早期康复训练后大鼠脑缺血半影区生长蛋白Gap-43及突触素P38 mRNA表达的变化

背景：近年来证实，成熟大脑在存活期间仍具有再生的可塑性，即结构和功能的重建。发育成熟的中枢神经系统，在脑缺血时Gap-43表达水平是评估轴突损伤和再生反应的一个重要指标。缺血性脑卒中后神经功能的恢复与脑的呵塑性有关。目的：探讨早期康复训练对大鼠脑缺血半影区与神经重塑有关的生长蛋白Gap-43和突触素P38 mRNA的影响。设计：随机对照实验。单位：青岛大学医学院人体解剖学教研室。材料：实验于1999—12／2002—06在青岛大学医学院神经解剖实验室完成。选取成年健康雌性Wistar大鼠52只，随机分为假手术组4只，康复治疗组24只，自然恢复组24只。方法：康复治疗组和自然恢复组采用线栓法经颈外动脉插入4—0尼龙线建立大鼠大脑中动脉闭塞再灌注模型，假手术组除尼龙线插不到起始部位外，其余步骤相同。动物苏醒后出现左侧Homer征，提尾时右前肢内收屈曲，爬行时向右划圈为手术成功的标志。假手术组于术后24h取材；康复治疗组大脑中动脉闭塞120min再灌注6h后置于MG迷宫中进行康复训练，2次／d，10-20min／次，保证动物不疲劳，于术后6h，1，3，7，14，21d取材；自然恢复组术后120min再灌注6h，1，3，7，14，21d取材，作为自然病程对照。常规制作石蜡切片进行尼氏染色，应用VIDAS 21显微图像处理系统测定缺血半影区的反应产物吸光度（A）值，以同一张切片上未受损胼胝A值为背影，减去背影A值，得到校正A值。对缺血中心区的免疫活性未作量化处理。主要观察指标：①主要结局：脑缺血半影区生长蛋白Gap-43及突触素P38 mRNA原位杂交检测结果。②次要结局：康复治疗组缺血半影区细胞形态学观察．结果：实验纳入的52只大鼠全部进入结果分析。①脑缺血再灌注后不同时间点各组缺血半影区生长蛋白Gap-43和P38 mRNA的表达：假手术组皮质区着色浅，Gap-43和P38 mRNA表达的校正A值分别为0．37&;#177;0．12，0．70&;#177;0．14；自然恢复组Gap-43和P38 mRNA表达均于术后6h和3d开始增高，第7天达到高峰．第14天开始降低：康复治疗组Gap-43和P38 mRNA的表达在缺血再灌注后6h，1，3，7，14，21d均高于同期自然恢复组，但仅在第14天差异显著（1．19&;#177;．60，0．87&;#177;0．18，t=4．13，P〈0．05）。②康复治疗组细胞形态学观察结果：低倍镜下可见缺血中心区神经细胞坏死，缺血半影区神经细胞的密度降低，神经元缺血样变性。胞体缩小呈三角形、扇形或长条形，细胞核固缩深染、核仁不清，胞浆呈空泡状：皮质神经元表现为胞浆疏松，核轻度变形、深染。变性神经元与正常神经元共存。手术14d后缺血中心区和半影区可见大量胶质细胞增生。结论：与神经重塑有关的Gap-43和P38 mRNA在局部脑缺血再灌注后缺血半影区的表达十分活跃。早期康复训练能够使Gap-43和P38 mRNA神经突起出芽并形成新的突触，从而增加脑的可塑性，可能涉及脑缺血后肢体功能的恢复。     

早期康复训练后大鼠脑缺血半影区生长蛋白Gap-43及突触素P38 mRNA表达的变化

背景:近年来证实,成熟大脑在存活期间仍具有再生的可塑性,即结构和功能的重建.发育成熟的中枢神经系统,在脑缺血时Gap-43表达水平是评估轴突损伤和再生反应的一个重要指标.缺血性脑卒中后神经功能的恢复与脑的可塑性有关.目的:探讨早期康复训练对大鼠脑缺血半影区与神经重塑有关的生长蛋白Gap-43和突触素P38 mRNA的影响.设计:随机对照实验.单位:青岛大学医学院人体解剖学教研室.材料:实验于1999-12/2002-06在青岛大学医学院神经解剖实验室完成.选取成年健康雌性Wistar大鼠52只,随机分为假手术组4只,康复治疗组24只,自然恢复组24只.方法:康复治疗组和自然恢复组采用线栓法经颈外动脉插入4-0尼龙线建立大鼠大脑中动脉闭塞再灌注模型,假手术组除尼龙线插不到起始部位外,其余步骤相同.动物苏醒后出现左侧Homer征,提尾时右前肢内收屈曲,爬行时向右划圈为手术成功的标志.假手术组于术后24 h取材;康复治疗组大脑中动脉闭塞120 min再灌注6 h后置于MG迷宫中进行康复训练,2次/d,10～20 min/次,保证动物不疲劳,于术后6h,1,3,7,14,21 d取材;自然恢复组术后120 min再灌注6 h,1,3,7,14,21 d取材,作为自然病程对照.常规制作石蜡切片进行尼氏染色,应用VIDAS 21显微图像处理系统测定缺血半影区的反应产物吸光度(A)值,以同一张切片上未受损胼胝A值为背影,减去背影A值,得到校正A值.对缺血中心区的免疫活性未作量化处理.主要观察指标:①主要结局:脑缺血半影区生长蛋白Gap-43及突触素P38 mRNA原位杂交检测结果.②次要结局:康复治疗组缺血半影区细胞形态学观察.结果:实验纳入的52只大鼠全部进入结果分析.①脑缺血再灌注后不同时间点各组缺血半影区生长蛋白Gap-43和P38 mRNA的表达:假手术组皮质区着色浅,Gap-43和P38 mRNA表达的校正A值分别为0.37±0.12,0.70±0.14;自然恢复组Gap-43和P38 mRNA表达均于术后6 h和3 d开始增高,第7天达到高峰,第14天开始降低.康复治疗组Gap-43和P38 mRNA的表达在缺血再灌注后6 h,1,3,7,14,21 d均高于同期自然恢复组,但仅在第14天差异显著(1.19±0.60,0.87±0.18,t=4.13,P＜0.05).②康复治疗组细胞形态学观察结果:低倍镜下可见缺血中心区神经细胞坏死,缺血半影区神经细胞的密度降低,神经元缺血样变性.胞体缩小呈三角形、扇形或长条形,细胞核固缩深染、核仁不清,胞浆呈空泡状.皮质神经元表现为胞浆疏松,核轻度变形、深染.变性神经元与正常神经元共存.手术14 d后缺血中心区和半影区可见大量胶质细胞增生.结论:与神经重塑有关的Gap-43和P38 mRNA在局部脑缺血再灌注后缺血半影区的表达十分活跃.早期康复训练能够使Gap-43和P38mRNA神经突起出芽并形成新的突触,从而增加脑的可塑性,可能涉及脑缺血后肢体功能的恢复.     

腹腔注射中药环维黄杨星D后高血压脑缺血再灌注大鼠生长相关蛋白43mRNA的表达

背景：生长相关蛋白43是一种与轴突生长相关的蛋白，在促进神经发育、轴突再生、突触生长、结构与功能重建等方面起关键作用；研究发现中药环维黄杨星D对实验性脑缺血再灌注大鼠脑损伤有一定保护作用。目的：观察高血压脑缺血再灌注大鼠生长相关蛋白43 mRNA表达情况及中药环维黄杨星D的影响。设计：随机对照动物实验。单位：佛山市中医院，广东省中医院中心实验室。材料：环维黄杨星D是从中药黄杨宁中提取的生物碱单体，环维黄杨星D粉剂由南京小营药制药厂生产提供，国家中药保护品种号ZYB20796057。SD大鼠120只，清洁级雄性，鼠龄两三个月，体质量90～120g。方法：实验于2005-06／2006-03在佛山市中医院、广东省中医院中心实验室完成。①双肾双夹法建立易卒中型肾血管性高血压大鼠模型，120只大鼠随机分为不施任何处理的肾血管性高血压大鼠空白组20只、仅作手术创伤的假手术组20只、脑缺血再灌注模型组40只和环维黄杨星D治疗组40只。②线栓法复制一侧大脑中脉闭塞脑缺血-再灌注模型，环维黄杨星D治疗组在缺血2h再灌注后分别每天腹腔注射环维黄杨星D6．48mg/kg加生理盐水1．5mL，2次／d；对照组中的各小组则同步腹腔注射生理盐水2mL／次，用法同治疗组；各组每天两次注射时间相隔7h。各组分别在缺血再灌注第1，7，14，30d处死。③制作脑片，用原位杂交检测不同时间点各组大鼠脑生长相关蛋白43 mRNA表达。主要观察指标：①脑缺血再灌注2h后，缺血区周围生长相关蛋白43 mRNA表达情况。②脑缺血再灌注2h后海马区生长相关蛋白43 mRNA表达。结果：120只大鼠全部进入结果分析。①生长相关蛋白43 mRNA免疫原位杂交结果：各组大鼠脑内海马结构，可以检测到表达较弱的生长相关蛋白43 mRNA的阳性细胞，脑缺血再灌注后血肿周围缺血半暗区表达丘脑生长相关蛋白43 mRNA的阳性表达细胞。②脑缺血再灌注后血肿周围生长相关蛋白43 mRNA表达情况：在空白组、假手术组未见阳性细胞；缺血再灌注后模型组1d出现血肿周围缺血半暗区生长相关蛋白43 mRNA阳性细胞，7d明显增多，14d逐渐减少，30d仍有表达但明显减少，各时问点表达差异有显著性（P〈0．01）；环维黄杨星D治疗组血肿周围生长相关蛋白43 mRNA阳性表达细胞在各时间点较模型组多，差异有显著性（P〈0．05）。③脑缺血再灌注后大鼠海马区生长相关蛋白43 mRNA表达情况：空白组与假手术组比较差异无显著性；模型组自造模后，1d可见海马区较多的生长相关蛋白43 mRNA阳性细胞，7d达到高峰，14d后逐渐下降．30d表达明显减少，但仍较假手术组明显多；环维黄杨星D治疗组海马区生长相关蛋白43 mRNA阳性细胞在各个时间点均比模型组多，差异有显著性（P〈0．01）。结论：环维黄杨星D上调实验性脑缺血再灌注大鼠脑生长相关蛋白43 mRNA的表达，可能与促进轴突的再生有关。     

腹腔注射中药环维黄杨星D后高血压脑缺血再灌注大鼠生长相关蛋白43 mRNA的表达

背景:生长相关蛋白43是一种与轴突生长相关的蛋白,在促进神经发育、轴突再生、突触生长、结构与功能重建等方面起关键作用;研究发现中药环维黄杨星D对实验性脑缺血再灌注大鼠脑损伤有一定保护作用。目的:观察高血压脑缺血再灌注大鼠生长相关蛋白43mRNA表达情况及中药环维黄杨星D的影响。设计:随机对照动物实验。单位:佛山市中医院,广东省中医院中心实验室。材料:环维黄杨星D是从中药黄杨宁中提取的生物碱单体,环维黄杨星D粉剂由南京小营药制药厂生产提供,国家中药保护品种号ZYB20796057。SD大鼠120只,清洁级雄性,鼠龄两三个月,体质量90～120g。方法:实验于2005-06/2006-03在佛山市中医院、广东省中医院中心实验室完成。①双肾双夹法建立易卒中型肾血管性高血压大鼠模型,120只大鼠随机分为不施任何处理的肾血管性高血压大鼠空白组20只、仅作手术创伤的假手术组20只、脑缺血再灌注模型组40只和环维黄杨星D治疗组40只。②线栓法复制一侧大脑中脉闭塞脑缺血-再灌注模型,环维黄杨星D治疗组在缺血2h再灌注后分别每天腹腔注射环维黄杨星D6.48mg/kg加生理盐水1.5mL,2次/d;对照组中的各小组则同步腹腔注射生理盐水2mL/次,用法同治疗组;各组每天两次注射时间相隔7h。各组分别在缺血再灌注第1,7,14,30d处死。③制作脑片,用原位杂交检测不同时间点各组大鼠脑生长相关蛋白43mRNA表达。主要观察指标:①脑缺血再灌注2h后,缺血区周围生长相关蛋白43mRNA表达情况。②脑缺血再灌注2h后海马区生长相关蛋白43mRNA表达。结果:120只大鼠全部进入结果分析。①生长相关蛋白43mRNA免疫原位杂交结果:各组大鼠脑内海马结构,可以检测到表达较弱的生长相关蛋白43mRNA的阳性细胞,脑缺血再灌注后血肿周围缺血半暗区表达丘脑生长相关蛋白43mRNA的阳性表达细胞。②脑缺血再灌注后血肿周围生长相关蛋白43mRNA表达情况:在空白组、假手术组未见阳性细胞;缺血再灌注后模型组1d出现血肿周围缺血半暗区生长相关蛋白43mRNA阳性细胞,7d明显增多,14d逐渐减少,30d仍有表达但明显减少,各时间点表达差异有显著性(P<0.01);环维黄杨星D治疗组血肿周围生长相关蛋白43mRNA阳性表达细胞在各时间点较模型组多,差异有显著性(P<0.05)。③脑缺血再灌注后大鼠海马区生长相关蛋白43mRNA表达情况:空白组与假手术组比较差异无显著性;模型组自造模后,1d可见海马区较多的生长相关蛋白43mRNA阳性细胞,7d达到高峰,14d后逐渐下降,30d表达明显减少,但仍较假手术组明显多;环维黄杨星D治疗组海马区生长相关蛋白43mRNA阳性细胞在各个时间点均比模型组多,差异有显著性(P<0.01)。结论:环维黄杨星D上调实验性脑缺血再灌注大鼠脑生长相关蛋白43mRNA的表达,可能与促进轴突的再生有关。     

生长相关蛋白-43及mRNA在大鼠损伤坐骨神经中的表达

目的探讨坐骨神经离断后,其远侧端组织中生长相关蛋白-43mRNA(GAP-43mRNA)及其蛋白表达的变化,为临床神经修复过程中更好地改善微环境提供实验依据。方法正常SD大鼠24只,行坐骨神经横断术,术后1,2,3,4周取坐骨神经远侧端组织,以WesternBlot和RT-PCR法检测GAP-43及其mRNA的表达。结果RT-PCR结果显示,正常大鼠坐骨神经组织中GAP-43mRNA表达量较低,损伤坐骨神经远侧端GAP-43mRNA的表达量明显增加,于损伤第2周时达高峰。采用抗GAP-43抗体,进行WesternBlot检测结果:正常坐骨神经43kDa处出现弱阳性反应的蛋白区带,损伤后坐骨神经远侧端43kDa处阳性反应条带着色明显加深,损伤后第3周时阳性反应着色最强。结论GAP-43及其mRNA在大鼠损伤坐骨神经远侧端组织中表达增强,其mRNA表达上调高峰在神经损伤后的第2周;而其蛋白合成增加最为明显的时间是在神经损伤后的第3周。     

大鼠脑缺血/再灌注损伤后神经再生与Nogo-A蛋白、GAP-43基因表达的关系

目的:探讨大鼠脑缺血/再灌注损伤后神经轴突生长抑制因子(Nogo-A)蛋白及生长相关蛋白-43(GAP-43)基因参与神经再生的表达机制。方法:成年健康雄性Wistar大鼠162只,随机分为TUNEL组、Nogo-A组和GAP-43组各54只,各组按照实验要求再随机分为假手术组(A)大鼠6只和缺血1h再灌注(B)大鼠48只,B根据再灌注后2、6及12h,1、2、3、7和14d各6只,采用改良线栓法成功制备各组中B大鼠脑中动脉闭塞再灌注模型(MCAO),利用免疫组织化学方法检测神经细胞凋亡、Nogo-A蛋白和GAP-43基因在海马、皮质和纹状体区的表达并观察脑缺血半影区神经元再生以及梗死灶修复的动态变化。结果:3组中A大鼠在海马、皮质和纹状体区仅见少量凋亡神经细胞以及Nogo-A蛋白和GAP-43基因表达。B大鼠造模成功后2h点阳性细胞表达均开始增加,3d时凋亡细胞、Nogo-A蛋白和GAP-43基因表达达高峰;14d时凋亡细胞呈显著降低,Nogo-A蛋白表达降至最低水平,而14d时GAP-43基因呈较低表达(均P0.05)。结论:Nogo-A蛋白表达对神经元轴突再生具有抑制作用;而GAP-43基因表达能够促进神经可塑性再生。     

电针对坐骨神经损伤大鼠脊髓生长相关蛋白-43mRNA表达的影响

目的:探讨电针对坐骨神经损伤大鼠的脊髓中神经生长相关蛋白-4(GAP-43)mRNA表达的影响。方法:60只Wistar大鼠制成坐骨神经损伤模型,经电针穴位刺激治疗后用原位杂交技术观察坐骨神经相应脊髓节段GAP-43mRNA的表达。结果:电针组第1天阳性细胞数增多(23.5±4.1)个/mm2,3d达高峰(46.8±6.8)个/mm2,14d后明显减少(9.7±3.6)个/mm2,28d后基本未见阳性细胞存在(1.0±1.2)个/mm2;模型组第1天(16.3±2.9)个/mm2至第7天(20.1±2.5)个/mm2持续阳性细胞数增多,1d略减少(19.1±3.2)个/mm2,28d后仍可见阳性细胞存在(8.5±2.0)个/mm2。与电针组比较差异有显著性意义(t=2.36～4.25,P0.05)。结论:穴位电针能增强并缩短GAP-43mRNA表达时间,有利于突触重建。     

通心络胶囊对局灶性脑缺血大鼠半暗区GAP-43和突触素表达的影响

目的观察通心络胶囊对大鼠大脑中动脉栓塞后缺血半暗区生长相关蛋白-43（GAP-43）和突触素（Syp）表达的影响。方法将55只雄性SD大鼠随机分为通心络组、自然恢复组和假手术组。应用线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞模型（MCAO）,以免疫组化及图像分析技术检测脑缺血后1、3、7、14、28d缺血半暗区GAP-43和Syp的表达。结果脑缺血后缺血半暗区GAP-43表达自术后1、3d开始增高,第7d达到高峰,自第14d开始降低。自然恢复组Syp于缺血后1d表达减少,3d达最低值,1周开始增高但不及正常表达数值,2、4周表达高于假手术对照组。通心络组缺血半暗区GAP-43和Syp的表达分别在3d和1、2、4周时高于自然恢复组。结论通心络可促进卒中后缺血半暗区GAP-43和Syp的表达,具有促进突触再建和增强、完善突触功能的作用。     

颈髓损伤后生长相关蛋白43及内皮素1 mRNA表达与血脊髓屏障的损害

目的：探讨颈髓损伤后生长相关蛋白43 mRNA及内皮素1 mRNA表达与血脊髓屏障损害的关系。 方法：实验于2004-09／2005-03在郑州大学基础医学院人体解剖学教研室神经分子生物学实验室完成。选择健康雄性wistar大鼠60只制作脊髓损伤模型，随机分为5组，假手术组、颈髓损伤后6，12，24，72h组，每组12只。①反转录-聚合酶链反应：颈髓组织总RNA提取各组分别取6只动物采用Trizol试剂提取组织总RNA。用紫外分光光度计测定总RNA的A260和A280值，判定RNA的纯度计算出总RNA的含量。第一链cDNA合成：取2μg总RNA于65℃变性3min，依次加入10&;#215;Buffer，25mmol/L氯化镁，10mmol/L 2’-脱氧核苷三磷酸混合物，寡聚核苷酸引物和RNA酶抑制剂（RNasin）与反转录酶，总反应体积20μL，置42℃保温90min。②聚合酶链反应：取1／10体积（7μL）反转录液，分别加入200μmol／L 2’-脱氧核苷三磷酸，50μmol／L寡聚核苷酸引物，0．5μL[α-^32P]dCTP（北京福瑞公司），1&;#215;Buffer，2．5U TaqDNA聚合酶。总反应体积为100μL。生长相关蛋白43的变性、退火和延伸温度分别为92，45，72℃，内皮素1所用的变性、退火和延伸温度分别为94，55，72℃，反应时间分别为1，2，3min，共进行35个循环。首次循环前先行94℃变性2min。最后一个循环于72℃延伸13min。反应完后取10μL反转录一聚合酶链反应的反应物行10s／L琼脂糖凝胶电泳分析。于紫外灯下切取含有聚合酶链反应产物的凝胶条带，用液体闪烁计数仪测定扩增物叩的放射强度。主要观察颈髓损伤后颈髓组织生长相关蛋白-43 mRNA及内皮素1 mRNA表达。 结果：纳入动物60只，均进入结果分析。伤后6-72h颈髓组织生长相关蛋白43 mRNA及内皮素1 mRNA均较假手术组明显增高（P〈0．05）。 结论：颈髓损伤后生长相关蛋白43 mRNA及内皮素1 mRNA表达水平增加与伤后血脊髓屏障损害的发生、发展密切相关，生长相关蛋白、内皮素在颈髓损伤后血脊髓屏障损害的病理生理过程中起重要作用。     

丁苯酞注射液对血管性痴呆大鼠海马区生长相关蛋白-43及突触素P38表达的影响

目的:观察丁苯酞注射液对血管性痴呆(VD)模型大鼠海马区生长相关蛋白-43(GAP-43)和突触素P38在mRNA及蛋白表达水平的影响。方法:采用永久性结扎双侧颈总动脉的方法制备模型。80只大鼠随机分为假手术组、VD组、丁苯酞组。Y-型迷宫观测学习记忆能力,RT-PCR和Western Blot检测GAP-43及突触素P38的mRNA和蛋白表达。结果:VD组和丁苯酞组GAP-43 mRNA较假手术组升高(均P<0.05),丁苯酞组较VD组升高更明显(P<0.05);丁苯酞组GAP-43蛋白较假手术组和VD组均升高(均P<0.05),VD组和假手术组相比差异无显著性(P>0.05)。丁苯酞组突触素P38 mRNA较假手术组和VD组上调(均P<0.05),假手术组和VD组相比差异无显著性(P>0.05);VD组和丁苯酞组突触素P38蛋白较假手术组明显下调(均P<0.05),VD组下调更明显(P<0.05)。结论:丁苯酞注射液能提高VD大鼠海马区突触素P38及GAP-43基因及其蛋白的表达,从而改善其认知功能。     

不同剂量维生素E对大鼠脑缺血再灌注后GAP-43及突触素P38表达的影响

目的 研究不同剂量维生素E（VitE）对大鼠局灶性脑缺血再灌注后梗死周围区生长相关蛋白-43（GAP-43）及突触素P38表达的影响,从而进一步探讨抗氧化剂在脑缺血损伤中的作用机制及VitE应用剂量.方法 成年健康雌性Wistar大鼠125只,随机分成假手术组、对照组、大剂量VitE组（300 mg/kg）、中剂量VitE组（50 mg/kg）和小剂量VitE组（2.5 mg/kg）.采用线栓法建立大脑中动脉缺血再灌注（MCAO）动物模型.各组分别于术后6 h、1 d、3 d.7 d、14d取脑片.应用免疫组化方法观察脑缺血再灌注后GAP-43和P38的表达.结果 （1）小剂量VitE组GAP-43和P38表达较对照组有所增高,但差异无显著性（P＞0.05）.（2）大、中剂量VitE组间GAP-43和P38表达比较未见明显变化（P＞0.05）.（3）大、中剂量VitE组与对照组比较：GAP-43表达增高,1 d、3 d、7 d、14 d各时间点差异均有显著性（P＜0.05）;P38表达也增高,3 d,7 d、14 d时间点差异具有显著性（P＜0.05）.结论 抗氧化剂VitE可增强中枢神经系统损伤后神经元再生重塑功能.对于VitE最佳剂量的选择,尚有待进一步研究.     

颈髓损伤后生长相关蛋白43及内皮素1 mRNA表达与血脊髓屏障的损害

目的:探讨颈髓损伤后生长相关蛋白43mRNA及内皮素1mRNA表达与血脊髓屏障损害的关系。方法:实验于2004-09/2005-03在郑州大学基础医学院人体解剖学教研室神经分子生物学实验室完成。选择健康雄性wistar大鼠60只制作脊髓损伤模型,随机分为5组,假手术组、颈髓损伤后6,12,24,72h组,每组12只。①反转录-聚合酶链反应:颈髓组织总RNA提取各组分别取6只动物采用Trizol试剂提取组织总RNA。用紫外分光光度计测定总RNA的A260和A280值,判定RNA的纯度计算出总RNA的含量。第一链cDNA合成:取2μg总RNA于65℃变性3min,依次加入10×Buffer,25mmol/L氯化镁,10mmol/L2’-脱氧核苷三磷酸混合物,寡聚核苷酸引物和RNA酶抑制剂穴RNasin雪与反转录酶,总反应体积20μL,置42℃保温90min。②聚合酶链反应:取1/10体积穴7μL雪反转录液,分别加入200μmol/L2’-脱氧核苷三磷酸,50pmol/L寡聚核苷酸引物,0.5μL[α-32P]dCTP穴北京福瑞公司雪,1×Buffer,2.5UTaqDNA聚合酶。总反应体积为100μL。生长相关蛋白43的变性、退火和延伸温度分别为92,45,72℃,内皮素1所用的变性、退火和延伸温度分别为94,55,72℃,反应时间分别为1,2,3min,共进行35个循环。首次循环前先行94℃变性2min。最后一个循环于72℃延伸13min。反应完后取10μL反转录-聚合酶链反应的反应物行10g/L琼脂糖凝胶电泳分析。于紫外灯下切取含有聚合酶链反应产物的凝胶条带,用液体闪烁计数仪测定扩增物32P的放射强度。主要观察颈髓损伤后颈髓组织生长相关蛋白-43mRNA及内皮素1mRNA表达。结果:纳入动物60只,均进入结果分析。伤后6～72h颈髓组织生长相关蛋白43mRNA及内皮素1mRNA均较假手术组明显增高穴P<0.05雪。结论:颈髓损伤后生长相关蛋白43mRNA及内皮素1mRNA表达水平增加与伤后血脊髓屏障损害的发生、发展密切相关,生长相关蛋白、内皮素在颈髓损伤后血脊髓屏障损害的病理生理过程中起重要作用。     

大鼠脑缺血再灌注后半影区葡萄糖转运体3表达的变化

背景：近年来的研究表明，缺血缺氧导致脑内代谢异常乃至能量衰竭，是引起脑组织损伤坏死的重要原因，可见能量代谢障碍是脑缺血再灌注损伤的中心问题。在脑的能量代谢中葡萄糖转运体3中发挥着重要作用。 目的：观察大鼠局灶性脑缺血不同缺血时间和不同再灌注时间的脑梗死体积比、皮质半影区葡萄糖转运体3转录水平和蛋白水平的表达。 设计：随机对照实验。 单位：中山大学附属第二医院神经外科。材料：实验于2002-08／10在中山大学附属第二医院医学研究中心动物试验室完成。选择SD大鼠56只，随机分成3组：①缺血1h再灌注组28只。②缺血3h再灌注组24只。③假手术对照组4只。缺血1h再灌注组白缺血开始分别选取1，3，6，12，24，72h，1周7个时间点，每个时间点7只大鼠；缺血3h再灌注组除无1h时点外，其余时间点与缺血1h再灌注组相同，假手术对照组只作切口，不作插线。 方法：用线栓法复制大鼠局灶性脑缺血模型，检测缺血中心区和缺血半影区脑梗死体积比；剥取缺血半影区皮质组织。采用反转录-聚合酶链反应测定葡萄糖转运体3mRNA水平的变化；用免疫组织化学方法半定量测定葡萄糖转运体3蛋白水平的变化。 主要观察指标：①各组大鼠脑缺血再灌注后的脑梗死面积。②各组大鼠脑缺血再灌注后的葡萄糖转运体3mRNA表达水平的变化。③各组大鼠脑缺血再灌注后的葡萄糖转运体3蛋白水平表达的变化。 结果：56只大鼠均进入结果分析。①脑缺血1h后再灌注组的脑梗死体积明显小于缺血3h再灌注组梗死体积。②葡萄糖转运体3mRNA及蛋白水平表达变化：葡萄糖转运体3白3h即开始升高，24h到达高峰，1周时仍高于假手术对照组；缺血3h再灌注组在3h有一下降点，然后升高，24h到高峰，1周时接近正常水平。葡萄糖转运体3蛋白水平的表达与mRNA相符合。 结论：葡萄糖转运体3在缺血半影区的表达上调，可能是机体对缺血再灌注的保护性反应。     

局灶性脑缺血大鼠海马CA3区突触体素的动态表达

背景：突触体素(synaptophysin，SYN)与神经生长、修复、再生和突触重塑密切相关，成为近年来医学研究的热点。以往学者对脑缺血再灌注大鼠模型顶叶突触体素表达研究较多。采用线栓法堵塞大鼠大脑中动脉，建立局灶性脑缺血模型，观察海马CA3区突触体素的动态表达，可为临床研究脑缺血后神经重塑提供理论依据。目的：研究局灶性脑缺血后海马CA3区突触体素的动态表达以及神经修复的可塑性。设计：随机对照的实验研究。单位：承德医学院附属医院老年病科、承德医学院解剖教研室和河北医科大学。材料：选取健康成年SD大鼠40只，随机分为脑缺血组和对照组，每组又分为7，14，21，30d4个时间点，每个时间点取5只大鼠。干预：采用线栓法建立大脑中动脉脑缺血大鼠模型，采用苏木精一伊红染色，光镜下观察有无梗死灶。应用免疫组化技术观察海马CA3区突触体素的表达。主要观察指标：①苏木精-伊红染色结果。②海马CA3区突触体素的表达。结果：假手术组在大脑皮质及海马区，苏木精．伊红染色可见神经元呈层状分布，各层细胞数量较多，形态完整，细胞核圆大且核仁明显，核仁被染成紫色，胞浆呈浅粉色，神经元同周围组织间无空隙存在。缺血组可见梗死灶，表现为正常结构消失，排列紊乱，细胞数量减少，胞核固缩、深染。假手术组SYN阳性神经元的吸光度值各时间点比较差异无显著性意义(P&;gt;0.05)。实验组同假手术组比较，SYN吸光度值明显降低(P&;lt;0.01)，组内7～21d时的吸光度值逐渐升高，且差异有显著性意义(P&;lt;0.01)，30d时SYN的吸光值降低，但同21d时相比差异无显著性意义(P&;gt;0.05)。结论：脑缺血损伤后海马CA3区突触体素表达减少，但机体自身存在着神经元的修复和再生，可使突触体素的表达逐渐上调。     

大鼠坐骨神经损伤性疼痛的行为观察和背根神经节中生长相关蛋白表达的变化

目的：观测坐骨神经损伤对大鼠行为的改变，以及运用免疫组化技术观察大鼠坐骨神经损伤对相应背根神经节中生长相关蛋白表达的影响，探讨生长相关蛋白与神经损伤所致的自发性疼痛的关系。 方法：实验于2004-04／2005-04在汕头大学医学院第二附属医院外科和病理实验室完成。250只Wistar大鼠随机分成3组：神经切断组120只、神经压榨组120只、正常对照组10只；神经切断组，神经压榨组按存活时间不同再各分为3，7，14，21，30，60d6个亚组，每个亚组20只。用自噬评分方法观察大鼠神经损伤后的行为改变；并处死取材L5节段损伤侧背根神经节用免疫组化方法研究生长相关蛋白表达的变化。 结果：250只大鼠全部进入结果分析。①自噬评分：神经损伤后，神经切断各亚组自噬发生率均比神经压榨各亚组高，程度也较重。神经切断60d组自噬平均分为2．1，而神经压榨60d组仅为0．7分。②生长相关蛋白表达：神经切断组背根神经节生长相关蛋白免疫阳性标志平均吸光度表达伤后7d达高峰（0．614&;#177;0．004），持续到伤后60d仍有高表达（0.515&;#177;0．004）；而神经压榨组伤后14d才达高峰（0．583&;#177;0．006），伤后21d即有所下降（0．563&;#177;0．008），伤后60d基本回复到正常水平（0．231&;#177;0．003）；正常对照组背根神经节仅有少量表达（0．225&;#177;0．005）。神经损伤后神经切断组、神经压榨组生长相关蛋白的表达与正常对照组比较差异有显著性意义（t=14．726，t=4．074，P≤0．05）；神经切断组、神经压榨组伤后的表达差异也存在显著性意义（t=3．357，P≤0．05）。 结论：不同的坐骨神经损伤方法所致的大鼠自噬程度和生长相关蛋白表达变化不同，提示神经源性疼痛的发生可能与神经的可塑性有关。     

大鼠脑缺血再灌注后半影区葡萄糖转运体3表达的变化

背景近年来的研究表明,缺血缺氧导致脑内代谢异常乃至能量衰竭,是引起脑组织损伤坏死的重要原因,可见能量代谢障碍是脑缺血再灌注损伤的中心问题.在脑的能量代谢中葡萄糖转运体3中发挥着重要作用.目的观察大鼠局灶性脑缺血不同缺血时间和不同再灌注时间的脑梗死体积比、皮质半影区葡萄糖转运体3转录水平和蛋白水平的表达.设计随机对照实验.单位中山大学附属第二医院神经外科.材料实验于2002-08/10在中山大学附属第二医院医学研究中心动物试验室完成.选择SD大鼠56只,随机分成3组①缺血1 h再灌注组28只.②缺血3 h再灌注组24只.③假手术对照组4只.缺血1 h再灌注组自缺血开始分别选取1,3,6,12,24,72 h,1周7个时间点,每个时间点7只大鼠;缺血3 h再灌注组除无1 h时点外,其余时间点与缺血1 h再灌注组相同,假手术对照组只作切口,不作插线.方法用线栓法复制大鼠局灶性脑缺血模型,检测缺血中心区和缺血半影区脑梗死体积比;剥取缺血半影区皮质组织,采用反转录-聚合酶链反应测定葡萄糖转运体3 mRNA水平的变化;用免疫组织化学方法半定量测定葡萄糖转运体3蛋白水平的变化.主要观察指标①各组大鼠脑缺血再灌注后的脑梗死面积.②各组大鼠脑缺血再灌注后的葡萄糖转运体3 mRNA表达水平的变化.③各组大鼠脑缺血再灌注后的葡萄糖转运体3蛋白水平表达的变化.结果56只大鼠均进入结果分析.①脑缺血1 h后再灌注组的脑梗死体积明显小于缺血3 h再灌注组梗死体积.②葡萄糖转运体3 mRNA及蛋白水平表达变化葡萄糖转运体3自3 h即开始升高,24 h到达高峰,1周时仍高于假手术对照组;缺血3 h再灌注组在3 h有一下降点,然后升高,24 h到高峰,1周时接近正常水平.葡萄糖转运体3蛋白水平的表达与mRNA相符合.结论葡萄糖转运体3在缺血半影区的表达上调,可能是机体对缺血再灌注的保护性反应.     

骨髓间充质干细胞移植在脑缺血损伤中的作用与生长相关蛋白-43表达的相关性

目的：探讨脑缺血/再灌注损伤后大鼠脑内介导骨髓间充质干细胞（MSCs）后神经组织修复和行为学变化的作用机制;观察生长相关蛋白-43（GAP-43）在神经元可塑性中的作用。方法：成年健康雄性Wistar大鼠118只分为假手术组42只,再灌注组42只及移植组30只,另4只大鼠为细胞的移植供体。将再灌注组及移植组成功制备为脑缺血再灌注损伤模型。移植组大鼠于造模3 d时颅内注射经培养纯化后的MSCs 10μl。造模后3、8、164、8 h及5、91、6 d时再灌注组及假手术组各取6只,移植组于8、164、8 h及5、91、6 d时取5只,观察凋亡细胞及GAP-43阳性细胞在皮质及海马区的表达;缺血半影区梗死灶的形成和移植细胞定向迁移的动态变化。结果：与再灌注组比较,移植组在移植后5 d梗死灶区MSCs及GAP-43阳性细胞数明显增加,9 d时达高峰,16 d时呈低水平表达;16 d时神经功能缺损程度评分明显降低（均P〈0.05,0.01）。结论：MSCs脑内移植可介导缺血半影区梗死面积的修复;GAP-43表达抑制神经元凋亡,促进细胞的可塑性。     

喂饲大豆磷脂酰胆碱幼年大鼠脊髓突触素的表达变化

目的：观察大豆磷脂酰胆碱对幼年大鼠脊髓前角内突触素表达的影响，探讨大鼠脊髓神经突触可塑性及大豆磷脂酰胆碱的作用途径。 方法：实验于2004—03／12在兰州大学基础医学院神经研究室完成。选择5周龄健康雄性Wistar大鼠22只，随机分为2组，大豆磷脂酰胆碱组和对照组各11只。大豆磷脂酰胆碱组大鼠给予大豆磷脂酰胆碱500mg／（kg&;#183;d），溶于50mL双蒸水灌胃，1次／d。对照组大鼠等量双蒸水，灌胃，1次／d。每3天测1次体质量，大豆磷脂酰胆碱剂量随体质量变化相应调整，共喂养8周。喂养8周后，两组大鼠均用水合氯醛腹腔注射麻醉。灌注固定，取胸段脊髓中段和腰膨大最粗处经石蜡包埋后进行连续切片，进行免疫组化法染色。测量胸段和腰膨大脊髓灰质前角区各视野突触素的免疫反应阳性产物灰度值，被测区突触素含量越高，免疫染色越深，则灰度值越小，反之越大。 结果：22只大鼠全部进入结果分析，无脱失。①大豆磷脂酰胆碱组大鼠胸段和腰膨大脊髓灰质前角区突触素的免疫反应阳性产物染色较深，呈棕黄色阳性颗粒，胸段和腰膨大脊髓突触素灰度值均显著小于对照组[221．50&;#177;2．18，239．14&;#177;1．90；238．33&;#177;2．12，256．36&;#177;2．20（t=5．525，4．892，P〈0．01）1。②两组大鼠胸段前角突触素灰度值均显著小于腰膨大灰度值（t=5．918，5．375，P〈0．01）。 结论：幼年大鼠经大豆磷脂酰胆碱喂饲后，脊髓突触素的免疫表达增强，提示大豆磷脂酰胆可以提高幼年大鼠脊髓神经突触可塑性，而且胸段脊髓的突触可塑性强于腰膨大。     

局灶性脑缺血大鼠海马CA3区突触体素的动态表达

背景突触体素(synaptophysin,SYN)与神经生长、修复、再生和突触重塑密切相关,成为近年来医学研究的热点.以往学者对脑缺血再灌注大鼠模型顶叶突触体素表达研究较多.采用线栓法堵塞大鼠大脑中动脉,建立局灶性脑缺血模型,观察海马CA3区突触体素的动态表达,可为临床研究脑缺血后神经重塑提供理论依据.目的研究局灶性脑缺血后海马CA3区突触体素的动态表达以及神经修复的可塑性.设计随机对照的实验研究.单位承德医学院附属医院老年病科、承德医学院解剖教研室和河北医科大学.材料选取健康成年SD大鼠40只,随机分为脑缺血组和对照组,每组又分为7,14,21,30 d 4个时间点,每个时间点取5只大鼠.干预采用线栓法建立大脑中动脉脑缺血大鼠模型,采用苏木精-伊红染色,光镜下观察有无梗死灶.应用免疫组化技术观察海马CA3区突触体素的表达.主要观察指标①苏木精-伊红染色结果.②海马CA3区突触体素的表达.结果假手术组在大脑皮质及海马区,苏木精-伊红染色可见神经元呈层状分布,各层细胞数量较多,形态完整,细胞核圆大且核仁明显,核仁被染成紫色,胞浆呈浅粉色,神经元同周围组织间无空隙存在.缺血组可见梗死灶,表现为正常结构消失,排列紊乱,细胞数量减少,胞核固缩、深染.假手术组SYN阳性神经元的吸光度值各时间点比较差异无显著性意义(P＞0.05).实验组同假手术组比较,SYN吸光度值明显降低(P＜0.01),组内7～21 d时的吸光度值逐渐升高,且差异有显著性意义(P＜0.01),30 d时SYN的吸光值降低,但同21 d时相比差异无显著性意义(P＞0.05).结论脑缺血损伤后海马CA3区突触体素表达减少,但机体自身存在着神经元的修复和再生,可使突触体素的表达逐渐上调.     

大鼠坐骨神经损伤性疼痛的行为观察和背根神经节中生长相关蛋白表达的变化

目的:观测坐骨神经损伤对大鼠行为的改变,以及运用免疫组化技术观察大鼠坐骨神经损伤对相应背根神经节中生长相关蛋白表达的影响,探讨生长相关蛋白与神经损伤所致的自发性疼痛的关系。方法:实验于2004-04/2005-04在汕头大学医学院第二附属医院外科和病理实验室完成。250只Wistar大鼠随机分成3组:神经切断组120只、神经压榨组120只、正常对照组10只;神经切断组,神经压榨组按存活时间不同再各分为3,7,14,21,30,60d6个亚组,每个亚组20只。用自噬评分方法观察大鼠神经损伤后的行为改变;并处死取材L5节段损伤侧背根神经节用免疫组化方法研究生长相关蛋白表达的变化。结果:250只大鼠全部进入结果分析。①自噬评分:神经损伤后,神经切断各亚组自噬发生率均比神经压榨各亚组高,程度也较重。神经切断60d组自噬平均分为2.1,而神经压榨60d组仅为0.7分。②生长相关蛋白表达:神经切断组背根神经节生长相关蛋白免疫阳性标志平均吸光度表达伤后7d达高峰(0.614±0.004),持续到伤后60d仍有高表达(0.515±0.004);而神经压榨组伤后14d才达高峰(0.583±0.006),伤后21d即有所下降(0.563±0.008),伤后60d基本回复到正常水平(0.231±0.003);正常对照组背根神经节仅有少量表达(0.225±0.005)。神经损伤后神经切断组、神经压榨组生长相关蛋白的表达与正常对照组比较差异有显著性意义(t=14.726,t=4.074,P≤0.05);神经切断组、神经压榨组伤后的表达差异也存在显著性意义(t=3.357,P≤0.05)。结论:不同的坐骨神经损伤方法所致的大鼠自噬程度和生长相关蛋白表达变化不同,提示神经源性疼痛的发生可能与神经的可塑性有关。