小干扰RNA对肾癌786-O细胞Survivin表达及其增殖的抑制作用

目的 观察小分子干扰RNA(siRNA)对人肾癌细胞Survivin基因表达及其增殖、凋亡的影响.方法 设计、合成1对Survivin编码基因序列特异的siRNA,用脂质体包裹转染人肾癌786-O细胞,分不同浓度组(10、50、100 nmol/L),采用逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot技术检测Survivin mRNA及蛋白表达,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖,免疫组织化学TUNEL法榆测细胞凋亡.结果 Survivin siRNA能有效下调Survivin基因表达水平,抑制了细胞生长,促进其凋亡.并呈剂量依赖性(3组的mRNA 88.3%、62.4%、43.8%,蛋白87.7%、62.4%、46.5%,增殖抑制率11.6%、41.2%、57.5%,凋亡率14.2%、29.4%、38.1%),差异有统计学意义(P<0.05).结论 Survivin基因siRNA能抑制人肾癌786-O细胞Survivin基因表达,进而抑制其增殖,促进其凋亡.     

小干扰RNA对肾癌786-O细胞Survivin表达及其增殖的抑制作用

目的 观察小分子干扰RNA(siRNA)对人肾癌细胞Survivin基因表达及其增殖、凋亡的影响.方法 设计、合成1对Survivin编码基因序列特异的siRNA,用脂质体包裹转染人肾癌786-O细胞,分不同浓度组(10、50、100 nmol/L),采用逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot技术检测Survivin mRNA及蛋白表达,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖,免疫组织化学TUNEL法榆测细胞凋亡.结果 Survivin siRNA能有效下调Survivin基因表达水平,抑制了细胞生长,促进其凋亡.并呈剂量依赖性(3组的mRNA 88.3%、62.4%、43.8%,蛋白87.7%、62.4%、46.5%,增殖抑制率11.6%、41.2%、57.5%,凋亡率14.2%、29.4%、38.1%),差异有统计学意义(P<0.05).结论 Survivin基因siRNA能抑制人肾癌786-O细胞Survivin基因表达,进而抑制其增殖,促进其凋亡.     

小干扰RNA对肾癌细胞Ki67基因表达及其增殖的抑制作用

目的探讨小干扰RNA(siRNA)对人肾癌细胞增殖基因Ki67表达及其增殖、凋亡的影响。方法将Ki67 siRNA(100 nmol/L)转染人肾癌786-0细胞。采用RT-PCR、免疫印迹、免疫组化技术检测Ki67 mRNA及蛋白表达,MTT法检测细胞增殖,免疫组化TUNEL法检测细胞凋亡。结果Ki67 siRNA处理组786-0细胞Ki67 mRNA表达(37．6±1．9)%、Ki67蛋白表达(46．4±0．9)%、免疫组化Ki67表达吸光度(A)值52．5±2．3,阴性siRNA对照组分别为(97．3±0．9)%、(95．3±0．9)%、114．5±4．9,2组比较差异均有统计学意义(P＜0．01)。Ki67 siRNA处理组细胞增殖抑制率(63．6±1．6)%、凋亡细胞阳性率(41．7±0．6)%,阴性siRNA对照组分别为(2．8±0．2)%、(10．3±1．4)%,2组比较差异有统计学意义(P＜0．01)。结论肿瘤增殖基因Ki67 siRNA能抑制人肾癌786-0细胞Ki67基因表达,进而抑制其增殖,促进其凋亡,有望成为肾癌基因治疗的有效工具。     

增殖及非增殖腺病毒载体介导的RNA干扰对肾癌细胞杀伤作用

目的比较荷载Ki67基因小干扰RNA（Ki67-siRNA）的增殖腺病毒ZD55-Ki67及非增殖腺病毒Ad-Ki67对肾癌细胞的杀伤作用。方法MOI=10的ZD55-Ki67、Ad-Ki67感染肾癌786-0细胞，2d后收集细胞，蛋白印迹法检测E1A表达；逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、蛋白印迹法、免疫细胞化学法检测Ki67表达；原位末端标记法（TUNEL）检测凋亡。4d后噻唑蓝（MTT）法检测细胞存活率，7d后结晶紫染色法检测细胞毒性作用。结果感染ZD55-Ki67的786-0细胞表达E1A，感染Ad-Ki67的细胞不表达E1A。ZD55-Ki67、Ad-Ki67感染的786-0细胞Ki67mRNA表达率分别为（37．9±2．3）％、（64．1±1．9）％；Ki67蛋白表达率分别为（42．5±2．4）％、（60．1±2．2）％；Ki67染色阳性率分别为（20．8±2．8）％、（32．3±2．5）％；786-0细胞存活率分别为（22．2±3．0）％、（60．4±3．4）％；凋亡率分别为（53．0±3．7）％、（35．3±2．5）％，两种病毒处理之间差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论ZD55．Ki67抑制786-0细胞Ki67表达及增殖、诱导凋亡及细胞毒性作用均显著优于Ad-Ki67。增殖腺病毒介导的RNA干扰杀伤肾癌细胞作用优于非增殖腺病毒。     

RNA干扰对肾癌细胞端粒酶基因表达和活性的抑制作用及其增殖、凋亡的影响

目的探讨小干扰RNA(siRNA)对人肾癌细胞端粒酶基因表达、活性的抑制作用及对肾癌细胞增殖、凋亡的影响。方法将针对人端粒酶RNA(hTR)模板区的siRNA(100nmol/L)转染肾癌7860细胞,采用RTPCR检测7860细胞端粒酶mRNA表达,端粒重复序列扩增酶联免疫吸附法检测端粒酶活性,MTT法检测细胞增殖,免疫细胞化学TUNEL法检测细胞凋亡。结果hTRsiRNA处理组7860细胞端粒酶mRNA表达(40.7±1.5)%降低,端粒酶活性(32.7±2.3)%降低,细胞增殖抑制率(63.6±1.6)%增加,凋亡细胞阳性率(39.4±0.6)%增加。分别与阴性siRNA对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论siRNA能抑制人肾癌细胞端粒酶mRNA表达及活性,进而抑制其增殖、促进其凋亡,有望成为肾癌基因治疗的有效工具。     

增殖细胞核抗原小干扰RNA对人结肠癌CaCO2细胞抑制作用

目的 观察增殖细胞核抗原（PCNA）小干扰RNA（siRNA）对人结肠癌CaCO2细胞抑制作用。方法 WST-8法和克隆形成抑制研究No．2和No．4PCNAsiRNA对CaC02细胞的作用；碘化丙锭（PI）单染检测细胞周期，Hochest33258染色观察凋亡形态，膜联蛋白（Annexin）V和PI双染测定捅亡百分率。结果 No.2和No．4PCNA siRNA与CaCO2细胞作用，增殖抑制率分别为（72．24±1.01）％和（74.67±3．35）％；克隆形成抑制率均达90％；两种药物转染细胞均出现明显亚二倍体峰，Sub-G1＋Go／G1期减少，S＋G2／M期增多；siRNA处理组细胞有较多凋亡形态变化；凋亡率随浓度增加而增加，且早期凋亡率持续高于晚期捅亡／坏死率。结论 PCNAsiRNA显著抑制人结肠癌CaCO2细胞增殖及克隆形成；细胞停留于G2／M期，明显诱导细胞凋亡。     

小干扰RNA对小鼠淋巴细胞cbl-b基因表达的抑制作用

目的 设计合成及筛选自身免疫关键基因--cbl-b (Casitas B-cell lineage lymphoma-b,cbl-b)基因小分子干扰RNA(siRNA).方法 应用RNA设计软件,模拟cbl-b小鼠cbl-b mRNA二级结构,设计并合成针对cbl-b mRNA的4对21核苷酸(nt)siRNA,96孔板转染小鼠淋巴细胞,以空白及转染非特异siRNA(与cbl-b mRNA无同源性的21nt siRNA)作为对照,应用蛋白免疫印迹(Western blot)方法 检测小鼠淋巴细胞cbl-b蛋白表达.结果 cbl-b基因siRNA工作浓度为100nmol/L时转染小鼠淋巴细胞转染率最高,可达(87.48±1.94)%,平均荧光强度最强,可达33.09±1.77.与对照相比,转染cbl-b siRNA的小鼠淋巴细胞蛋白表达明显下调,以siRNA-4最显著,抑制率达85%,转染非特异性siRNA的小鼠淋巴细胞cbl-b蛋白表达水平无明显变化.结论 得到cbl-b siRNA转染小鼠淋巴细胞最佳转染条件,成功筛选能高效抑制cbl-b蛋白表达的siRNA-4,其有效抑制时间约为48h,有望通过沉默cbl-b基因直接活化淋巴细胞,增强机体主动免疫杀伤肿瘤细胞.

Abstract：

Objective To design, synthesize screen small interfering RNA (siRNA) targeting to Casitas B-cell lineage lymphoma-b (cbl-b).Methods Four pairs of 21 nucleotide siRNAs directed to Cbl-b mRNA were designed and synthesized by utilizing RNA design software to simulate secondary structure of cbl-b mRNA in mice. These siRNAs were respectively transfected into lymphocytes in 96 shadows mask by oligofectamine package, and untreated and unspecific siRNA-transfected lymphocytes served as controls. The expression of cbl-b protein was detected by Western blotting.Results When the work concentration of siRNA was 100 nmol/L, transfection efficiency of lymphocytes was highest, up to (87.48±1.94)% and the mean fluorescence intensity was strongest, up to 33.09±1.77. Compared with bland controls, the expression of cbl-b protein level was markedly down-regulated in siRNA-transfected lymphocytes. The inhibitory rate of the siRNA of the target-4 was highest, up to 85%. The expression of cbl-b protein in unspecific siRNA-transfected lymphocytes had no significant changes.Conclusion siRNA-4, which can highly effectively inhibit protein expression of cbl-b gene, was screened successfully, and its inhibition effect can maintain near 48 h. It is hopeful that the cbl-b siRNA will activate lymphocytes directly by cbl-b gene silencing, and kill tumor by activate immunization.     

微小RNA-494过表达与RNA干扰抑制Survivin基因对前列腺癌移植瘤生长的比较

目的 比较过表达微小RNA (microRNA)-494与采用RNA干扰抑制前列腺癌PC-3细胞中Survivin基因的表达,对前列腺癌移植瘤生长的影响.方法 将过表达microRNA-494的腺病毒载体Ad-494及负载Survivin短发卡RNA (shRNA)腺病毒载体Ad-sur分别或联合感染PC-3细胞后,将相应PC-3细胞接种于裸鼠右前肢皮下,建立前列腺癌移植瘤模型.并以磷酸盐缓冲液(PBS)组及空载体组(Ad-GFP)作为对照.动态测量肿瘤体积.55 d后处死各组裸鼠,瘤体称重计算抑瘤率.Western blot检测肿瘤组织中Survivin表达变化.免疫组织化学测定Survivin、B淋巴细胞/白血病-2(bcl-2)、bcl-2相关X蛋白(bax)及半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3表达变化.结果 Ad-sur组、Ad-494组、Ad-sur+ Ad-494组裸鼠前列腺癌移植瘤的生长明显被抑制.第35天时即表现差异.其中Ad-sur+ Ad-494组瘤体积最小,为(40.69±0.69) mm3,Ad-sur、Ad-494组瘤体体积分别为(102.11±5.32) mm3、(99.03±3.50) mm3,3组肿瘤体积均明显小于PBS组(572.72±10.46) mm3、Ad-GFP组(544.85 ±10.28) mm3(P＜0.05).但Ad-sur组与Ad-494组间瘤体大小差异无统计学意义(P＞0.05).55 d后,Ad-sur、Ad-494、Ad-sur+ Ad-494组对移植瘤抑制率分别64.62％、65.98％、86.67％,Ad-sur+ Ad-494组具有抑瘤增效的相加作用(Q=0.99).同对照组比较,实验各组的Survivin基因均表达下降,差异有统计学意义(P＜0.05).其中,Ad-494组与Ad-sur组间差异无统计学意义(P＞0.05),Ad-sur+ Ad-494组较Ad-494、Ad-sur组更为显著;实验各组中的bax、Caspase-3表达上调,bcl-2表达下调,且Ad-sur+ Ad-494组效果优于Ad-sur、Ad-494组.结论 过表达microRNA-494与RNA干扰方法均可抑制前列腺癌裸鼠移植瘤Survivin基因表达,从而抑制移植瘤的生长,且两者联合效果更加显著.     

利用RNA干扰阻抑膀胱癌细胞Survivin基因表达和诱导凋亡

目的 探讨RNA干扰下调Survivin基因表达后膀胱癌细胞生物学行为变化及Survivin基因抗凋亡机制。方法设计、合成一对Survivin编码基因序列特异的小分子干扰RNA（siRNA），用脂质体包裹转染T24膀胱癌细胞，分不同的浓度组（50～200nmol／L）。噻唑蓝（MTT）法检测细胞生长情况，流式细胞仪测定细胞凋亡率，实时定量聚合酶链反应（PCR）检测Survivin基因和Caspase-3基因mRNA表达。结果 Survivin编码基因序列特异性siRNA能有效下调Survivin基因表达水平，并呈剂量和时间依赖性，最大效应浓度为100nmol／L，此时与对照比较Survivin表达水平下调75．91％，并显著的抑制了细胞生长，抑制率达55．29％，差异有统计学意义（P＜0．05）。同时，Caspase-3 mRNA表达水平明显上升达239．80％，细胞凋亡率亦增加至45．70％，与对照相比差异有统计学意义（P＜0．05）。结论RNA干扰显著下调Survivin基因表达后，能明显促进T24膀胱癌细胞凋亡并抑制其增殖；Survivin基因可能是通过下调Caspase-3表达来抑制凋亡。     

EGCG对肾癌细胞786-O增殖及血管化的影响

目的 探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对肾癌细胞增殖以及血管生成的作用.方法 将不同浓度(0、10、30、60 μmol/L)的EGCG与肾癌786-O细胞作用后,采用MTT法检测EGCG对肾癌细胞增殖能力以及通过ELISA法检测EGCG对肾癌细胞分泌血管内皮生长因子(VEGF)能力的影响;通过建立裸鼠肾癌动物模型,以不同剂量(0、30、100 mg/kg)经口途径喂服EGCG,测量肾癌肿瘤生长情况并绘制肿瘤生长曲线,使用RT-PCR检测肿瘤组织中VEGF mRNA表达,使用免疫组织化学方法测定肾癌组织中微血管的生成.结果 EGCG能够抑制786-O细胞的增殖能力,其抑制能力随其浓度的升高和作用时间的延长而增强,呈现浓度和时间依赖性(P<0.05).同时EGCG还能以浓度依赖的方式抑制786-O细胞分泌VEGF的能力(P<0.05).进一步研究发现EGCG能够抑制786-O细胞体内的生长,同时降低786-O肿瘤组织中VEGF mRNA的表达水平以及新生微血管的面积(P<0.05).结论 EGCG具有抗肾癌的作用,能够抑制肾癌的生长以及血管的生成.     

小干扰RNA抑制雄激素受体基因表达对人膀胱癌T24细胞增殖及凋亡的影响

目的 观察小干扰RNA技术(siRNA)抑制雄激素受体(AR)基因的表达对人膀胱癌T24细胞增殖及凋亡的影响.方法 化学合成针对AR的siRNA,用脂质体转染T24细胞.采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测AR mRNA和蛋白的变化.转染细胞48 h后用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞体外增殖活性的变化,流式细胞术检测细胞的凋亡状况.结果 成功的转染T24细胞,实时荧光定量RT-PCR筛选出一条AR mRNA抑制效率最高的siRNA,行Western blot检测可抑制AR蛋白表达至70.3%.转染细胞48 h后,T24细胞增殖活性抑制率达到(25.9±5.4)%,细胞凋亡率达到21.61%.结论 应用siRNA干扰技术能有效的抑制AR基因的表达,同时可抑制人膀胱癌T24细胞的体外增殖活性及促进其凋亡的发生.     

三氧化二砷抑制肾癌细胞系786-0增殖及诱导凋亡的研究

目的探讨三氧化二砷(As2O3)对人肾癌细胞系786-0的增殖抑制和诱导凋亡的作用及可能机制。方法采用细胞增殖检测、形态学观察、琼脂糖凝胶电泳和肿瘤克隆形成等方法观察As2O3对786-0细胞的增殖抑制和诱导凋亡的作用,以免疫组织化学和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术等探讨As2O3的作用机制。结果2μmol/L以上浓度As2O3可显著抑制786-0细胞的增殖、降低细胞核分裂指数并出现凋亡的形态学改变和DNA片段化,经2.0μmol/LAs2O3处理72h后,其抑制786-0细胞增殖率为69.13%(P<0.01),使其核分裂指数由6.00降低至1.80(P<0.01),肿瘤细胞克隆形成抑制率达到100.00%。As2O3使786-0细胞内bcl-2、PCNA和Ki-67基因表达降低(P<0.01),其作用随药物浓度升高和时间延长而增加。结论As2O3对786-0细胞具有显著的增殖抑制作用,并具有浓度和时间依赖性特点,可能通过下调其PCNA和Ki-67基因表达抑制增殖,抑制bcl-2基因的表达诱导细胞凋亡。     

姜黄素抑制肾癌ACHN细胞增殖及促凋亡的实验研究

目的观察姜黄素对人肾癌ACHN细胞株增殖及细胞凋亡的影响,探讨姜黄素诱导ACHN细胞株凋亡的作用机制。方法不同浓度姜黄素作用人肾癌ACHN细胞24 h后,应用MTT比色法检测姜黄素对人肾癌ACHN细胞的增殖抑制率;流式细胞术检测姜黄素诱导细胞的凋亡率;RT-PCR检测姜黄素对ACHN细胞Bcl-2、Bax、NF-κBP65 mRNA表达的影响;Western blot方法检测其对细胞Bcl-2、Bax、NF-κBP65I、κB蛋白表达的影响。结果姜黄素对人肾癌ACHN细胞有明显的抑制作用,可引起细胞凋亡,并且存在剂量和时间依赖;不同浓度姜黄素作用细胞24 h后,Bcl-2、NF-κBP65 mRNA水平下降,Bax mRNA水平升高(P0.05),Bcl-2、NF-κBP65蛋白表达量下降,BaxI、κB蛋白表达量升高(P0.05)。结论姜黄素通过上调IκB,下调NF-κB活性,调控凋亡基因Bcl-2/Bax的表达,抑制人肾癌ACHN细胞的增殖,诱导人肾癌ACHN细胞的凋亡。     

SiRNA联合介导Livin和Survivin基因沉默诱导人肾癌细胞786-O化疗敏感性的实验研究

目的:观察siRNA联合介导Livin和Survivin基因的沉默诱导人肾癌细胞786-O化疗敏感性的作用。方法:构建Livin和Suvivin联合靶向的小干扰RNA(siRNA)重组表达载体shRNA,然后将目的载体转染于人肾癌细胞株786-O。应用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)及Western blot方法分别检测转染前细胞经顺铂、5-FU和丝裂霉素处理后的Livin和Survivin基因的mRNA与蛋白水平的变化。应用CCK-8试验检测转染前后细胞对顺铂、5-氟尿嘧啶(5-FU)和丝裂霉素的半数致死量(IC50)、细胞增殖的变化。结果:CCK-8结果显示,联合介导Livin和Survivin基因沉默组细胞较分别单独介导细胞组化疗的敏感性明显增强(P0.05),且转染前后细胞对顺铂、5-FU和丝裂霉素的IC50发生显著变化(P0.05)。结论:SiRNA联合介导Livin和Survivin基因表达下调,发挥协同增强的siRNA作用。     

125I偶联Ki-67反义核酸对人肾癌细胞生长及凋亡的调控作用

目的　探讨12 5I偶联Ki 67基因反义寡核苷酸 (12 5I ASODN)对人肾癌细胞生长及凋亡的调控作用。方法　采用氯胺 T法将 10 μmol/L浓度的Ki 67反义寡核苷酸 (ASODN)与12 5I偶联 ,12 5I ASODN放射浓度为 2 .5 9MBq/L ,脂质体包装后转导肾癌 786 0细胞系。采用免疫组织化学、Western印迹技术检测Ki 67表达 ,四甲基偶氮唑蓝 (MTT)法检测细胞增殖 ,免疫组织化学脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记 (TUNEL)法检测细胞凋亡。结果　12 5I ASODN处理组肾癌细胞Ki 67表达阳性率 (2 1.5± 1.2 ) %降低 ,Ki 67蛋白 (4 9.9± 4.5 ) %降低 ,与ASODN处理组(2 9.9± 0 .4) %、(82 .1± 1.9) %比较差异有非常显著性 (P均 <0 .0 1)。细胞增殖抑制率12 5I A SODN处理组 (4 7.9± 3 .6) %与ASODN处理组 (2 1.8± 2 .5 ) %比较差异有非常显著性 (P <0 .0 1)。凋亡细胞阳性率12 5I ASODN处理组 (2 8.9± 1.3 ) %与ASODN处理组 (15 .7± 0 .5 ) %比较差异有非常显著性 (P <0 .0 1)。结论　12 5I ASODN较之ASODN具有更强的抑制肾癌细胞增殖、促进凋亡作用。