pcDNA3-HIF-1α真核表达质粒的构建及其在MCF-7细胞中的表达

目的构建低氧诱导因子1α(H IF-1α)真核表达质粒,并在MCF-7细胞中进行功能验证。方法利用RT-PCR扩增带有XbaⅠ和H indⅢ酶切位点的H IF-1α编码基因,插入T载体测序正确后,克隆入pcDNA3真核表达载体,然后将其转染MCF-7细胞。W estern b lot和双荧光素酶报告基因法分别检测H IF-1α表达及其DNA结合活性;实时定量PCR检测H IF-1α对低氧诱导基因C-METmRNA表达的影响;Caspase3/7活性检测来初步判断H IF-1α对低氧MCF-7细胞凋亡的影响。结果酶切及测序结果证明pcDNA3-H IF-1α表达质粒的DNA序列完全正确。将此质粒转染MCF-7细胞后,H IF-1α蛋白表达明显增加,它不仅增强了pGL3-EPO-HRE报告基因活性而且促进了C-METmRNA的表达,同时还降低了低氧MCF-7细胞中Caspase3/7的水平。结论pcDNA3-H IF-1α真核表达质粒构建成功,它不但具有很强的DNA结合和诱导活性,而且在细胞低氧过程中具有一定的抗凋亡作用。     

9.1C3胞内抗体基因的克隆及其对9.1C3 分子表达的抑制作用

目的 获得9．1C3胞内抗体基因的真核表达载体,观察胞内抗体对9．1C3分子表达的抑制作用,为进一步研究9．1C3分子对NK细胞功能的影响打下基础。方法 设计引物,以9．1C3 ScFv基因为模板进行PCR扩增,引入蛋白质内质网定位所需的信号肽、KDEL以及作为表达检测标记的Etag序列。回收纯化PCR产物,酶切后连接到pUC19载体上,并进行序列测定。序列正确后切下胞内抗体基因片段,重组到真核表达载体pRc/CMV中,酶切鉴定后用DEAE－dextran方法瞬时转染真核细胞COS7,用胞内染色和Western blot方法检测胞内抗体的表达。接着用Lipofectamine把胞内抗体基因转入9．1C3阳性的Jurkat细胞,用FCM观察胞内抗体对9．1C3分子表达的影响。结果 DNA序列测定证明,通过PCR成功地为9．1C3 ScFv引入了内质网定位所需的信号肽、KDEL及E－tag序列,成功地构建了胞内抗体真核表达载体,通过胞内染色方法和Western blot证明胞内抗体在COS7中得到表达。转入Jurkat细胞后发现胞内抗体能下调9．1C3分子的表达水平。结论 以9．1C3 ScFv基因为模板PCR扩增得到9．1C3胞内抗体基因,并构建了真核表达载体。     

hLMO4基因重组质粒的构建及蛋白表达和定位

目的构建hLMO4真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内表达及定位。方法提取人乳腺癌MCF-7细胞的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增hLMO4全长编码基因,亚克隆至pCDNA3.1-myc-hisA表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到胃癌细胞BGC823中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。利用共聚焦激光扫描显微镜观察pEGFP-LMO4在乳腺癌MCF-7细胞内定位。结果hLMO4全长基因序列克隆到了真核表达载体pCDNA3.1-myc-hisA中,酶切鉴定片段为500bp。Western blot检测到了融合蛋白表达,分子量约为23KD。pEGFP-LMO4在乳腺癌MCF-7细胞内定位以细胞核为主,在细胞浆内少量表达。结论成功的构建了hLMO4全长基因真核表达载体,pEGFP-LMO4蛋白定位于乳腺癌细胞质和核内。     

SmB/B’抗原表位的表达及其免疫原性研究

为了构建SmB/B’抗原表位的真核表达载体 ,通过体内、外进行表达并研究其免疫原性 ,采用异硫氰酸胍一步法提取BALB/c小鼠脾脏总RNA ,通过RT PCR方法克隆了含编码SmB/B’抗原表位的目的DNA ,构建了其真核表达质粒pcDNA3 fSmB/B’ ,体外转染HeLa细胞检测其表达及与抗体结合活性。体内采用基因免疫的方法对其免疫原性进行研究。结果 :成功构建pcDNA3 fSmB/B’真核表达质粒 ,Westernblot显示其在真核细胞内可有效表达且与抗SmB/B’抗体具有结合活性 ,经基因免疫实验组小鼠皆产生抗SmB/B’抗体。构建的SmB/B’抗原表位真核表达载体可在体内、外有效表达 ,且表达的抗原表位具有免疫原性     

蛋白表达的亚细胞定位影响基因免疫诱导的体液免疫应答水平的研究

目的研究表达产物的不同亚细胞定位对基因免疫诱导的体液免疫应答水平的影响,为基因疫苗的设计提供参考。方法利用分子克隆技术,分别构建能表达不同细胞定位的EGFP-HPVl6L1融合蛋白和截短型EGFP-HPV16L1△NLS融合蛋白的重组pcDNA-EGFP-HPV16L1和pcDNA-EGFPHPV16L1△NLS真核表达载体;通过转染CHO细胞,并在倒置荧光显微镜下观察表达产物的细胞定位;用重组pcDNA载体免疫BALB/c小鼠;EGFP作为抗原,ELISA法检测血清抗体吸光度。结果①重组pcDNA-EGFP-HPV16L1转染的CHO细胞核内可见到绿色荧光,pcDNA-EGFP-HPV16L1△NLS真核表达载体转染的CHO细胞质内可见到绿色荧光:②两种不同的重组pcDNA载体均可诱导BALB/c小鼠体液免疫反应,但重组pcDNA-EGFP-HPV16L1△NLS真核表达载体免疫组小鼠IgG抗体A_(450)值显著高于重组pcDNAEGFP-HPV16L1真核表达载体免疫组小鼠IgG抗体A_(450)值(P0.001)。结论表达产物的不同细胞定位可影响基因免疫诱发的体液免疫应答水平,定位于细胞质内的蛋白分子较定位于细胞核的蛋白分子能诱导机体更强的体液免疫反应,这为以增强体液免疫反应为目的的基因疫苗的设计提供了参考。     

人源性抗HBc单链抗体真核表达载体的构建及其细胞内表达

目的：构建人源性抗HBc单链抗体的真核表达载体并在细胞内表达。方法： 采用DNA重组技术将特异性人源性抗HBc单链抗体基因插入真核表达载体pEGFP-c1；转染HepG2细胞，经G418筛选细胞，荧光倒置显微镜观察细胞内抗HBc单链抗体与绿色荧光蛋白融合表达情况，并用ELISA法检测HBc单链抗体基因的细胞内表达。结果： 成功地构建了人源性抗HBc单链抗体的真核表达载体。转染HepG2细胞并筛选后，经荧光倒置显微镜观察，细胞内有绿色荧光蛋白表达；ELISA检测细胞内表达的单链抗体片段具有HBcAg结合活性。结论： 人源性抗HBc单链抗体的真核表达载体的构建并在细胞内成功表达，为胞内抗HBc单链抗体的进一步研究奠定了基础。     

HBV靶向核糖核酸酶真核表达载体的构建及其在2.2.15细胞内的表达

目的 构建人嗜酸性粒细胞来源的神经毒素（hEDN)与乙肝病毒核心蛋白（HBVc)的融合真核表达载体（该融合蛋白即为构建的靶向核糖核酸酶），抑制乙肝病毒在细胞内的复制。方法 分别从HL－60GGG细胞和2．2．15细胞中提取总RNA，用RT－PCR特异性扩增hEDN及HBVc编码基因，将hEDN和HBVc克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-),hEND克隆入原核表达载体pGEX4T-1，并以纯化的原核表达产物免疫Balb/c小鼠，制备特异性抗体。用免疫荧光法检测pcDNA3.1(-)/HBVc-hEDN在转染2．2．15细胞内地表达。结果 成功地构建了hDNA和HBVc的真核融合表达载体。，并在2．2．15细胞中较高效地表达。结论 pcDNA3.1(-)/HBVc-hEDN的构建和在2．2．15细胞内的表达，为探索乙型肝炎的治疗开辟了新思路。     

人Toll-like receptor 2胞外段的克隆和表达

目的 克隆、表达人Toll-like receptor 2(TLR2)胞外段(A26-T588)基因，获得人TLR2胞外段蛋白。方法 RT-PCR扩增TLR2胞外段基因，以pcDNA3．1 质粒为载体在HEK293细胞中表达TLR2胞外段蛋白，同时以pcDNA3．1 ／TLR2(A26-T588)重组质粒免疫昆明鼠，制备抗TLR2胞外段蛋白多抗。结果 PCR扩增及重组质粒测序结果表明成功地构建了pcDNA3．1 ／TLR2(A26-T588)真核表达质粒，SDS-PAGE分析纯化产物在Mt为68000处出现明显蛋白条带。重组质粒DNA免疫小鼠3次后，血清抗体滴度可达1：250。TLR2胞外段蛋白可与LPS结合，并在一定的质量浓度范围内呈剂量依赖性。结论 构建的pcDNA3．1 ／TLR2(A26-T588)真核表达质粒可在哺乳动物细胞中表达TLR2胞外段蛋白，并与重组质粒DNA免疫小鼠抗血清及TLR2单克隆抗体TL2.1特异性反应，由此证明其表达正确。     

EGFP-Sam68融合蛋白在HeLa细胞的表达和定位

目的克隆有丝分裂Src相关蛋白p68(Sam68)基因cDNA全长,构建Sam68真核绿色荧光蛋白表达载体,并确定其在HeLa中的表达和定位。方法提取HeLa细胞总RNA,RT-PCR扩增Sam68基因片段,经酶切鉴定及测序正确后,克隆到真核绿色荧光蛋白表达载体(pcDNA3.0-EGFP)上,并转染HeLa细胞,Western blot法检测Sam68表达,免疫荧光细胞化学染色观察其细胞定位。结果酶切和测序证实Sam68正确插入pcDNA3.0-EGFP载体中,且载体正确表达了EGFP-Sam68融合蛋白,该蛋白定位在HeLa细胞核内。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3.0-EGFP-Sam68。     

人神经营养素-3基因真核表达载体的构建和鉴定

目的：构建含有人NT-3基因真核表达载体pcDNA3．1-NT-3。方法：采用PCR技术，扩增编码神经营养素-3基因，克隆到PMD18-T载体上，再亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1的Hind Ⅲ和BamHI位点。结果：重组真核表达载体pcDNA3．1-NT-3经酶切鉴定证明NT-3基因正向插入真核表达载体中，碱基序列的测定证明重组质粒中含有人的NT-3基因序列。结论：构建的真核表达载体携有人NT-3cDNA序列，并且含有巨细胞病毒强启动子、ploy(A)加尾信号和neo标志基因，可能具有转染多种哺乳类细胞通用性，可用于NT-3基因的真核表达及基因治疗的研究。     

Level of functioning of siblings and parents of probands of varying degrees of retardation

A further analysis of already published data supports the position that retardates of low ability level less frequently have retarded siblings, retarded parents, and parents low in occupational level than do retardates higher in ability level. The analysis supports the position that there are two types of retarded individuals, persons retarded as a result of gene or chromosomal anomalies, brain injury, etc., who more frequently occur in the lower-level retardate group, and persons whose retardation represents polygenic segregation, who more frequently occur in the higher-level group.     

Modes of Inheritance of Errors of Refraction

Eighteen families in which both parents had refractions within the range of +4·0 D to −4·0 D and axial lengths seen in emmetropia (22·3-26·0 mm) showed coefficients of correlation of the order 0·5 indicative of polygenic inheritance. Such coefficients were seen for axial length (0·407) and for the cornea (0·487), but not for the lens (which is known to be yoked to the axial length). No such coefficients were seen in 19 families in which one of the parents had axial length outside the emmetropic range (nine families with long axes and 10 with short axes).

The pattern of polygenic inheritance for emmetropia (completely correlated optical components) and errors of refraction up to 4·0 D (inadequately correlated components: correlation ametropia) follows that seen in stature and other measurable characters. In contrast the high refractive errors with their abnormal axial lengths (component ametropia) are—like the extremes in stature—pathological anomalies with monofactorial inheritance.