干扰素联合茵莲清肝颗粒治疗慢性乙型肝炎的临床研究

目的研究在病毒性慢性乙型肝炎（CHB）的治疗中,采用干扰素（IFN）α-2b联合茵莲清肝颗粒治疗的临床疗效。方法选取94例病毒性慢性乙型肝炎患者为研究对象,随机分为3组,分别采取单纯的护肝药物治疗、IFNα-2b（肌注）,及IFNα-2b联合茵莲清肝颗粒治疗,三组疗程均为24周。观察血清HBV-DNA及HBsAg、HBeAg的阴转情况。结果联合组的HBV-DNA下降程度及HBsAg阴转率则高于IFN-α2b组（P〈0.05）;完全应答率和部分应答率比较,IFN-α2b组和联合组均高于对照组（P〈0.05）;联合组则高于IFN-α2b组（P〈0.05）。结论干扰素联合茵莲清肝颗粒治疗慢性乙型肝炎,可发挥协同抗病毒作用,提高治疗效果。     

人源抗HBsAg dsFv抗体靶向干扰素重组质粒的构建与表达

目的构建抗体靶向干扰素的重组表达质粒pEE14.1-dsFvαpr+,并在真核细胞中验证重组质粒的表达情况。方法通过重叠延伸PCR将dsFv抗体重链基因与带正电荷的DNA负载区基因融合,并在抗体轻链α干扰素融合基因3′端连入6×His标签。先在过渡载体pCI-GPI中实现轻、重链复合基因的连接,然后连入pEE14.1中,最终构建重组表达质粒pEE14.1-dsFvαpr+。将重组质粒LipofectamineTM2000瞬时转染到CHO-K1细胞,采用RT-PCR、ELISA和Western blotting方法验证目的基因的表达。结果重组质粒经酶切鉴定和测序验证与设计完全一致。RT-PCR结果显示只有重组质粒转染后的细胞能够扩增出1700bp的目的条带,ELISA检测瞬时转染细胞上清α干扰素的浓度约为1.1ng/ml,Western blotting检测显示重组质粒在转染细胞上清中获得表达。结论实现了抗体靶向干扰素在单一质粒中的高效表达,通过对表达蛋白的电性改造有利于后期治疗慢性乙肝的抗体靶向纳米粒药物的研制。     

重组人干扰素α-1b联合拉米夫定治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎疗效分析

目的分析重组人干扰素α-1b和加用拉米夫定治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者的疗效和安全性,分析不同因素对疗效的影响,探索慢性乙型肝炎患者联合抗病毒治疗方法的优点。方法选择HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者111例,随机分为治疗组和对照组。治疗组62例给予重组人干扰素α-1b（50μg/次,隔日1次,肌肉注射）加拉米夫定（100mg/d,口服）,疗程为6～12个月或12个月以上。对照组49例给予重组人干扰素α-1b单药治疗（方法同前）。结果①治疗组12和18个月HBeAg血清学转换率分别为29.03%和38.71%;对照组12和18个月HBeAg血清学转换率分别为28.57%和36.73%,两组比较差异无统计学意义。②治疗组6、12、18个月的HBVDNA低于检测下限率分别为66.13%、83.87%和88.71%,对照组为8.16%、53.06%和57.14%;两组比较差异具有统计学意义。③性别、年龄对HBeAg血清学转换率无影响,治疗前HBVDNA〈6log10拷贝/ml者HBeAg血清转换率较高。④重组人干扰素α-1b组发热及血象异常发生率分别为32.26%和27.42%,对照组分别为36.73%和34.69%,两组差异无统计学意义。结论重组人干扰素α-1b联合拉米夫定治疗HBeAg血清学转换率与单用重组人干扰素α-1b无明显差异,但HBVDNA低于检测下限率明显高于单用重组人干扰素α-1b组。拉米夫定的耐药率明显降低。     

干扰素α- 1b联合拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的疗效观察

 目的探讨联合应用干扰素α-1b与拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的疗效.方法40例慢性乙型肝炎患者(治疗组)接受干扰素α-1b与拉米夫定联合治疗,干扰素α-1b500MU,1/d,肌肉注射,2周后改为隔日1次;拉米夫定100mg,1/d;联用12个月.对照组40例患者仅接受干扰素α-1b抗病毒治疗,用药方法及疗程与治疗组相同.用药期间未使用其他抗病毒药物.结果治疗期间治疗组HBVDNA阴转率、HBeAg/抗HBe血清转换率明显高于对照组(P＜0.05);ALT复常率比较差异无显著性(P＞0.05).结论联合应用干扰素α-1b与拉米夫定治疗慢性乙型肝炎较单用干扰素疗效好,为一可行的联合抗病毒治疗措施.     

重组融合蛋白Fab/IFN-αA的表达及其抗乙型肝炎病毒的作用

IFN-αA是治疗乙型病毒性肝炎有效药物,但由于其临床应用的副作用及持久应答率不超过50%,限制了其疗效的发挥[1].作者通过DNA重组技术和PCR技术将抗乙型肝炎表面抗原抗体片段Fab与IFN-αA在分子水平上进行重组,构建了人抗乙肝表面抗原抗体Fab片段/αΑ-干扰素融合蛋白原核表达载体[2].本实验将筛选出阳性克隆的菌种进行诱导表达,测定表达的重组融合蛋白(Fab/IFN-αA)的IFN-αA活性及抗体Fab活性,并应用HBV DNA转染细胞系(HepG2215细胞系)作模型[3],通过检测Fab/IFN-αA作用后细胞上清液的HBsAg、HBeAg水平的变化,结合细胞存活率来评价其抗HBV作用,并与IFN-αA进行了比较.     

干扰素α-2b干粉吸入剂在大鼠体内的耐受性和初步安全性评价

目的对干扰素α-2b干粉吸入剂在大鼠体内的耐受性和初步安全性进行评价。方法通过测定肺泡灌洗液中总蛋白含量、细胞总数及中性粒细胞占白细胞的比例来考察干扰素α-2b干粉吸入剂的耐受性;通过考察肺组织的病理变化来评估干扰素α-2b干粉吸入剂的初步安全性。结果与完全对照组相比,空气对照组、空白干粉吸入剂组以及干扰素α-2b干粉吸入剂组的总蛋白含量及中性粒细胞占白细胞的比例均有显著性差异;与空气对照组相比,空白干粉吸入剂组在4h的总蛋白含量略有增高,干扰素α-2b干粉吸入剂组总蛋白含量及中性粒细胞占白细胞的比例均有显著变化;与空白干粉吸入剂组相比,干扰素α-2b干粉吸入剂组在4h时中性粒细胞占白细胞的比例有显著变化;大鼠的肺组织均呈均匀的海绵状,未出现水肿现象,肺泡中亦未发现巨噬细胞,但24h时空白干粉吸入剂组及干扰素α-2b干粉吸入剂组的组织切片中出现少量的中性粒细胞浸润。结论本文制备的干扰素α-2b干粉吸入剂可能会引起轻微的炎症反应。     

IFN-α2a - GFE-1融合基因的构建及表达

 目的构建IFN-α 2a-GFE-1融合基因载体,检测其在转染细胞的表达,为肺癌基因导向药物治疗积累实验资料.方法应用聚合酶链式反应技术(PCR)对干扰素(IFN)-α 2a羧基端的酶切位点进行改造,并人工合成肺特异性结合多肽CGFECVRQCPERC(GFE-1)的寡核苷酸片段,二者连接后克隆入pGEM-3zf质粒,连接产物转化感受态DH5α细胞,挑选阳性克隆经EcoRⅠ+PstⅠ酶切鉴定后测序,将测序正确的目的基因从测序载体相应酶切位点消化回收并纯化后,与上述酶处理过的PBV220质粒连接,连接产物常规转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经筛选后随机挑选阳性菌落,提取质粒酶切鉴定.结果序列分析表明合成片段成功的插入IFN-α 2a羧基端,大小、位置、方向均正确无误;融合基因克隆入PBV 220表达载体在大肠杆菌中获得有效表达.结论IFN-α 2a-GFE-1融合基因载体的构建及表达,为检测其在肺内特异性分布及抑瘤活性研究提供了实验基础.     

人近端肾小管上皮细胞诱导表达吲哚胺2,3-加双氧酶的实验研究

目的 了解培养的人近端肾小管上皮HK2细胞株吲哚胺2,3-加双氧酶(IDO)的诱导表达情况及其影响因素.方法 实验分为不同浓度(0、500、1 000、2 000U/ml)γ-干扰素(IFN-γ)刺激培养组和IFN-γ2 000U/ml刺激12、24、48、72h不同时点培养组,以10%胎牛血清DMEM培养基作为正常对照组.RT-PCR检测不同培养条件下HK2细胞IDO mRNA的表达,免疫细胞化学染色检测24h后HK2细胞IDO的表达,高效液相色谱法检测培养基中犬尿氨酸、色氨酸浓度.结果 正常HK2细胞不表达IDO mRNA和IDO蛋白.不同浓度IFN-γ刺激后,HK2细胞IDO mRNA 的表达呈剂量依赖性升高,与正常对照组相比差异显著(P＜0.05),同时IDO mRNA表达还呈时间依赖性地增高,以48h为最佳刺激时间.免疫组化染色显示,经IFN-γ刺激24h后,HK2细胞IDO蛋白表达增强,高效液相色谱检测显示刺激组培养基上清中犬尿氨酸特异性代谢率升高,表明表达的IDO具有生物活性,并且其活性呈IFN-γ剂量依赖性地升高.结论 IFN-γ刺激培养的HK2细胞IDO表达升高并具有活性,推测病理状态下人肾小管上皮细胞诱导表达的IDO有可能参与了肾小管-间质的病理损害过程.     

重组人α-半乳糖苷酶A在巴氏毕赤酵母中的表达及鉴定

目的：克隆人α-半乳糖苷酶A（α-GalA）cDNA，并在毕赤酵母中表达重组的人α-GalA。方法：利用RT-PCR方法从人肝癌细胞中克隆人α-半乳糖苷酶AcDNA并构建到可用甲醇诱导的分泌型巴氏毕赤酵母表达载体pPICZαA中。将重组质粒导入毕赤酵母并用Zeion抗生素筛选转化细胞。在甲醇诱导后。利用SDS-PAGE、Western印迹及酶活测定方法在酵母上清中鉴定重组的人α-GalA。结果：获得人α-GalA cDNA，构建酵母表达质粒pHGCZα-A，将重组表达载体导入到酵母细胞，并在上清中检测到人α-GalA蛋白。结论：获得了人α-GalA cDNA及具有生物活性的重组人α-GalA，为临床应用于法布莱氏病的治疗奠定了基础。     

干扰素治疗成人慢性乙型肝炎的疗效分析

目的观察重组基因干扰素α-2b治疗慢性乙型肝炎的临床疗效、影响因素及不良反应。方法选择解放军302医院门诊及住院患者74例,随机分成干扰素治疗组36例,保肝治疗组38例。干扰素治疗组给予重组基因干扰素α-2b,500万U每日肌肉注射1次（15d）,以后改为隔日1次肌肉注射（6个月）,保肝治疗组用常规保肝药物治疗。通过对肝功能、乙型肝炎病毒血清标志物和乙型肝炎病毒-脱氧核糖核酸的检测,观察两组的疗效及不良反应等。结果干扰素治疗组在治疗期间血清丙氨酸氨基转移酶复常率在1,3,6个月时与对照组比较无显著性差异。HBeAg阴转率、HBeAg血清转换率、乙型肝炎病毒-脱氧核糖核酸阴转率均较保肝治疗组高,差异均有显著性差异;干扰素治疗组治疗前抗乙型肝炎病毒-脱氧核糖核酸≤106、5ULN≤血清丙氨酸氨基转移酶〈10ULN的患者对干扰素应答好,抗乙型肝炎病毒-脱氧核糖核酸阴转率达70%,明显高于其他患者的30.8%。干扰素α-2b的不良反应主要有发热31例（占86.1%）、流感样症状22例（61.1%）、白细胞减少32例（占88.9%）等。不良反应一般经对症处理后能很快恢复正常。结论重组基因干扰素α-2b是目前治疗慢性乙型肝炎安全有效的药物,治疗前乙型肝炎病毒-脱氧核糖核酸载量、血清丙氨酸氨基转移酶水平与干扰素的治疗效果有关。     

钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL32的重组表达及纯化

目的：构建L32-pQE32重组质粒，诱导表达重组钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL32，对重组蛋白进行纯化。方法：采用PCR法从钩端螺旋体DNA中获取编码LipL32的基因片段，构建重组克隆载体pGEM-T／L32和表达载体L32-pQE32，转化受体茵E.coli DH5α和E．coli M15，IPTG诱导表达重组LipL32蛋白。Ni-NTA亲和层析纯化重组LipL32蛋白。结果：扩增出约750bp的LipL32成熟蛋白基因，LipL32基因插入pQE32表达载体，表达产物6个组氨酸与LipL32蛋白的融合蛋白相对分子质量约为31000，与预期大小一致。Western印迹显示能与钩体抗血清特异结合。结论：LipL32蛋白能在大肠杆菌中表达，Ni-NTA亲和层析可有效纯化重组LipL32蛋白，重组LipL32蛋白具有结合活性。     

sTNFR1在昆虫细胞中的表达及鉴定

目的 :研究可溶性肿瘤坏死因子受体 (solubleTNFαreceptor1,sTNFR1)在昆虫细胞中的表达。方法 :应用BAC_TO_BAC杆状病毒表达系统 ,构建含有sTNFR1基因的杆状病毒穿梭载体Bacmid ,转染sf2 1昆虫细胞进行高效表达 ,利用TALON金属鏊合层析进行重组蛋白的纯化。免疫印迹和细胞测活方法鉴定重组sTNFR1的生物学活性。结果 :从无血清培养上清中可纯化得到约 3mg L的重组蛋白。免疫印迹反应和细胞活性实验表明 ,重组蛋白具有良好的抗原结合能力和抑制TNF对L92 9细胞的细胞毒作用。结论 :重组sTNFR1在昆虫细胞中表达稳定 ,易于纯化 ,并具有良好的生物学活性     

干扰素-α转染HepG2细胞内下调表达基因的筛选

目的 筛选干扰素-α真核表达质粒转染HepG2细胞后细胞内表达下调的基因,以进一步探讨干扰素-α作用的分子生物学机制.方法 将pcDNA3.1(-)-IFN-α以及pcDNA3.1(-)空载体分别转染肝母细胞瘤HepG2细胞系,用抑制性消减杂交技术筛选pcDNA3.1(-)-IFN-α转染HepG2细胞内表达下调的基因.以pcDNA3.1(-)转染组细胞作为tester,pcDNA3.1(-)-IFN-α转染组作为driver,建立消减文库,随机挑选阳性克隆,测序并进行序列比对,得到下调表达的基因.应用RT-PCR技术,进一步证明IFN-α对Hsp90的下调表达作用关系.结果 成功构建了IFN-α真核表达质粒转染HepG2细胞后表达下调的cDNA消减文库.从文库中随机挑选克隆,测序并进行生物信息学分析后,得到下调表达的基因有:铁蛋白,热休克蛋白90,S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶1,真核翻译延伸因子1β,信号序列受体β(SSR2),组织因子路径抑制子,RAD23同源物B.RT-PCR进一步表明,IFN-α真核表达质粒转染的HepG2细胞内Hsp90 mRNA表达水平下调.结论 应用SSH技术成功构建了pcDNA3.1(-)-IFN-α转染的HepG2细胞内表达下调的cDNA消减文库,并筛选出下调表达基因,半定量RT-PCR表明IFN-α对Hsp90 mRNA具有下调表达作用.为进一步阐明IFN-α作用的分子生物学机制提供了重要的理论依据.     

EV71抑制I型干扰素信号通路中ISGF3的核转位

目的探讨肠道病毒71型（enterovirus71,EV71）感染对I型干扰素信号通路中核转位复合物干扰素刺激基因因子3（ISGF3）核转位的影响。方法Western印迹检测VRl432感染VeroE6对干扰素诱导的sTATl和STAT2磷酸化的影响。将pEGFP-C1-STATl重组质粒转染VeroE6细胞,随后进行EV71感染以及IFN-ot2b刺激,将细胞进行亚细胞分离检测ISGF3的核转位情况。结果VRl432以感染复数（MOI）为1感染VeroE6细胞后未影响干扰素刺激的STATl和STAT2的磷酸化;亚细胞分离后Western印迹检测磷酸化的STATl,结果显示VRl432感染后,p-STATl在细胞核内表达水平明显降低,说明Ev71感染抑制了p-STATl的核转位。结论EV71感染抑制I型干扰素信号通路中ISGF3（STATl／STAT2／IRF9）的核转位,从而影响干扰素效应途径中抗病毒蛋白的表达。     

人源性抗食管癌细胞单链抗体的表达纯化及活性鉴定

目的研究噬菌体抗体库中筛选得到的抗食管癌细胞的单链抗体的功能,对单链抗体进行包涵体表达纯化。方法将从噬菌体抗体库中筛选到的2个单链抗体基因分别连接到pET-28a、pET-SUMO原核表达载体中,分别构建原核表达重组载体pET-NFC20b、pET-NFC70a,将其转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)表达系统中进行融合表达,对诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG）浓度、诱导时间和温度等诱导表达条件进行优化。采用盐酸胍稀释滴定复性方法对抗食管癌肿瘤细胞表面抗原的抗体进行复性,并用SDS-PAGE及质谱技术鉴定表达产物。结果成功构建了重组载体pET-NFC20b、pET-NFC70a,对重组菌株pET-NFC20b、pET NFC70a蛋白表达进行鉴定,诱导条件为0.5 mmol/L IPTG、时间3 h、温度18 ℃,重组蛋白均以包涵体形式表达,经滴定复性后均获得了相对分子量为30 kD和40 kD的重组蛋白。细胞ELISA实验鉴定2种蛋白NFC20b、NFC70a能与KYSE-170、KYSE-150、SMMC7721、A549等细胞结合,具有生物学活性。结论噬菌体抗体库中筛选得到的抗食管癌细胞的单链抗体NFC20b和NFC70a,可以成功地构建到pET28a和pET-SUMO载体内进行包涵体表达,纯化后具有蛋白活性,可为后续实验及检测试剂的研发奠定基础。     

肿瘤抑制基因XAF1启动子序列中活性IRF-1作用元件的鉴定

目的在XAF1的转录起始序列中鉴定一具有高度活性的IRF-1作用元件。方法通过生物信息学分析发现XAF1转录起始处(-30~-38nt)有一潜在的干扰素(IFN)调节因子1结合元件(IRF-E),与同义IRF-E序列同源性达76.2%,命名为IRFE-XAF1。应用凝胶电泳迁移实验(EMSA)检测IRFE-XAF1的核蛋白结合活性,并分别定点突变其核心序列内-34nt和序列旁-28nt,检测突变后XAF1启动子活性变化及对IFN-α作用的影响。结果EMSA实验发现32P标记的含IRFE-XAF1的双链寡核苷酸DNA探针可与细胞核蛋白结合,且可被IRF-E同义探针阻断,定点突变后结合活性丧失,证实该IRFE-XAF1位点具有与转录因子结合的活性。含该IRFE-XAF1位点的XAF1启动子序列具有启动子活性且可被IFN-α诱导,IRFE-XAF1序列定点突变后启动子活性明显降低,其中-34nt突变后完全消除了IFN-α上调启动子活性的作用。结论XAF1的转录起始序列具有一高度活性的IRF-E,其序列为-38ntGAAACGAAA-30nt,这一发现提示XAF1是IFN-α诱导肿瘤细胞分化的作用基因。     

重组人α-半乳糖苷酶A在CHO细胞中的表达及鉴定

目的 构建重组人α-半乳糖苷酶A(GLA)真核表达载体,并在中华仓鼠卵巢细胞CHO中表达重组的人GLA.方法 利用RT-PCR方法从人肝癌细胞中克隆人GLA cDNA,并构建到哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1/myc-His A中.将重组质粒转染CHO细胞并用G418筛选.用丁酸钠诱导G418抗性细胞,检测培养上清中的GLA活性,筛选高表达GLA的细胞株.采用HisTrapTM FF纯化培养上清中的GLA蛋白并利用Western 印迹进行鉴定.结果 成功构建了哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1/myc-His A-GLA,并在中华仓鼠卵巢细胞CHO中表达,得到高表达量的单克隆(蛋白比活为1935 U/mg).纯化后的培养上清在50×103(Mr)附近出现单一条带,通过Western 印迹确定为GLA蛋白.结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3.1/myc-His A-GLA,获得了具有生物活性的重组人GLA,为临床上治疗法布莱病奠定了一定基础.     

人源抗-HBsAg dsFv-IFN融合基因的构建及在CHO细胞中的表达

目的 :探讨用抗体工程技术研制乙型肝炎导向干扰素。方法 :在已有的抗HBsAg_dsFv的基础上 ,用重叠延伸PCR的方法将抗_HBsAg_dsFvVL 基因和α_干扰素基因连接 ,形成融合基因。为避免IFN与dsFv空间折叠的影响 ,其间引入 15个氨基酸的柔性短肽 ;分别构建重链VH 基因、轻链VL_IFN融合基因的CHO表达载体 ,共转染CHO细胞。结果 :从细胞培养上清中检测到有抗病毒活性的IFN存在 ,有抗_HBsAg活性 ,但dsFv与抗原的结合活性较低。结论 :本研究为研制乙肝导向干扰素奠定了基础。     

抗HBs Fab-IFNα融合蛋白的制备与初步鉴定

目的构建抗HBsAg的pComb Fab-IFNα载体,原核表达具双重生物活性的抗HBs Fab-IFNα融合蛋白。方法以pBAD-Fab和pBADIFNα作为模板,分别扩增Fd、λ和IFNα基因,经相应的限制性内切酶酶切后分3次克隆入pComBHss质粒,转化XL-1 Blue大肠埃希菌。限制性酶切和测序鉴定重组质粒,免疫蛋白印迹(Western blotting)和斑点印迹(Dot blotting)鉴定融合蛋白的表达及抗原结合活性。结果重组载体的酶切、电泳及测序表明抗HBs Fab-IFNα基因克隆正确。表达产物经12%SDS-PAGE电泳、转印,Western blotting显示该融合蛋白分子量约为65kD,Dot blotting显示其与HBsAg具有结合能力。细胞病变抑制法测定IFNα生物学活性为7.8×104~5.1×105U/ml。结论该原核系统成功表达了抗HBs Fab-IFNα融合蛋白,表明其既具有抗HBsAg结合能力,又具备IFNα的生物活性,为进一步的系统表达和应用研究提供了条件。     

人脐带间充质干细胞来源的外泌体免疫调节功能异质性研究

目的 研究不同供者来源的人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)分泌的外泌体免疫调节能力的异质性.方法 培养5株不同供者来源的hUC-MSC,收集无血清培养上清提取外泌体,流式细胞术检测其表面特异性标志CD9、CD63、CD81、CD44的表达,BCA法测定总蛋白含量.将外泌体和脐带血单个核细胞(UBMC)共培养72 h,MTT实验检测细胞增殖活性, ELISA测定共培养上清中干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量.离心重悬UBMC和K562细胞按5∶1的比例共培养4 h,MTT实验检测细胞活性,计算UBMC的杀伤能力.结果 提取的外泌体表达CD9,CD63,CD81及CD44.不同供者来源hUC-MSC分泌的外泌体对UBMC的增殖、分泌细胞因子及K562细胞杀伤能力的作用不同.结论 不同供者hUC-MSC的外泌体免疫调节能力具有异质性.