VEGF-C基因RNA干扰真核表达载体的构建及其效果鉴定

目的：构建VEGF-C基因RNA干扰（RNAi）的真核细胞表达载体。方法：以VEGF-C为靶基因,以pGenSil-1质粒为载体,设计构建重组体,根据GenBank数据库提供的VEGF-C基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计两条带发夹结构的核苷酸序列,克隆到空载体pGenSil-1中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析,将重组的pGenSil-VEGF-C质粒转染LOVO细胞48小时,检测其对LOVO细胞VEGF-C蛋白与mRNA表达的影响。结果：经酶切鉴定筛选出的重组体测序结果与目的序列完全一致,重组载体显著降低Lovo细胞VEGF-C的蛋白和mRNA表达,重组载体构建成功。结论：利用RNAi技术可成功构建抑制VEGF-C表达的小干扰RNA重组体。     

人细胞周期蛋白cyclin D1基因RNAi表达载体的构建与鉴定

[目的]构建针对人细胞周期蛋白cyclinD1基因的RNAi真核表达载体,检测其对人卵巢癌HO-8910细胞cyclinD1基因表达的干扰效率。[方法]以cyclinD1为靶向设计,合成的4条互补寡核苷酸链克隆至pSUPER载体中,得到重组质粒pSUPER-C1￣4,行双酶切分析后测序鉴定;运用脂质体介导转染HO-8910细胞,G418筛选;采用RT-PCR检测对cyclinD1基因mRNA表达的干扰,并筛选有效的siRNA干扰序列。[结果]经酶切测序鉴定证实,重组质粒中已插入目的序列;RT-PCR表明有4个重组载体均不同程度抑制目的基因的转录,但以pSUPER-C2的干扰效率最强。[结论]在卵巢癌细胞系筛选出有效干扰cyclinD1基因表达siRNA序列,成功构建针对cyclinD1基因的RNAi真核表达载体有效抑制目的基因的表达。     

CUL5基因的RNA干扰真核表达载体的构建

目的:构建CUL5基因的RNA干扰真核表达载体,探索CUL5在鼻咽癌放射治疗中加速再增殖的作用.方法: 根据 GenBank数据库提供的 CUL5基因mRNA序列,按照Tuschl 设计原则,设计选择双链小干扰RNA( small interfering RNA,siRNA ) ,再设计合成为能表达其小发卡结构RNA(small hairpin RNAs,shRNA)的DNA序列,并与pGPU6/GFP/Neo质粒定向连接,构建真核表达载体,并进行限制性内切酶酶切和DNA测序鉴定.结果: 经限制性内切酶酶切和DNA测序证实质粒中插入的为所需序列,通过RT-PCR证实其能够干扰CNE2细胞的CUL5基因表达.结论: CUL5基因RNA干扰真核细胞表达载体的构建成功.     

靶向人Pokemon基因的shRNA重组质粒的构建

目的构建靶向Pokemon基因的短发夹RNA（shRNA）真核表达载体,为研究Pokemon基因在肿瘤发生发展中的作用奠定基础。方法利用基因重组技术,依据siRNA的设计原则,针对目的基因的mRNA序列筛选了3对siRNA序列以及一对阴性对照序列,将其分别插入真核表达载体psiRNA-hHlneo H1启动子下游,经α互补筛选、酶切和DNA测序鉴定,构建靶向Pokemon基因的RNAi真核表达载体。结果酶切鉴定及DNA测序结果显示siRNA片断正确,与设计序列一致,且成功插入预定位点。结论靶向Pokemon基因的shRNA重组质粒成功构建,为进一步研究Pokemon基因在多种疾病中的作用以及探索肿瘤的基因治疗奠定基础。     

CUL5基因的RNA干扰真核表达载体的构建

目的：构建CUL5基因的RNA干扰真核表达载体,探索CUL5在鼻咽癌放射治疗中加速再增殖的作用。方法：根据GenBank数据库提供的CUL5基因mRNA序列,按照Tuschl设计原则,设计选择双链小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）,再设计合成为能表达其小发卡结构RNA（small hairpin RNAs,shRNA）的DNA序列,并与pGPU6／GFP／Neo质粒定向连接,构建真核表达载体,并进行限制性内切酶酶切和DNA测序鉴定。结果：经限制性内切酶酶切和DNA测序证实质粒中插入的为所需序列,通过RT—PCR证实其能够干扰CNE2细胞的CUL5基因表达。结论：CUL5基因RNA干扰真核细胞表达载体的构建成功。     

靶向Bcl-2基因转录shRNA重组质粒的构建和序列分析

[目的]利用RNA干扰技术,以Bcl-2为靶基因,设计构建重组体,并进行序列分析,探索肿瘤基因治疗的新途径。[方法]设计有小发夹结构的两条DNA序列,经退火形成互补双链,克隆至转录载体Pgenesil-1上构建重组体,转化DH5a菌株,提取质粒行酶切鉴定后,进行测序分析。[结果]将合成的DNA片段退火后克隆至载体上,经酶切及序列鉴定为目的序列,靶向Bcl-2基因转录shRNA重组质粒构建成功。[结论]靶向Bcl-2基因转录shRNA重组质粒的成功构建,为下一步利用该重组体干扰肿瘤细胞中Bcl-2的mRNA转录,探索肿瘤基因治疗的新途径奠定基础。     

雌激素受体GPR30 RNAi干扰载体的构建及在耐药乳腺癌细胞MCF-7R中的效果验证

目的：采用RNA干扰（RNAi）技术研究耐药乳腺癌细胞MCF-7R中GPR30表达。方法：利用他莫昔芬（tamoxifen,TAM）诱导乳腺癌细胞MCF-7建立耐药乳腺癌细胞株。以GPR30为靶基因,pGenSil-1质粒为载体,根据GenBank数据库提供的GPR30基因核苷酸序列,克隆到空载体pGenSil-1中,Lipofectin2000转染MCF-7R细胞,G418筛选获得阳性克隆细胞扩大培养。Trizol法提取细胞总RNA,半定量RT-PCR检测GPR30的表达。结果：经TAM处理可以诱导GPR30 mRNA的表达,HindⅢ和EcoRⅠ双酶切鉴定重组干扰载体pGg30-1、pGg30-2得到了与预期大小相符的片段,RT-PCR显示,未转染组MCF-7R细胞GPR30mRNA的表达量明显高于转染pGg30-1、pGg30-2的MCF-7R细胞,而转染空载体组细胞未见明显变化。结论：RNAi技术可成功构建抑制GPR30表达的小干扰RNA重组体。     

CtBP1基因shRNA真核表达载体的构建及其干扰效果的初步鉴定

目的：构建C-末端结合蛋白-1（CtBP1）基因RNA干扰（RNAi）的真核表达载体,转染人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1（ADR＋/＋）,初步鉴定其干扰效果。方法：以人CtBP1基因为靶基因,以pGenesil-1质粒为载体,根据GenBank数据库提供的CtBP1基因核苷酸序列,选择设计两条siRNA干扰序列,将带9个碱基茎环结构的干扰序列插入带有绿色荧光蛋白（EGFP）基因、卡那霉素（Kanr）抗性基因及U6启动子的真核表达载体pGenesil-1中,构建针对CtBP1基因的shRNA真核表达载体,转化大肠杆菌DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析。确认载体构建成功后,用脂质体LipofectamineTM2000将重组质粒瞬时转染人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1（ADR＋/＋）,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,计数转染细胞数,计算转染效率,RT-PCR法检测载体对CtBP1基因的表达抑制效果。结果：构建针对CtBP1基因的pGenesil-1-CtBP1小发夹RNA（pGenesil-1-CtBP1-shRNA）,经限制性内切酶酶切、PCR和DNA测序证实与设计完全一致;在荧光显微镜下观察到B-MD-C1（ADR＋/＋）细胞表达绿色荧光蛋白（EGFP）,证实重组质粒己转染入细胞,转染效率达到60%-70%;RT-PCR结果显示B-MD-C1（ADR＋/＋）细胞中CtBP1基因被特异抑制,基因表达抑制率达40%以上,与转染试剂对照组、空白对照组和阴性序列对照组间的差异均具有统计学意义（P均〈0.05）。结论：成功构建CtBP1基因的shRNA表达载体,可以有效抑制B-MD-C1（ADR＋/＋）细胞上CtBP1基因表达。为进一步研究CtBP1基因功能进而逆转肿瘤的多药耐药奠定基础。     

携带靶向沉默LSD1基因表达shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建慢病毒干扰LSD1表达的载体并鉴定。方法:设计并合成3对针对LSD1基因的shRNA链,退火形成双链,与酶切的质粒连接,转化DH5a菌株,提取质粒,进行酶切鉴定和测序分析。脂质体法转染人胃癌MKN-28细胞,通过荧光倒置显微镜判定转染效率,并通过real time-PCR法检测细胞中LSD1基因的表达水平。结果:经酶切鉴定筛选出的重组质粒测序结果与目的序列相同,重组质粒构建成功;转染胃癌MKN-28细胞后,LSD1基因在mRNA水平的表达降低。结论:成功构建了靶向LSD1基因的shRNA慢病毒载体,并筛选出1种对LSD1基因有显著抑制作用的shRNA。     

stathmin基因的RNA干涉抑制人白血病K562细胞体外增殖的作用

目的:研究RNA 干涉(RNA interference,RNAi)抑制stathmin基因表达后对人白血病K562细胞体外增殖的作用.方法:将合成的寡核苷酸链退火形成双链,连接入经BamHI和HindⅢ双酶切后的pSilencer4.1-CMV neo真核表达载体.酶切及测序鉴定.脂质体法转染重组质粒入K562细胞,RT-PCR检测其对mR-NA的干涉效果;MTT 比色法检测K562细胞体外增殖能力.结果:经酶切及测序鉴定,成功构建重组质粒.RT-PCR显示所构建的干涉载体成功地抑制了目的基因的转录,同时细胞增殖活性降低.结论:RNA干涉成功抑制stathmin基因表达并使人白血病K562细胞体外增殖活性明显降低.