(VEGF)的影响.方法 选择不同浓度黄芩苷作用于体外培养的人头皮毛囊8天,观察人毛囊生长及形态变化:作用于人毛乳头细胞72h,四甲基偶氮唑监(MTF)法测定细胞增殖活性,ELISA法检测细胞分泌的VEGF水平.结果 7.5.15,30,45μg/mL的黄芩苷对体外培养的人头皮毛囊有明显促生长作用;3.75,7.5,15,30μg/mL的黄芩苷对毛乳头细胞增殖无明显影响,但促进细胞分泌VEGF,与阴性对照组相比,差异有统计学意义.结论 黄芩苷促进体外培养的人头皮毛囊生长,部分可能是通过增加毛乳头细胞分泌VEGF促使毛发生长.     

复方甘草酸苷注射液对B16鼠黑素瘤细胞黑素生成的影响

目的：研究复方甘草酸苷注射液对B16鼠黑素瘤细胞黑素的影响及其机制。方法：通过CCK8、流式细胞术、NaOH裂解法、多巴氧化法和Western-blotting技术检测复方甘草酸苷对B16鼠黑素瘤细胞生长,黑素合成与转运及酪氨酸酶活性和蛋白含量的影响。结果：(1) 复方甘草酸苷注射液浓度低于30μl/ml,对B16鼠黑素瘤细胞生长无明显影响;浓度大于50μl/ml,细胞生长速率减慢;浓度达到500μl/ml,细胞生长明显受抑制。(2) 浓度在10μl/ml到200μl/ml之间,黑素的合成和酪氨酸酶的活性均增加。黑素的合成在复方甘草酸苷注射液浓度为50μl/ml时增加最明显;且酪氨酸酶活性呈浓度依赖性增加,在浓度为100μl/ml和150μl/ml时达到最高。结论：复方甘草酸苷注射液有促进黑素瘤细胞黑素的合成与转运及增加酪氨酸酶活性的作用。     

拉坦前列素对人毛乳头细胞增殖及分泌血管内皮细胞生长因子的影响

目的:观察拉坦前列素对培养的人毛乳头细胞增殖及其分泌血管内皮细胞生长因子(VEGF)的影响。方法:选择0.16、0.80ng/mL和0.004、0.020、0.100μg/mL5个浓度的拉坦前列素作用于体外培养的人毛乳头细胞72h,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞增殖活性,ELISA法检测细胞分泌的VEGF水平。结果:与对照组相比,拉坦前列素对毛乳头细胞增殖无明显影响;加药组药物浓度达0.80ng/mL时细胞分泌的VEGF水平明显升高,差异具有显著性,且升高水平与药物浓度之间呈剂量依赖关系。结论:拉坦前列素对毛乳头细胞增殖无明显影响,但能显著促进毛乳头细胞分泌VEGF,可能是通过VEGF促进毛发生长。     

Ag85B真核表达载体的构建及其生物活性的研究

目的:研究Ag85B蛋白促PPD 人外周血单个核细胞的增殖活性。方法:用PCR技术扩增Ag85B基因,构建重组pcDNA3-Ag85B,并将其转染B16细胞株,用RT-PCR鉴定阳性细胞克隆,用Westernblotting鉴定其在阳性细胞克隆内的表达,用3H-TdR掺入法来检测Ag85B的促增殖活性。结果:获得了阳性B16细胞克隆,并鉴定在阳性细胞克隆内有Ag85B成熟蛋白表达;此阳性细胞克隆对PPD 人的PBMC具有较明显地促PBMC增殖活性。结论:转染了pcDNA3-Ag85B的B16阳性细胞克隆对PPD 人的PBMC具有较明显地促PBMC增殖活性,为Ag85B诱发抗肿瘤免疫应答及其机制的研究奠定了基础。     

人毛乳头细胞条件培养基对毛乳头细胞的作用

目的:研究人毛乳头细胞条件培养基对高传代人毛乳头细胞的生物作用。方法:通过体外培养低传代的人毛乳头细胞,收集其上清配制成条件培养基,用此条件培养基培养高传代人毛乳头细胞,观察其细胞的3H-TdR计数值及细胞超微结构的变化。结果:用低传代人毛乳头细胞上清液培养过的高传代人毛乳头细胞3H-TdR计数值明显高于对照组(P<0.01)。在电镜下可见高传代人毛乳头细胞核糖体丰富、内质网分泌成池。结论:低传代人毛乳头细胞条件培养基有明显促进高传代人毛乳头细胞活性的作用。     

条件培养基对高传代人毛乳头细胞生长的影响

目的 研究人毛乳头细胞条件培养基的生物学活性。方法 通过体外培养低传代人毛乳头细胞,收集其基础培养基的上清液配制成条件培养基,用于培养高传代人毛乳头细胞,观察细胞形态及细胞生长曲线的变化;同时观察高传代人毛乳头细胞与低传代人毛乳头细胞共培养情况。结果 低传代条件培养基使高传代人毛乳头细胞出现了凝集生长现象,其生长曲线显著优于基础培养基培养的高传代毛乳头细胞(P<0.01),其细胞的3H鄄TdR测定值亦显著升高(P<0.01)。高传代人毛乳头细胞与低传代人毛乳头细胞共培养后出现凝集性生长趋势。结论 低传代人毛乳头细胞在培养状态下可分泌具有明确生物学活性的物质。