用PCR制备地高辛精标记的单链探针进行原位杂交

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法制备地高精标记的单链探针，用以原位检测低丰度的β肾上腺素能受体ＭＲＮＡ在大鼠肺组织中扮布。结果表明本方法制备的探针的检测敏感性显著高于用随机引物法标记的双链探针。已克隆于载体的ＣＤＮＡ或ＲＴ－ＰＣＲ产物均可作为模板合成单链探针，江ＤＡＴＰ、ＤＣＴＰ、ＤＧＴＰ浓度各为２００μｍｏｌ／Ｌ，ｄＴＴＰ＋Ｄｉｇ－ｄＵＴＰ浓度降至５０－７５ μｍｏｌ／Ｌ，扩增产量无显著变化，ｄＴＴ     

应用地高辛标记的cRNA探针原位杂交检测胰岛素mRNA

成年雄性Ｗｉｔａｒ大鼠，用地高辛标记的ｃＲＮＡ探针在胰腺切片上进行原位杂交，以检测胰岛Ｂ细胞胰岛素基因表达产物ｍＲＮＡ；同时并用免疫组织化学法显示相邻切片胰岛素免疫反应阳性细胞，进行比较，胰腺经４％多聚甲醋灌注固定，经Ｂｏｕｉｎ液再固定２０ｈ，常石蜡包埋和切片，经胰岛素ｃＲＮＡ探针杂交的胰腺切片中胰岛Ｂ细胞和核仁呈阳性反应，阳性信号为蓝色颗粒，胰岛其他细胞及胰腺泡细胞为阴性，方法照切片中均无阳性信     

地高辛标记cDNA探针组织及细胞mRNA原位杂交技术

地高辛标记ｃＤＮＡ探针组织及细胞ｍＲＮＡ原位杂交技术＊杜卫东周晓虹马学玲吴浩翟为溶张月娥＊国家自然科学基金重点项目和国家教委博士点专项基金资助课题作者单位：上海医科大学病理学教研室２０００３２（第一作者现工作单位：中国科学院上海生理研究所２０００３１...     

地高辛标记的大鼠nNOS mRNA探针的制备和应用

目的　制备大鼠神经元型一氧化氮合酶 (neuronalnitricoxidesynthase,nNOS)地高辛 (digoxigenin)标记的RNA探针 ,探讨nNOS在脊髓中的表达定位。方法　采用RT PCR方法 ,从大鼠脑组织中扩增nNOS基因mRNA部分片段 ,并经序列测定。以dig nNOSmRNA为探针 ,采用原位杂交观察成年大鼠脊髓组织中nNOSmRNA表达。结果　RT PCR法扩增出一特异产物与预期长度 2 4 0bp相符 ,T载体克隆测序与nNOS基因 10 0 %同源。原位杂交结果显示阳性信号出现在成年大鼠脊髓组织中。结论　采用RT PCR和T载体技术获得了大鼠脑组织nNOS基因克隆 ,dig nNOSmRNA探针原位杂交显示正常SD大鼠腰段脊髓组织中表达nNOSmRNA。     

地高辛标记的血小板T细胞活化抗原1cRNA探针的制备与鉴定

目的制备用地高辛 (digoxigenin ,Dig)标记的血小板T细胞活化抗原1(plateletandTcellactivationantigen1,PTA1)cRNA探针。方法构建重组质粒 pGEM 3ZF( ) PTA1 ,并做序列分析证实PTA1基因的插入方向正确后 ,用EcoRI消化得到线性DNA片段 ,再用SP6RNA聚合酶转录合成带有Dig标记的高比活度的单链cRNA探针。结果经斑点杂交证实 ,该探针敏感性高、特异性强。结论地高辛标记PTA1cRNA探针的制备 ,为进一步研究PTA1mR NA在组织、细胞的表达和分布提供了有效的工具。     

地高辛标记的大鼠NGF RNA探针的制备和应用

制备用地高辛标记的神经生长因子(NGF)的RNA探针并用其研究NGF在海马组织中的表达。设计NGF引物,构建NGF/pGEMT重组质粒,分别用ApaⅠ和SacⅠ进行酶切得到线性化DNA片段,以Sp6和T7聚合酶转录合成酶合成地高辛标记的(dig)正、反义RNA探针。运用点膜杂交的方法检测探针的敏感度;运用该探针的原位杂交法分析NGF在海马中的表达。本研究成功地构建了NGF/pGEMT质粒,获得了正、反义digNGFRNA探针,并应用该探针在海马中观察到NGFmRNA的表达。本研究的结果为深入探讨NGF在海马发育和损伤过程中的表达奠定了基础。     

地高辛标记大鼠下丘脑生长激素释放因子cRNA探针的制备及应用

制备地高辛标记大鼠下丘脑释放因子ｃＲＮＡ探针；方法；大鼠下丘脑生长激素释放因子的重组质粒ｃＤＮＡ＝ＰＧＥＭ４经转化扩增后，用碱性裂妥法获取质粒ｃＤＮＲ并纯化。用限制性内切酶ＥＣＯＲＩ酶切，以线性ｃＤＮＡ为模板，在Ｔ７和Ｓｐ６ＲＮＡ聚合酶作用下，采用体外转录法分别合成地高辛素标记的大鼠下丘脑生激素释放因子ｃＲＮＡ和ＲＮＡ探针。     

地高辛标记的大鼠p75 RNA探针的制备和应用

目的制备用地高辛标记的神经生长因子低亲和力受体(p75)的RNA探针.研究p75在海马组织中的表达.方法设计p75引物,构建p75/pGEM-T重组质粒,分别用ApaⅠ和Sac Ⅰ进行酶切得到线性化DNA片段,以Sp6和T7聚合酶转录合成酶合成地高辛标记的(dig-)正反义RNA探针.运用点膜杂交的方法检验探针的敏感度,运用该探针,通过原位杂交分析p75在海马中的表达.结果构建了p75/pGEM-T质粒,获得高效价的正、反义dig-p75 RNA探针,应用该探针发现p75 mRNA在海马中的表达.结论成功制备了地高辛标记的p75RNA探针,为进一步研究p75在海马中发育和损伤过程中的表达打下基础.     

地高辛标记的血小板T细胞活化抗原在cRNA探针的制？…

目的 制备用地高辛标记的血小板Ｔ细胞活化抗原１ｃＲＮＡ探针。方法 构建重组质粒ｐＧＥＭ－３ＺＦ（＋）－ＰＴＡ１,并做序列分析证实ＰＴＡ１基因的插入方向正确后,用ＥｃｏＲＩ消化得到线性ＤＮＡ片段,再用ＳＰ６ＲＮＡ聚合酶转录合成带有Ｄｉｇ标记的高比活度的单链ｃＲＮＡ探针。结果辛标记ＰＴＡ１ｃＲＮＡ探针的制备,为进一步研究ＰＴＡ１ｍＲＮＡ在组织、细胞的表达和分布提供了有效的工具。     

地高辛精标记RNA探针原位杂交的简便方法

用地高辛精标记ＴＨ基因合成ＲＮＡ探针，在冰冻组织切片上进行原位杂交，通过碱性磷酸酶催化的呈色反应，检测在基因治疗帕金森病大鼠动物模型研究中酪氨酸羟化酶基因在脑内的表达。实验结果表明，简化原位杂交方法可适应于任何实验室。     

地高辛标记探针原位杂交法检测肝病患者外周血单个核细胞中TTV-DNA

为检测肝病患者外周血单个核细胞(PBMC)中TTV-DNA(输血传播病毒脱氧核糖核酸), 以TTV ORF1为模板, 应用地高辛(Dig)作为标记物, 经聚合酶链反应(PCR)制备探针, 建立原位杂交方法进行检测.结果显示: 血清TTV-DNA阳性组, 双链探针检测PBMC中TTV-DNA, 阳性检出率为58.06%(18/31); 血清TTV-DNA阴性组, 双链探针检测PBMC中TTV-DNA, 阳性检出率为27.59%(8/29).双链探针阳性者, 再以负链探针检测其复制情况, 阳性率为22.2%(4/18). 结论: TTV可感染PBMC并在PBMC中复制.     

应用荧光原位杂交技术检测卵巢浆液性囊腺癌中ZNF217基因拷贝数

目的探讨锌指蛋白217（zinc finger protein 217，ZNF217）基因在卵巢浆液性囊腺癌中20号染色体基因拷贝数改变情况及其临床意义。方法应用荧光原位杂交技术及LSI ZNF217探针对2种卵巢癌细胞株SKOV3、HO-8910和23例卵巢浆液性囊腺癌、10例浆液性囊腺瘤及7份正常卵巢组织进行检测。结果两种卵巢癌细胞株及12例卵巢癌出现ZNF217基因扩增，浆液性囊腺瘤有1例发生了基因的扩增，其余的及正常卵巢组织未出现基因扩增，卵巢癌与卵巢浆液性囊腺瘤、正常卵巢细胞相比较，ZNF217基因拷贝数改变差异有统计学意义（P〈0．05），而低分化的卵巢癌比高分化发生ZNF217基因扩增的几率明显增高（P〈0．05），Ⅲ～Ⅳ期比Ⅰ期的卵巢癌ZNF217基因拷贝数明显增多（P〈0．05）。结论ZNF217基因很可能是卵巢癌发生的促进因子之一，并与卵巢癌分化及预后不良有关。     

Identification of herpes simplex virus infection by immunoperoxidase and in situ hybridization methods

Summary Seven cases of visceral herpes simplex virus (HSV) infection were observed in five cases of hematopoietic disease and in one case each of a newborn baby and a pregnant woman. These seven cases were studied with an immunoperoxidase method and in situ hybridization. In HSV lesions of squamous epithelium, the immunoperoxidase method using rabbit anti-human HSV revealed positive staining, mainly in the nucleus but with some cytoplasmic staining. DNA in situ hybridization revealed stronger positive staining in the nucleus. In HSV hepatitis positive staining was seen in the nucleus and cytoplasm, both by immunoperoxidase and in situ hybridization methods. In the newborn baby, HSV lesions were observed in the brain only, with numerous positive astrocytes identified by the immunoperoxidase method and a few positive astrocyte nuclei by in situ hybridization. Cultured human fetal fibroblasts from the lung were infected with HSV. The immunoperoxidase method revealed diffuse positive staining in the nucleus and in the cytoplasm whereas in situ hybridization revealed fibrillar positive staining in the nucleus only. Thus, the immunoperoxidase method using rabbit antihuman HSV can detect the presence of HSV protein more sensitively than in situ hybridization, probably because of the greater quantity of HSV protein compared with HSV DNA in infected cells.     

甲状腺过氧化物酶mRNA cRNA探针的构建及意义

目的 探讨甲状腺过氧化物酶(thyroperoxidase,TPO)mRNA cRNA探针的构建及原位表达的检测方法 和意义.方法 取甲状腺结节新鲜组织,在RT-PCR扩增TPO cDNA的基础上,构建pSPT19-TPO质粒,经Hind Ⅲ和BamHⅠ单酶切后成线性化模板,在SP6和T7 RNA聚合酶作用下,体外转录合成地高辛标记的TPO cRNA反义和正义探针,进行TPO mRNA的原位杂交实验.结果 TPO mRNA阳性杂交信号分布于甲状腺滤泡细胞的胞质,本组腺瘤2例、结节性甲状腺肿4例、瘤周甲状腺组织1例原位杂交阳性,乳头状癌2例、桥本病1例原位杂交阴性.核酸原位杂交和RT-PCR检测甲状腺组织TPO mRNA的表达,结果 一致.结论 成功构建甲状腺过氧化物酶mRNA 的cRNA探针;检测TPO mRNA是一种较准确反映甲状腺组织TPO状态的方法 ,TPO mRNA的原位检测可结合组织形态学了解甲状腺滤泡细胞的功能表达状况.     

分子杂交法研究肝炎病人血清和肝组织中输血传播病毒

目的 对各型肝炎病人血清和肝组织中输血传播病毒（TTV）核酸检测分析,探讨病毒的致病性。方法 以地高辛为标记物制备TTV DNA探针,斑点杂交法、原位杂交法分别检测血清中及肝组织中TTV DNA。结果 检测103例血清,TTV总阳性率为25．24％（26／103）;甲－戊型肝炎组检出率21．81％（12／55）、非甲－非庚型患者检出率47．37％（9／19）,显著高于正常对照组15％（3／20）。临床可见TTV的单独感染和重叠感染;出现急性、慢性甚至重度肝损伤。12 肝组织可见TTV阳性,阳性颗粒主要见于肝细胞核内。结论 从血清和肝组织证实了TTV的存在,提示这种病毒可能是导致肝脏炎症的一种新病原。     

生物素标记探针原位杂交法检测细胞中c-myc基因的表达

本文采用生物素标记的c-mye基因作探针，通过细胞原位分子杂交技术，对人舌癌、膀胱癌和正常细胞中c-myc基因的转录量进行了定性和半定量分析。结果表明与正常细胞相比，舌癌和膀胱癌细胞中c-myc基因异常高度表达。     

The utility of in situ--based methodologies including in situ polymerase chain reaction for the diagnosis and study of viral infections

Molecular in situ-based assays are a useful adjunct to the diagnosis of viral infections by the surgical and cytopathologist. In some cases, the viral nucleic acids and/or proteins are abundant and easily detected by in situ hybridization or immunohistochemistry. In other cases, such as the one integrated provirus typical of latent retroviral localization, in situ polymerase chain reaction amplification is required to localize the virus in the intact cell. Direct correlation of viral localization and the histologic changes will demonstrate in many cases that routine histopathology often does not provide sufficient information to determine what specific cells are infected and/or the number of infected cells in a given biopsy. By combining this information with, for example, cytokine localization, one can elucidate much about the pathophysiology of the viral infection that cannot be afforded by polymerase chain reaction-based methods alone.     

In situ fluorescence hybridization of Y translations: cytogenetic analysis using probes Y190 and Y431

Two moderately repetitive DNA probes (Y190 and Y431) and a fluorescent in situ hybridization technique, using a biotin, avidin, anti-avidin system, were employed to investigate a group of patients with Y chromosome abnormalities. In normal male subjects, a bright fluorescent spot could be detected in cells in interphase and on the short arm of the Y chromosome in metaphase spreads. Translocations of DNA fragments of the short arm of the Y chromosome to autosomes 10, 13 and 15 were observed in five patients. In a 45,XX male subject the translocation involved one of the X chromosomes. With this in situ hybridization procedure, bright fluorescent spots were also noticed in uncultured amniotic cells and chorionic cellular elements from male fetuses, thus allowing a rapid and reproducible approach to prenatal fetal sexing.     

横纹肌肉瘤中MDM2及p53基因表达的原位杂交检测

目的观察ＭＤＭ２、ｐ５３癌基因在横纹肌肉瘤（ＲＭＳ）发病中的作用及其与临床病理、预后间的关系。方法对确诊并有随访的３１例ＲＭＳ标本,用原位杂交技术进行ＭＤＭ２、ｐ５３定位观察。结果发现ＭＤＭ２及ｐ５３癌基因表达阳性率分别为７７４％（２４／３１例）和６６７％（２１／３１例）,其阳性率与年龄、性别和ＲＭＳ组织类型无明显关联（Ｐ＞０．０５）,但阳性率及其强度与ＲＭＳ分化程度（Ⅰ级与Ⅲ级）,转移与否及存活率差异有显著性（Ｐ＜０．０５）。结论ＭＤＭ２、ｐ５３阳性检出率有助于判断ＲＭＳ恶性程度及预测肿瘤的转移和预后。     

应用引物原位标记技术快速检测SOX2基因

目的 应用引物原位标记(primed in situ labeling,PRINS)代替荧光原位杂交技术对SOX2基因进行快速检测.方法 常规制备人外周血染色体并制片,利用SOX2基因特异性引物在染色体上原位扩增包含生物素标记的探针.用酪胺信号放大(tyramide signal amplification,TSA)生物素系统处理经标记的探针.最后用链霉亲和素-德克萨斯红(streptavidin-Texas red)对生物素信号进行荧光染色,用DAPI染料对染色体进行复染.作为对照,MCF-10F细胞用慢病毒载体转染导人SOX2基因,使用相同的方法检测结合位点.结果 VideoTesT-FISH软件分析提示,实验组3号染色体长臂端有特异红色荧光信号表达,空白组与未经TSA信号处理的对照组则无特异性的红色荧光信号.经过转染的MCF-10F细胞则表现出不同的SOX2基因整合效果.结论 PRINS技术利用高敏感度的原位PCR技术(in situ PCR)结合荧光标记的脱氧核苷酸可在细胞内原位合成形成探针,可大大减少探针的费用与检测的时间,提高检测效率.在诱导多能干细胞的鉴定与分类中具有较为广泛的应用前景.