hPer1相互作用蛋白的筛选

目的 应用酵母双杂交系统筛选血液中与人体生物钟蛋白Per1相互作用的新蛋白.方法 以人Per1的basic HLH-PAS结构域为诱饵,在人血液cDNA文库中筛选与之相互作用的新蛋白.阳性克隆送测序后用生物信息学分析.结果 酵母双杂交文库营养缺陷筛选得到114个阳性克隆,β-半乳糖苷酶检测报告基因获得46个蓝色克隆.通过测序和生物信息学分析,其中之一能与Per1相互作用的蛋白为LSMD1.结论 通过酵母双杂交系统证明Per1能够与LSMD1发生相互作用.     

胞红蛋白(CGB)与金属硫蛋白(MT2)相互作用的研究

目的:胞红蛋白(CGB)是新近发现的在脊椎动物多种组织中广泛表达的携氧珠蛋白,在肝纤维化过程及缺氧/缺血条件下表达增高,可提高细胞抗氧化损伤能力,但其在细胞保护中的作用机制仍不清楚.由于蛋白质功能的发挥在很大程度上是通过蛋白质-蛋白质相互作用实现的,本研究拟通过研究与功能已知蛋白之间的相互作用,阐明CGB发挥保护作用的分子机制.方法:采用酵母双杂交技术筛选人胎脑cDNA文库,获得与CGB相互作用的阳性克隆并测序、BLAST比对鉴定获得的cDNA序列;随后采用酵母回转实验、免疫荧光共定位及免疫共沉淀实验对蛋白之间的相互作用进行验证.结果:筛选获得的阳性克隆cDNA序列与人金属硫蛋白Ⅱ(MT2)存在100%序列相似性,并且MT2与CGB在酵母和COS7细胞中均存在相互作用.结论:由于MT2为生物体内广泛存在的抗氧化和清除自由基的应激相关蛋白, CGB可能与MT2一起协同调节细胞氧化还原反应能力,进而从抗氧化损伤的角度发挥细胞保护作用.     

应用酵母双杂交技术筛选与乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白2结合的肝细胞蛋白编码基因

目的构建乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白2(HBEBP2)的真核表达载体并筛选人肝细胞中与HBEBP2相互作用的基因。方法通过PCR扩增获得HBEBP2基因,构建真核表达载体pGBKT7-HBEBP2,转化酵母菌AH109并在其中进行表达。随后与预转化了人肝细胞文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)和铺有X-α-gal的营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)上进行双重筛选获得阳性克隆。提取文库质粒pACT2-DNA并与pGBKT7-HBEBP2共同转化AH109酵母菌株,于铺有X-α-gal的营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)上进行筛选以排除假阳性克隆。挑取真阳性克隆送测序,并进行生物信息学分析。结果筛选出6种与HBEBP2相互作用的蛋白,其中包括人类线粒体蛋白、人类α-2-糖蛋白1、人类磷酸甘露糖-p-长醇利用缺陷1和人类丝氨酸蛋白酶抑制剂等4个已知功能蛋白及2个未知功能序列。结论筛出人肝细胞中一组与HBEBP2相互作用的蛋白,为进一步探讨HBEBP2在HBV致病过程中的作用奠定了基础。     

应用酵母双杂交筛选与hSOX4相互作用的蛋白质

目的：寻找与hSOX4相互作用的蛋白质，为该基因的功能研究提供新的线索。方法：采用酵母双杂交方法，以hSOX4的第1～133位氨基酸SOX4（1-133）和第130-380位氨基酸SOX4（130-380）分别作为诱饵筛选人乳腺文库，经过重复验证排除假阳性以确定阳性克隆。结果：以SOX4（1-133）作为诱饵最终筛出了4个阳性克隆，经测序及生物信息学分析，这4个克隆为同一基因来源：UBE2I（ubiquitin-conjugating enzyme E2I，Ubc9）。以SOx4（130-380）为诱饵未能筛出阳性克隆。结论：Ubc9能与SOX4（1-133）发生相互作用，它们的相互作用可能与SOX4的转录调控有关。     

运用酵母双杂交系统筛选与埃博拉病毒GP、VP30、NP、L蛋白存在相互作用的宿主蛋白

目的 运用酵母双杂交技术从人肝cDNA文库中筛选出与埃博拉病毒(EBOV)GP、VP30、NP、L蛋白存在相互作用的宿主蛋白,用于研究GP、VP30、NP、L蛋白在EBOV传染病中的生物学功能.方法 利用重组PCR技术构建诱饵质粒pGBKT7-GP、pGBKT7-VP30、pGBKT7-NP、pGBKT7-L,将诱饵菌株与人肝cDNA文库菌株进行杂交筛选,对筛选到的阳性克隆进行DNA测序和生物信息学分析,然后再利用酵母回复性实验进一步验证,排除假阳性结果.结果 成功构建了诱饵质粒pGBKT7-GP、pGBKT7-VP30、pGBKT7-NP、pGBKT7-L,筛选出6个可能与GP、VP30、NP、L蛋白有相互作用的宿主蛋白,分别是COMMD1、ALB、PSMD8、APOA2、CYP2E1、HP.酵母回复性实验进一步说明了COMMD1和APOA2与NP蛋白可能存在相互作用.结论 酵母双杂交筛选出多个可能与EBOV的GP、VP30、NP、L蛋白存在相互作用的捕获蛋白,为研究EBOV的致病机制提供了参考.     

运用双杂交系统探寻与内皮素A型受体相互作用的蛋白质

目的：运用酵母双杂交系统寻找与内皮素Ａ型受体（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎｔｙｐｅＡｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＥＴａＲ）相互作用的蛋白质，为探讨心血管等疾病的致病机理及采取相应的治疗策略提供理论依据，方法：首先将ＥＴＶＲ胞内区ｃＤＮＡ片段克隆入ｐＧＢＴ９质粒载体中，得到的重组质粒ｐＧＢＴ９－ＥＴｖＲ转化酵母菌ＨＦ７Ｃ，然后将鼠胚胎文加质粒转化到ＨＦ７Ｃ（ｐＧＢＴ９－ＥＴｖＲ）中，用Ｔｒｐ＾－Ｌｅｕ＾－Ｈｉｓ＾－营     

FHL2与IGFBP-7存在直接相互作用

目的：利用酵母双杂交技术筛选FHL2的相互作用蛋白，为进一步研究FHL2的功能奠定基础。方法：从卵巢文库中钓取FHL2 cDNA，构建诱饵蛋白栽体pAS2-1-FHL2，利用酵母双杂交筛选技术，在卵巢文库中筛选与FHL2相互作用的蛋白。将含有pACT2-候选基因的酵母菌与含有pAS2-1-FHL2的酵母菌进行交配实验，利用LacZ报告基因检测FHL2与候选蛋白之间是否存在相互作用。将FHL2和候选蛋白分别构建到pGEX-KG和pET-28a上，并纯化GST-FHL2和His-候选蛋白融合蛋白，利用GST沉淀实验进一步验证FHL2和候选蛋白的体外相互作用。结果：所获取的候选蛋白为IGFBP-7，是胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBPs）家族中的一员。交配实验表明，IGFBP-7与FHL2能特异性地相互作用，而不与空载体或BRCT1对照相互作用。GST沉淀实验进一步验证，IGFBP-7能与FHL2结合，而不与GST结合。结论：FHL2和IGFBP-7在体内及体外均可发生特异性的相互作用。     

人DOC-2氨基端PID结构域酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活鉴定

目的：获得人DOC-2氨基端磷酸酪氨酸作用结构域（PID）cDNA基因，构建酵母双杂交诱饵载体，并检测对报告基因的激活作用。方法：PCR扩增含人DOC-2编码区的全长cDNA片段，克隆入诱饵载体pGBKT7，再亚克隆得到含PID结构域的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-nDOC2。将重组质粒导入酵母菌AHl09，检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用。结果：成功构建人DOC-2氨基端磷酸酪氨酸作用结构域（PID）酵母双杂交诱饵载体，该段基因表达的蛋白对酵母菌AH109既无毒性，对报告基因也没有激活作用。结论：我们可利用构建的酵母双杂交诱饵载体来钓取人DOC-2氨基端PID结构域的相互作用蛋白，以利于对DOC-2基因功能进行研究。     

应用酵母双杂交研究G-CSF受体胞内区结合蛋白

目的：探寻与G-CSF受体胞内区相互作用的下游蛋白因子，揭示G-CSF受体信号转导通路的可能机制。方法：采用敏感性较高的酵母双杂交体系，筛选小鼠胎肝文库，并通过体内双杂交实验进行验证。结果：获得了11种阳性基因片段，对其中铁蛋白重链片段在体内验证了相互作用。结论：提示在小鼠胎肝中G-CSF受体作为胞内信号转导的起始点，与众多胞浆内蛋白因子相结合，对于揭示G-CSF受体信号转导可能存在的各种通路起到重要的提示作用。     

肝细胞内与HBeAg结合的新蛋白编码基因E-36的筛选与克隆

目的　探讨HBeAg在乙型肝炎病毒 (HBV)致病过程中所起的作用。方法　利用酵母双杂交系统 3筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与HBeAg有相互作用的蛋白的基因。将HBeAg编码基因克隆入酵母表达载体 pGBKT7中构建诱饵质粒 ,转化酵母细胞AH10 9并在其内表达 ,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合 ,双重筛选阳性菌落 ,提取质粒并测序。结果　通过行生物信息学分析 ,发现其中有 1个未知基因 ,命名为E 36。结论　根据GenBank中的序列信息设计引物 ,从HepG2细胞中扩增出E 36新基因的完整序列并克隆到另一酵母表达载体pGADT7中 ,并用体外免疫共沉淀方法再次验证了HBeAg与E 36新蛋白之间有结合作用 ,为HBeAg的功能研究提供了新线索。     

人端粒相关蛋白T-STAR的克隆及其与端粒酶催化亚单位hTERT的相互作用研究

目的克隆人端粒相关蛋白T-STAR并研究其与端粒酶催化亚单位hTERT在哺乳细胞内的相互作用。方法构建表达载体pGBKT7-hTERT,以pGBKT7-hTERT为诱饵,采用酵母双杂交技术进行cDNA文库筛选;构建pVP16-T-STAR和pMhTERT重组载体,脂质体法将其与报告质粒共转染入胃腺癌细胞株SGC-7901,以pM-53 pVP16-T、pM3-VP16为阳性对照,以pM53 pVP16-CP为阴性对照;以pM-hTERT pVP16、pM pVP16-T-STAR、pM pVP16为交叉阴性对照。ELISA法检测报告基因CAT的表达。结果成功构建真核表达载体pGBKT7-hTERT,将获得的阳性克隆测序,并进行同源性比较证实为是已收录的人cDNA序列T-STAR。pGBKT7-hTERT和pVP16-T-STAR共转染之后,报告基因CAT的表达(A值为0.258)显著高于阴性对照(A值为0.002~0.015)。结论T-STAR与hTERT在胃癌细胞内发生了相互作用,T-STAR可能是人端粒相关蛋白新成员,通过hTER参与端粒酶活性的调控。