CpG ODN作为乙型肝炎疫苗佐剂的研究进展

随着对含有CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)的结构、功能以及作用机理的深入研究,CpGODN已经应用于疾病的治疗和预防等许多方面。本文就CpG ODN作为乙型肝炎疫苗佐剂的研究进展做一综述     

CpG ODN佐剂促进HBsAg疫苗诱导小鼠细胞免疫应答的探讨

目的 探讨cpG ODN对重组乙型肝炎表面抗原（HBsAg）诱导小鼠细胞免疫应答的影响。方法HBsAg和HBsAg＋CpG ODN分别肌肉注射免疫Balb／c小鼠后,从淋巴组织（脾和淋巴结）和非淋巴组织（肺）分离淋巴细胞,体外经HBsAg抗原刺激后,利用ELISA检测细胞培养液中IFN-γ的水平,再利用流式细胞仪在单个细胞水平上检测IFN-γ^＋细胞的频率,分析IFN-7^＋细胞亚群。结果对照组和HBsAg免疫组IFN-γ产生的水平很低,当HBsAg加强免疫1～2次后,IFN-γ表达仍然没有明显升高;而CpG ODN＋HBsAg免疫1次或加强免疫后,CpG显著促进HBsAg诱导的IFN-γ产生。进一研究结果表明CpG促进HBsAg诱导淋巴器官和非淋巴器官内CD4^＋和CD8^＋T细胞IFN-γ的表达。结论CpG免疫佐剂不仅能诱导细胞免疫应答同时也诱导体液免疫应答,提示CpG ODN可以用于HBsAg预防和治疗性佐剂。     

CpG ODN的体外免疫活性及其作为乙肝疫苗佐剂的研究新进展

为了增强乙肝疫苗的免疫效力,开发研制新型疫苗佐剂是当前国内外学者研究的热点之一。近年来的研究表明：含CpG基序的寡脱氧核苷酸（CpG ODN）在体外实验中,对人和鼠的多种免疫细胞有活化作用;在动物实验中,CpG ODN不仅可增强乙肝疫苗的体液免疫应答,还可增强其细胞免疫应答,这正是铝佐剂所达不到的,且CpG ODN与铝佐剂具有协同效应,今后可考虑双佐剂联合乙肝疫苗接种,能提高接种人群的应答率,刺激机体产生更有效的保护作用;动物实验还显示,CpG ODN能增强HBV转基因小鼠对乙肝疫苗的免疫应答和抗病毒效应,说明乙肝疫苗辅以CpG ODN可望作为临床上免疫治疗慢性HBV感染的可行性途径;Ⅰ期临床试验表明CpG ODN对人体较安全。     

CpG ODN增强乙型肝炎表面抗原免疫小鼠的抗体产生

目的：探讨合成含CpG基序的寡核苷酸（CpG ODN)对重组乙型肝炎表面抗原（rHBsAg)及乙型肝炎疫苗增强小鼠特异性抗体产生的效应。方法：采用非纯系（Km)及纯系（Balb/c)小鼠作为免疫对象，经后腱胫骨前肌免疫2次，ELISA法检测血清乙型肝炎表面抗体（抗－HBs)效价。结果：加CpG ODN组，其抗-HBs效价均较单独注射rHBsAg和疫苗组明显增高，持续时间长，且纯系鼠的抗体效价明显高于非纯系鼠。结论：CpG ODN对小鼠抗－HBs产生具有增强作用，具与疫苗中的铝佐剂有协同效应。     

铝佐剂吸附CpG ODN增强重组乙肝疫苗免疫效应

目的探索新佐剂CpG ODN在重组乙肝疫苗中的免疫效应及吸附状态。方法 CpG ODN佐剂与重组乙肝疫苗混合免疫小鼠,收集小鼠血清检测。通过免疫小鼠后的体液和细胞免疫应答水平来评价双佐剂乙肝疫苗对重组乙肝疫苗的增强作用。CpG ODN佐剂与乙肝疫苗在不同温度条件下混合吸附,计算在不同吸附时间下CpG ODN佐剂在乙肝疫苗中的吸附率。结果CpG ODN佐剂可以提高重组乙肝疫苗在体液及细胞中的免疫效果。CpG ODN佐剂在室温条件下1 h即可在乙肝疫苗中达到吸附平衡,于2~8℃放置5 d的条件下其吸附率约在50%左右。结论 CpG ODN能够增加乙肝疫苗的免疫应答,其免疫效果可提高5倍以上。     

CpG ODN对rHBsAg免疫小鼠淋巴细胞增殖反应的影响

目的：进一步探讨以合成含CpG基序的寡核苷酸（CpG ODN）作为免疫增强剂与重组乙型肝炎表面抗原（rHBsAg）联合免疫小鼠,观察其淋巴细胞增殖反应效应.方法：经后腿胫骨前肌初次免疫BALB/c小鼠两周后加强免疫1次;MTT和3H-TdR掺入法分别检测免疫小鼠胸腺及脾脏淋巴细胞增殖反应.结果：加CpG ODN组与单纯注射抗原及疫苗组相比,淋巴细胞增殖反应显著增强.而且,除胸腺特异性增殖中的CpG加疫苗组和疫苗组外,其他各实验组与对照组相比,淋巴细胞增殖反应也都显著增强.结论：CpG ODN能够明显刺激小鼠胸腺及脾脏淋巴细胞增殖反应,显示出强而有效的免疫增强效应,有望成为一种新型的免疫佐剂.     

CpG ODN增强免疫抑制小鼠对乙肝疫苗的免疫应答效果

环磷酰胺是肿瘤治疗中最常见的烷化剂 ,严重影响骨髓、胸腺和脾脏的功能导致患者免疫力低下 ,容易患各种感染性疾病 ,疫苗接种成功率也很低 ,因此 ,寻找有效疫苗佐剂来提高这群人的疫苗接种成功率具有重要的实际意义。近年来 ,大量的研究显示细菌DNA中存在非甲基化的CpG二核苷酸序列 (即CpG基序 )能激活免疫系统 ,诱导天然免疫应答分泌免疫球蛋白和各种细胞因子。人工合成含CpG基序的脱氧寡核苷酸 (CpGODN )与蛋白疫苗同时接种正常小鼠 ,能提高抗原特异性免疫应答 ,诱导出高水平保护性抗体。本实验应用CpGODN与乙肝疫苗同时肌肉注射…     

CpG ODN生物学活性和免疫作用的研究进展

CpG ODN为人工合成的含胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸的寡聚脱氧核苷酸,能与Toll样受体9(TLR9)结合而发挥作用.CpG ODN能直接或间接激活树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞以及B淋巴细胞、NK细胞、T淋巴细胞等,使之分泌许多生物活性因子和细胞因子,从而在感染性疾病和肿瘤的免疫治疗中发挥重要作用.     

CpG ODN联合乙型肝炎疫苗与乙型肝炎疫苗免疫效果对比研究

目的探讨CpG ODN乙型肝炎疫苗与市售乙型肝炎疫苗对Balb/c小鼠的免疫作用效果。方法将乙肝疫苗、乙肝疫苗+100μgCpG ODN分别肌肉注射到4～6周龄,16～18g Balb/c小鼠体内,于第1次免疫后28d以同样剂量加强免疫1次。分别于第1次免疫后28、42、63 d收集小鼠血清,用ELISA方法检测抗HBs IgG抗体。结果实验组产生的抗HBs IgG与对照组HBsIgG相比P<0.05,具有显著性差异。28、42、63 d抗HBs IgG分别是对照疫苗的114倍、4.73倍、5.41倍以上。结论 CpG ODN能够显著增强小鼠对乙肝疫苗的免疫应答,在较短时间内显著的提高乙肝抗体的产生水平,免疫效果是乙肝疫苗的5倍以上。     

CpG ODN的免疫剌激机制

非甲基化CpGODN的免疫增强作用已经为许多研究所证实,CpGODN作为一种新型的免疫刺激剂,主要剌激多种免疫活性细胞分泌细胞因子,使机体产生快速的细胞免疫及体液免疫。CpGODN的特殊结构诱导激活细胞信号转导网络系统,介导了其免疫剌激活性及调节作用模式。     

CpG ODN佐剂对呼吸道合胞病毒重组疫苗诱导的细胞免疫应答的作用

目的:研究CpG2216佐剂对呼吸道合胞病毒(RSV)重组蛋白疫苗诱导的细胞免疫应答的作用。方法:重组RSV疫苗G1F/M2与CpG2216佐剂混合,或与CpG2216及常规佐剂Al(OH)3混合,鼻腔(i.n.)或腹腔注射(i.p.)免疫BALB/c小鼠三次,最后一次免疫后2周杀小鼠,取脾细胞,用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测脾细胞特异性杀伤活性;用ELISPOT法检测分泌IFNγ-和IL-4的细胞;用流式细胞仪检测CD4+/CD8+效应及LDH记忆细胞。结果:与G1F/M2相比,CpG+G1F/M2鼻腔或腹腔注射免疫均诱导了显著的杀伤活性;而且G1F/M2+Al+CpG(i.p.)诱导的杀伤活性显著高于CpG+G1F/M2(i.p.)。ELISPOT结果显示:CpG+G1F/M2鼻腔免疫和腹腔注射免疫组的分泌IFNγ-和IL-4的淋巴细胞数量明显多于G1F/M2组;CpG+Al+G1F/M2(i.p.)组的细胞数显著多于CpG+G1F/M2(i.p.)组;且各组分泌IFNγ-的淋巴细胞数显著多于分泌IL-4的淋巴细胞,即均诱导了Th1型优势应答,有利于宿主抗病毒。流式细胞仪检测结果表明:CpG+G1F/M2(i.n.)仅诱导CD44+单阳性的细胞,而CpG+G1F/M2(i.p.)和CpG+Al+G1F/M2(i.p.)既诱导产生了CD44+单阳性细胞,也产生了CD44+CD62L+双阳性的记忆细胞。结论:CpG2216作为RSV重组疫苗G1F/M2的佐剂,可显著增强细胞免疫应答。     

体外筛选对猪具有免疫刺激活性的CpG ODN

设计并筛选对猪具有最佳免疫刺激活性的CpGODN。文献报道 ,设计并合成了 38条CpGODN。用猪PBMC体外增殖实验 ,3 H 胸腺嘧啶 (3 H TdR )掺入法测定刺激指数 ,用SPSS软件对数值进行统计学分析 ;用双抗体夹心ELISA检测PBMC培养上清中的IFN γ和IL 2的量 ,来评价CpGODN对猪的免疫学作用。结果表明 ,多数CpGODN能够刺激猪PBMC的增殖 ,并促进其分泌IFN γ ,但IL 2分泌的量均未显著增加。其中 ,含有三个GTCGTT基序ODN 2 0 0 6刺激猪PBMC增殖的作用最强 ,刺激指数达 6 2 ,但仅能诱生低水平的IFN γ ;具有磷酸二酯键 /硫代磷酸二酯键混合骨架及 3’端polyG尾的ODND1 9具有中等程度的促猪PBMC增殖的作用 ,刺激指数为 4 2 ,但诱导PBMC分泌IFN γ比阴性对照增加了 5倍。ODND1 9和ODN 2 0 0 6对猪具有不同的免疫学效应 ,这为进一步研究适用于不同病原体的猪用疫苗佐剂提供了实验参考     

不同因素对非甲基化CpG ODN佐剂活性的影响

cpG ODN即含有胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸的寡脱氧核苷酸，研究发现，非甲基化的CpG ODN能够显著促进机体的特异性及非特异性免疫应答，是一种高效的THl型疫苗佐剂，它的佐剂活性与其结构有着密切的关系。我们综合考虑了可能影响CpG CDN佐剂活性的6个因素，即骨架是否进行了硫代修饰、是否具有回文结构、CpC基序侧翼序列的种     

三类细菌基因组和CpG ODN作为禽流感病毒H5N1亚型灭活油乳苗佐剂的研究

目的：通过两种免疫策略比较三类细菌基因组和CpG ODN对禽流感病毒（AIV）H5N1灭活油乳苗的影响。方法：苯酚氯仿法抽提革兰氏阴性致病菌（大肠杆菌O2）、阳性致病菌（金黄色葡萄球菌）和阳性益生菌（粪链球菌FQ68）的基因组,并人工合成CpG ODN作为AIV油乳苗的佐剂,分佐剂与油苗分开和油裹于油苗内两种途径免疫鸡群,检测血凝（HI）抗体效价、HA抗原特异性IgG效价、IL-10和IFN-γ浓度。结果：当佐剂与油苗分开免疫时,各佐剂在所有的时间点上削弱（P〉0.05）或者显著地削弱（P〈0.05）HI和血清IgG效价,稍稍提高IL-10和IFN-γ浓度（P〉0.05）;当佐剂油裹于油苗里时,CpG ODN和FQ68基因组在所有的时间点上提高（P〉0.05）或者显著地提高（P〈0.05）HI和IgG效价以及IFN-γ浓度,其中CpG ODN好于FQ68基因组,但是都降低了IL-10浓度。结论：当CpG ODN或FQ68基因组油裹在AIV油乳苗里时能提高体液、Th1型免疫水平;当佐剂和油苗分开免疫时,则免疫佐剂性不佳。     

CpG DNA的免疫学作用及其应用

CpG基序是以未甲基化CpG为核心的的寡聚脱氧核苷酸，对人及动物具有强烈的免疫刺激功能。CpGDNA可以直接激活抗原递呈细胞，诱导其产生IL-12、TNF—α等Th1型细胞因子；还可以间接刺激NK细胞分泌IFN-γ。鉴于它可优势诱导Th1为主的免疫应答，现已成为目前免疫佐剂研究的热点之一。本文对CpG DNA的免疫学作用及应用研究作一综述。     

包裹天然骨架CpG ODN和HBsAg的非磷脂脂质体疫苗的免疫效果

非磷脂脂质体NovasomeR○(Np )是由Brij5 2、胆固醇和油酸组成 ,可作为同时传递佐剂和抗原的载体。我们将HBsAg与天然骨架CpGODN (phosphodiesterCpGODN ,pdCpGODN )包裹于Np后免疫BALB/c小鼠 ,检测其免疫效果。结果显示 ,包裹pdCpGODN和HBsAg的Np在小鼠中诱导了很高滴度的抗 HBs抗体产生并诱生了HBsAgS2 8 3 9特异性的CTL ,而铝佐剂组和仅包裹HBsAg的Np组诱生的抗体滴度较低 ,未检测到CTL活力。抗体亚类分析结果表明包裹pdCpGODN和HBsAg的Np诱生的免疫应答类型与pdCpGODN剂量有关 ,较低剂量 (2 4 μgpdCpGODN )诱生的为IgG2a为主的Th1型应答 ,而较高剂量(4 7μgpdCpGODN )诱生的是Th1/Th2混合型应答。铝佐剂和仅包裹HBsAg的Np组诱生的是以IgG1为主的Th2型应答。此外 ,包裹pdCpGODN和HBsAg的Np免疫小鼠脾淋巴细胞在体外HBsAg刺激培养后特异性增殖并分泌高水平的IFN γ。这些结果表明包裹pdCpGODN和HBsAg的Np能增强HBsAg的免疫原性 ,诱生体液 /细胞免疫均衡应答 ,有可能发展为慢性乙肝的治疗性疫苗     

CpG ODN促进树突状细胞成熟的实验研究

目的：研究CpG ODN对小鼠骨髓来源的树突状细胞(bone marrow—derived dendritic cells,BMDC)分化成熟的影响。方法：以含非甲基化CpG基序的寡核苷酸(unmethylated CpG motif containing oligonucleotides,CpG ODN)刺激BMDC，流式细胞术检测DC膜表面CD80表达，ELISA检测DC分泌IL-l2水平，MTT法测定CpG ODN活化的DC刺激T细胞培殖能力。结果：CpG ODN可显著刺激DC表达CD80，分泌IL-l2，增强DC刺激T细胞增殖的能力。结论：CpG ODN可以有效促进DC的功能成熟。     

CpG 寡核苷酸链作为新型佐剂的研究进展

 1924 年 Ramon 提出免疫佐剂的概念，80 多年来，虽然进行了深入的研究，人用疫苗佐剂主要还是铝胶佐剂。直到最近几年才上市了几种新型的疫苗佐剂，如 MF59（高压条件下将鲨烯与 Tween 80 和 Span 85 混合后进行微流化形成的均一小滴状乳液，应用于美国 Chiron 公司开发的流感亚单位疫苗），重组霍乱毒素 B 亚单位（rCTB，应用于瑞典 SBL Vaccin AB 公司研发的霍乱疫苗 Dukoral），AS04（一种含有单磷脂 A 和皂角苷的油包水乳剂，应用于英国GlaxoSmithKline 公司的乙型肝炎疫苗 Fendrix）等，但应用范围较小。虽然铝胶佐剂应用最为广泛，但它存在不少缺点，已远远不能满足新型疫苗发展的要求。目前，对新型佐剂的研制与开发已成为现今疫苗研究中一个非常重要的领域。与传统佐剂相比，理想的新型佐剂应该具有以下特点：第一，化学结构明确、低相对分子质量、低毒、高效；第二，能以多种途径免疫，尤其是能以极有应用前景的黏膜免疫途径进行免疫；第三，能广泛应用于各类不同抗原，能有效控制免疫反应质量（反应类型的控制、局部免疫以及细胞类型的控制），稳定且生产成本低。 含胞嘧啶-鸟嘌呤（CpG）二核苷酸的寡核苷酸链（CpG oligodeoxynucleotides，CpG ODN）便是一种非常具有开发潜力的佐剂，这是一类合成的、包含有 1 个或多个非甲基化的 CpG 基序的单链 DNA。此类非甲基化的 CpG 二核苷酸在细菌和病毒基因组中出现的频率远高于在脊椎动物基因组中的出现频率，这种差异使得脊椎动物的免疫系统能够轻易识别入侵的外来细菌和病毒，从而引发一系列的免疫应答机制。研究表明，CpG ODN 能够选择性地促进脊椎动物的细胞和/或体液免疫，有效提升大多数疫苗的免疫效果。本文就 CpG ODN 的分类、免疫机制及其作为佐剂应用的研究进展进行综述。......     

IL-12和CpG疫苗佐剂体内对特异性CD4+T细胞免疫应答的影响

目的：观察IL-12和CpG作为疫苗佐剂在体内促进抗原特异性CD4^＋T细胞的分化和IFN-γ的产生异同.方法：自CD4^＋T细胞受体转基因（TCR-Tg）小鼠脾和淋巴结分离CD4^＋T细胞,体外利用CFSE进行标记,然后被动输给相同基因的正常小鼠.经OVA、OVA＋IL-12或OVA＋CpG免疫后,观察抗原特异性CD4^＋T细胞的组织分布,IFN-γ的表达以及与细胞分裂之间的关系.结果：未经OVA抗原免疫的小鼠,抗原特异性CD4^＋T细胞未见有增殖反应.当经OVA抗原免疫后,可见脾和肺组织中细胞增殖;IFN-γ＋细胞在脾脏、淋巴结和肺组织表达的阳性率很低,其范围为0.93%～2.17%.当经OVA＋IL-12免疫后,IL-12促进IFN-γ的表达,阳性率为4.53%～26.79%;而经OVA＋CpG免疫后,CpG只促进淋巴结中IFN-γ的表达（3.84%）.IFN-γ表达的细胞主要为分裂3～5次的细胞.结论：IL-12和CpG作为疫苗佐剂均可促进IFN-γ产生,促进细胞免疫应答.     

CpG ODN诱导浆细胞样树突状细胞免疫调节的作用机制

CpGODN是包含未甲基化的CpG基序的寡核苷酸,可以通过识别Toll样受体9(TLR9)诱导浆细胞样树突状细胞(PDC),促进其在归巢的同时由未成熟状态向成熟状态转化,并有效地提呈抗原,增加共刺激分子的表达,提供T细胞活化需要的第二信号;另外,CpGODN诱导PDC释放细胞因子IFN-α、同时在CD40L的协助下释放IL-12,由此引发T细胞向Th1方向分化和活化NK细胞,释放IFN-γ,启动先天性免疫和获得性免疫。对CpGODN的深入研究,将对抗感染、肿瘤免疫提供新的途径。