小鼠新基因 msid2的克隆、亚细胞定位及表达特征

目的：研究小鼠系统性RNAi相关基因msid2的克隆、亚细胞定位及表达特征。方法：通过生物信息学方法寻找小鼠中与线虫的sid-1基因同源的基因，用RT-PCR方法从小鼠大脑中分离到其全长cDNA；将其亚克隆到绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1，用脂质体介导转入CHO细胞，确定其亚细胞定位。结果与结论：基因msid2的cDNA全长1353bp，编码450个氨基酸，定位于小鼠16号染色体，其基因组全长16kb，包括14个外显子和13个内含子。亚细胞定位试验结果初步表明，该蛋白定位于内质网及质膜。RT-PCR结果显示msid2在小鼠大脑、小脑中高表达，而在其他组织表达水平较低。     

人类新基因flj20174的克隆、亚细胞定位、表达谱及功能初探

目的：研究人类系统性RNAi相关基因flj20174的克隆表达、亚细胞定位和表达谱，以及功能的初步探索。方法：利用生物信息学方法分析、预测flj20174基因的表达谱和功能；采用RT-PCR技术，从健康人外周血单个核细胞cDNA中，扩增获得flj20174可能的全长编码区，并将其亚克隆于pEGFP-N1载体；利用Northern杂交鉴定其转录本；利用半定量PCR确定flj20174在免疫组织和免疫细胞中的表达谱；通过脂质体转染入HeLa细胞，观察融合蛋白的亚细胞定位和过表达对细胞状态的影响。结果与结论：获得了2484bp的全长编码区。测序后发现与NCBI公布的Ak00018的序列完全一致；Northern杂交证实其转录本约为4669bp；证实该基因属于低丰度基因，在免疫细胞中有相对较高的表达，并在B细胞和T细胞激活后表达量下降；与EGFP融合表达后可见该蛋白主要分布于内膜系统，而且过表达该融合蛋白可以引起细胞的死亡，推测此过程可能与机体的免疫防御相关。     

人分化相关基因Ndr3的克隆、组织表达谱及亚细胞定位研究

目的 :研究人源分化相关新基因Ndr3的克隆、组织表达谱及亚细胞定位。方法 :采用电子拼接和PCR扩增技术 ,从人 2 2周孕龄胎肝cDNA文库中获得与人Ndr1基因同源的一段表达性序列标签 ,继而从成人脑cDNA文库分离出Ndr3的全长cDNA ;采用点杂交分析和多组织Northern杂交分析方法 ,确定其组织表达谱 ;将其亚克隆入绿色荧光蛋白表达载体pEGFP_N1,用脂质体介导法转染COS_7细胞 ,确定其亚细胞定位。结果与结论 :Ndr3的全长cDNA为 2 879bp ,其开放阅读框 (ORF)编码 375个氨基酸 ,染色体定位为 2 0q12_11.2 3。Northern杂交和点杂交分析显示 ,NDR3在脑组织和睾丸中高表达 ,在肾、心肌和前列腺中有一定量的表达 ,在胚胎组织的表达较低 ,在 8种人肿瘤细胞中的表达极低。与绿色荧光蛋白融合表达的实验结果显示 ,该蛋白定位于核外胞浆内     

新基因TIG-310的原核表达、细胞和亚细胞定位及其在Ty21a免疫中的表达变化研究

目的：研究Ty21α免疫相关新基因(Ty21α immunization—associated gene，TIG—310)的原核表达、细胞和亚细胞定位及其在Ty21α免疫中的变化规律。方法：采用PCR技术，扩增TIG—310可能的编码区，将其克隆至pQE30载体，在M15菌株中进行诱导表达；采用原位杂交技术对TIG—310基因的表达产物在肠黏膜组织进行细胞定位；将其亚克隆至绿色荧光蛋白表达载体pEGFP—N1，通过电击传染导入L细胞，确定其亚细胞定位；通过RT—PCR研究其在Ty21α免疫中的变化规律。结果与结论：TIG—310的编码区在原核表达系统中获得包涵体表达；原位杂交结果显示该基因表达在肠黎膜的上皮细胞中；与绿色荧光蛋白融合表达的实验结果表明，该蛋白定位于整个细胞内。该基因在正常的BALB／c小鼠的胃肠黏膜高表达，在Ty21α第一次灌胃免疫后表达量显著增高，随着免疫次数的增加，TIG—310的表达量逐渐恢复正常。     

小鼠脑损伤相关基因的克隆及表达与生物学功能初步分析

目的 克隆1个与小鼠脑损伤早期反应相关的新基因(GBI),并对其功能进行初步分析.方法 SMART-RACE技术克隆该新基因全长cDNA;采用生物信息学软件分析其可能的功能结构域和进行序列相似性分析;Northern Blotting分析该基因在小鼠主要组织器官的生理水平的表达.结果 该新基因全长cDNA序列为1798bp,含1个编码249个氨基酸残基蛋白质的开放性阅读框.推导蛋白质分子与1个即刻早期蛋白IE175和1个应激相关蛋白RAB21具有部分序列相似性.Northern杂交显示其仅仅在小鼠脑组织有基础水平的表达.结论 该基因可能与创伤早期反应的应激信号转导相关,并命名为脑损伤相关基因GBI(gene related to brain injury,gi|19338981|gb|AF481964.1).     

无POU域八聚体结合蛋白基因的克隆及其在Hepa1-6细胞内的表达

目的构建小鼠无POU域八聚体结合蛋白(non-POU-domain-containing,octamer binding protein,NonO)真核表达载体并在小鼠Hepa 1-6肝癌细胞内表达,观察NonO胞内表达、定位及脂多糖(LPS)对其定位的影响。方法提取小鼠肝组织总RNA,RT-PCR扩增小鼠NonO基因的蛋白编码序列。采用基因重组技术将其亚克隆至pcDNA3-HA真核表达载体中,将该载体瞬时转染Hepa1-6细胞,通过细胞免疫荧光方法观察NonO的胞内表达及LPS对其定位的影响。结果酶切和DNA测序证明所构建质粒正确;细胞免疫荧光可见NonO在Hepa 1-6细胞内表达、分布于细胞核,LPS刺激后NonO分布无明显变化。结论成功构建NonO真核表达载体,为研究NonO在基因表达调控中作用及其生物功能提供了重要载体。进一步证实NonO为定位于细胞核的核蛋白。     

小鼠脑损伤相关基因的克隆及表达与生物学功能初步分析

目的克隆1个与小鼠脑损伤早期反应相关的新基因（GBI），并对其功能进行初步分析。方法SMART—RACE技术克隆该新基因全长eDNA；采用生物信息学软件分析其可能的功能结构域和进行序列相似性分析；Northern Blotting分析该基因在小鼠主要组织器官的生理水平的表达。结果该新基因全长eDNA序列为1798bp，含1个编码249个氨基酸残基蛋白质的开放性阅读框。推导蛋白质分子与1个即刻早期蛋白IE175和1个应激相关蛋白RAB21具有部分序列相似性。Northern杂交显示其仅仅在小鼠脑组织有基础水平的表达。结论该基因可能与创伤早期反应的应激信号转导相关，并命名为脑损伤相关基因GBI（gene related to brain injury，gi1193389811 gb IAF481964．1）。     

牛胚胎发育早期MnSOD,Glut-1,Hsp70,IGF-II,IFN-t基因表达差异的研究

目的:研究体外受精生产的牛胚胎在发育早期各个阶段MnSOD,Glut-1,Hsp70,IGF-II,IFN-t基因的表达差异,阐明体外培养胚胎发育阻滞和胎儿发育异常的分子机理和胚胎阻滞有关的目的基因,为完善体外培养系统、提高IVP胚胎质童和确保IVP后代正常发育提供理论依据.方法:提取体外生产的不同阶段牛胚胎总RNA,以β-actin基因为内对照,用半定童RT-PCR技术检测胚胎发育各时期MnSOD,Glut-1,Hsp70,IGF-Ⅱ,IFN-t基因在mRNA水平的表达情况.结果:在卵母细胞中,MnSOD及IFN-t基因呈高表达,Glut-1,Hsp70及IGF-II呈低表达;在8-16细胞、桑葚胚及囊胚中,MnSOD及IGF-II基因呈高表达,而Glut-1,Hsp70及IFN-t基因则呈低表达.     

一个新的Ⅰ型咪唑啉受体可变剪接体的克隆、鉴定及亚细胞分布

目的克隆Ⅰ型咪唑啉受体（I1R,Nischarin）新的可变剪接体,并对其进行表达特征和亚细胞定位研究,探索其表达与I1R的差异,从而为解释I1R药理学作用多样性奠定基础。方法在本课题组前期研究基础上设计引物,通过RT-PCR从大鼠肝组织中克隆新的可变剪接体,将其克隆到pcDNA3.1、pEGFP-N1和PCMV-myc3个真核表达载体中,并通过细胞转染探索其在293T细胞中的分布,应用Western印迹测定其在真核细胞中表达蛋白的相对分子质量特征。结果成功克隆获得一个新的I1R可变剪接体（命名为I1R-ISO-472）,编码472个氨基酸,与GenBank中序列号AK036043.1的新基因的序列完全一致。生物信息学分析表明,该基因染色体定位于14号染色体14B,含有磷酯酰肌醇结合位点（PX_domainsuperfamily）与亮氨酸富集重复（LRR-RIsuperfamily）两个重要的功能结构域。I1R-ISO-472在293T细胞中表达的蛋白相对分子质量约为52×103,与预测基本一致。细胞免疫荧光结果表明,其在293T细胞内呈均匀弥散分布。结论成功克隆一个新的I1R可变剪接体,其表达特征及亚细胞分布提示其药理学作用可能与已知的I1R不同。     

PRDX3真核表达载体构建及亚细胞定位

目的：构建带FLAG标签的过氧化物还原酶3（peroxiredoxin3,PRDX3, PRX3）的真核表达载体,并对其在人舌癌SCC15细胞中的定位进行检测。方法以乳腺文库为模板,PCR扩增带有FLAG标签的PRDX3基因片段,并将扩增产物插入到PCDH空载体中,构建成PCDH－FLAG－PRDX3,质粒测序正确后瞬时转染入人胚肾293T细胞, Western免疫印迹检测克隆载体的表达情况,细胞免疫荧光实验检测PRDX3的亚细胞定位。结果双酶切和测序结果表明,PCDH－FLAG－PRDX3真核表达载体构建成功,转染293T细胞后成功表达了FLAG－PRDX3融合蛋白;细胞免疫荧光显示FLAG－PRDX3蛋白定位于舌癌SCC15细胞的细胞质中,不存在于细胞核内。结论成功构建了带FLAG标签的PRDX3真核表达载体,并检测其定位于舌癌SCC15细胞质中,为进一步明确PRDX3在舌癌发生发展中的功能及分子机制奠定基础。     

Smad5基因在小鼠耳蜗中的表达及定位

目的 了解Smad5基因在小鼠耳蜗中的表达及定位。方法 应用RT-PCR检测Smad5基因的表达,用原位杂交法检测耳蜗中Smad5 mRNA的表达部位,用免疫组织化学方法确定Smad5蛋白在耳蜗中的定位。结果 Smad5基因在小鼠耳蜗中有高表达,表达部位在毛细胞、螺旋神经节细胞、支持细胞、血管纹、基底膜等。结论 Smad5在耳蜗中存在,是耳蜗中众多蛋白中的一种。它可能在耳蜗的形成、毛细胞的分化过程中起着重要的作用。     

小鼠胚胎成纤维细胞差异表达基因的筛选

应用微阵列杂交法对培养前，后的小鼠胚胎成纤维细胞（MFF）mRNA进行检测，找到24类差异表达的基因，为进一步筛选MEF可能表达的新基因，对培养前（driver)，后（tester)的MEF mRNA进行抑制性消减杂交，产物与pGEM-T载体连接构建cDNA削减文库并转染JM109大肠杆菌。随机挑取阳性克隆，PCR扩增后对所得的差异表达基因进行测序及生物信息学分析。在随机挑取的145个克隆中，测得了128条EST序列，经生物信息学分析，它们代表了42类不同基因和3条新基因序列。结果表明，培养后MEF相对于培养前胚胎成纤维细胞确实存在差异表达基因群。提示，进一步的实验研究可能找出对ES细胞增殖分化有重要调控作用的基因或基因群。     

膀胱输尿管反流基因Robo2在小鼠肾脏发育过程中的表达

目的 观察Robo2在小鼠肾脏发育过程中的表达情况,探讨其在肾脏发育中的作用.方法 应用实时定量RT-PCR技术对胚龄12.5、13.5、14.5、15.5、16.5、17.5、18.5d和生后日龄1d、1周、5周共10组小鼠肾脏组织中的Robo2 mRNA表达水平进行半定量分析.应用免疫荧光技术检测胚龄12.5、13.5、14.5、15.5、16.5、17.5d和成年小鼠肾脏Robo2蛋白表达部位.结果 实时定量RT-P CR结果显示,Robo2蛋白表达水平在胚龄12.5、 13.5、 14.5d时最高,随后明显下降,在出生后维持低水平表达.免疫荧光染色结果显示,Robo2最初在胚肾的后肾间充质表达,而不在输尿管芽表达,随着胚龄增加及肾脏发育,Robo2表达于后肾间充质细胞膜、围绕输尿管芽的浓缩帽状间充质、逗号形体和S形体以及肾小囊体,最终表达于肾小球足细胞.另外,部分早期肾小管上皮细胞也有微弱Robo2表达.在Robo2基因缺失后,肾单位发育异常,部分肾小管、集合管扩张.结论 Robo2通过调控后肾间充质与输尿管芽相互作用在小鼠肾脏发育过程中对肾单位发育起重要作用.     

丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin-a的克隆表达及其cDNA序列分析

目的：从丝瓜籽中克隆核糖体失活蛋白luffin-a基因，并在原核系统进行表达。方法：根据已报道的cDNA序列设计引物，用RT-PCR的方法从成熟的丝瓜籽中克隆luffin-a基因，克隆后鉴定核苷酸序列。构建表达载体pET-28a（＋）-luffin-a，转化大肠杆菌BL21（DE3），并经IPTG诱导表达。利用金属离子亲和层析的方法纯化所得目的蛋白。结果：克隆的luffin-a基因及其所编码的氨基酸序列与国外报道的核苷酸序列及氨基酸序列同源性分别为95％和92％，因而所获得的luffin-a基因是丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin-a一个新的cDNA序列。经SDS-PAGE分析：luffin—a主要存在于包涵体中。金属离子亲和层析可纯化目的蛋白。结论：本研究成功地克隆了luffin-a一个新的序列，并建立了该蛋白的原核表达系统，同时利用亲和层析可一步法纯化获得目的蛋白。     

小鼠4-1BBL基因真核表达载体构建及其在COS-7细胞中的表达

目的：构建含小鼠4-1BBL编码区cDNA序列的真核表达载体，并检测其在COS-7细胞中的表达。方法：将目的基因4-1BBL克隆人pUCl9载体中并进行酶切鉴定和DNA序列测定。亚克隆入真核质粒pIRES2-EGFP，构建真核表达载体pIRES2-EGFP-m4-1BBL。用脂质体法将重组质粒转入COS-7细胞，以RT-PER和观察细胞内荧光的方法检测m4-1BBL的表达。结果：酶切鉴定和序列分析证实，重组质粒含有人4-lBBL全长cDNA编码序列，转染实验表明4-lBBL基因能在COS-7细胞中表达。结论：鼠4-1BBL全长cDNA基因真核表达载体构建及其在COS-7中的表达均获成功，为进一步研究奠定了基础。     

模拟微重力条件下昆明小鼠早期胚胎体外发育及其G6PD基因表达

目的 研究模拟微重力条件下培养的小鼠早期胚胎体外发育与1g重力条件下体外发育的差异。方法 检测葡萄糖代谢关键酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PD）在昆明小鼠早期胚胎体外不同重力条件下培养各个时期基因的转录与表达。结果 模拟微重力培养条件下,胚胎体外发育受到明显的抑制,模拟微重力不利于小鼠胚胎的体外发育。用CZB＋10％FCS进行培养,2-细胞期培养的囊胚率为零,显著低于常规培养的23．92％;4-细胞期培养的囊胚率为18．44％,显著低于常规培养的80．12％。利用G6PD的内、外两对引物,检测昆明小鼠早期胚胎体外发育各个阶段的G6PD基因的转录与表达。从2-细胞期开始体外常规培养的胚胎,发育至4-、8-细胞胚胎、桑椹胚、囊胚及退化囊胚都有G6PD基因的转录与表达。在模拟微重力条件下,从2-细胞期开始培养的胚胎,发育至4-细胞期、桑椹期、囊胚期胚胎和退化桑椹胚皆有G6PD基因的转录和表达,而退化的2-细胞胚胎没有检测到G6PD基因的转录与表达。结论 两种培养方式之间,G6PD基因的转录与表达不存在差异,说明早期胚胎都存在磷酸戊糖途径。