Sp1在低氧肝癌细胞血管内皮生长因子转录调控中的作用

目的 探讨转录因子Sp1在低氧肝癌HepG2细胞血管内皮生长因子(VEGF)转录调控中的作用.方法 实时定量PCR和免疫印迹法检测低氧肝癌HepG2细胞中Sp1和VEGF的表达,并应用Sp1特异性抑制剂普卡霉素(光神霉素A,plicamycin,mithramycin A)及Sp1-小干扰RNA(siRNA)干预上述实验检测VEGF mRNA的表达变化.结果 低氧条件下肝癌HepG2细胞Sp1 mRNA、蛋白及VEGF mRNA的表达均呈时间依赖性明显增加,普卡霉素呈剂量依赖性抑制低氧诱导VEGF mRNA的表达.Sp1-siRNA转染HepG2细胞后,VEGF mRNA表达亦明显下降.结论 低氧条件下,HepG2细胞Sp1蛋白及VEGF mRNA表达均明显增加.Sp1信号通路参与低氧诱导VEGF的转录调控.     

RNA干涉抑制NIH3T3细胞中外源PC-1基因表达

目的：获得能有效抑制PC—1基因表达的RNAi靶标，用RNAi技术研究PC-1基因表达在前列腺癌中的作用。方法：用DNA重组技术构建了可表达短发夹RNA的重组质粒，将重组质粒与表达PC-1-EGFP融合蛋白的质粒共转染NIH3T3细胞，通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达差异，从5个候选靶标中初筛出最合适的RNAi靶标，再通过RT—PCR和Western印迹从mRNA水平和蛋白质水平检测该RNAi靶标抑制PC-1基因表达的效果。结果：利用RNA干涉有效靶点抑制了NIH3T3细胞中外源PC-I基因表达。结论：这一策略适合大量筛选：RNAi有效靶标序列，其结果为研究RNAi技术降低PC-1基因的表达对前列腺癌细胞的影响奠定了基础。     

Wnt信号通路在非小细胞肺癌组织中的活化

目的探讨Wnt-2、β-catenin和TCF-4在非小细胞肺癌组织中的表达特点及其与肺癌临床组织分型、分化程度以及与淋巴结转移的相关性。方法应用免疫组化SP方法检测45例非小细胞肺癌组织、10例癌旁正常组织中Wnt-2、β-catenin和TCF-4的表达情况;应用RT-PCR及Western blot技术分别检测这三个指标在mRNA和蛋白水平的表达情况。结果 (1)Wnt-2、β-catenin和TCF-4在非小细胞肺癌组织中表达阳性率分别为64.4%、75.6%和80%,β-catenin和TCF-4在低分化和中高分化间存在差异(P<0.05),β-catenin在淋巴结转移组间存在统计学差异(P<0.05);(2)定位于Wnt信号通路中的三个关键因子Wnt-2、β-catenin和TCF-4之间表达具有相关性。结论Wnt-2、β-catenin和TCF-4在非小细胞肺癌中异常高表达,提示其代表的Wnt信号通路活化。     

内质网应激对ATF6调控XBP1启动子转录的影响

目的 确定XBP1启动子的转录核心区域,探讨激活转录因子6(ATF6)在内质网应激(ERS)与非ERS状态下对XBP1启动子转录活性的调控作用.方法 采用基因重组技术构建ATF6基因及两个缺失体ATF6s1p、ATF6s2p的真核表达载体pcDNA3.1 (-)-ATF6、pcDNA3.1 (-)-s1p、pcDNA3.1(-)-s2p,以及XBP1启动子报告基因载体pGL3-XBP1.针对XBP1启动子的各个组成元件设计和构建XBP1一系列截短体的报告基因载体.采用双荧光素酶报告基因法检测并确定XBP1启动子的核心启动子区,Western blotting检测ATF6及缺失体s2p、s1p在ERS与非ERS状态下对XBP1核心启动子区转录的调控作用.结果 XBP1启动子的-407bp-+133bp区域是转录活性调控的核心区域,-2000bp--407bp区域不具有转录活性,该区域可能含有抑制转录活性的组成元件.非ERS状态时,ATF6及两个缺失体s2p、s1p可明显上调XBP1启动子的转录活性及XBP1蛋白表达;而在ERS状态时,ATF6及两个缺失体s2p、s1p下调了XBP1启动子的转录活性和XBPl蛋白表达.结论 ATF6对XBP1的转录调控作用在ERS状态和非ERS状态下存在差异.非ERS状态时,ATF6上调XBP1的转录和表达,而ERS状态时,ATF6下调XBP1的转录和表达.     

腺病毒介导的RNA干扰ERCC1基因表达对逆转卵巢癌顺铂耐药的效果

 目的 探讨腺病毒介导的RNA干扰ERCC1基因表达逆转卵巢癌顺铂耐药的效果。方法 采用直接感染法、台盼蓝活细胞计数、MTT、Hoechst染色法及流式细胞仪检测等方法,绘制顺铂耐药卵巢癌细胞株SKOV3/DDP细胞生长曲线及倍增时间,检测SKOV3/DDP细胞感染重组病毒前后其顺铂的IC₅₀值、细胞凋亡形态及细胞各周期的分布。结果 (1)顺铂浓度与SKOV3/DDP细胞抑制率呈线性正相关,相关系数r=0.9862(P<0.05),顺铂IC₅₀为(13.93±0.37)μg/ml,耐药指数为1.79。(2)重组腺病毒感染后干扰ERCC1基因表达,SKOV3/DDP细胞对顺铂的敏感性分别增加了11.1%、16.7%、26.4%、33.5%,呈剂量依懒性(r=0.9716,P<0.05),耐药指数降至1.19。(3)重组腺病毒联合顺铂作用后,SKOV3/DDP细胞株G₁期细胞比例增大,S期细胞比例增大,细胞凋亡率增高(P<0.05)。结论 干扰ERCC1基因表达可以通过诱导耐药肿瘤细胞SKOV3/DDP凋亡、调节细胞周期分布等途径逆转卵巢癌细胞的顺铂耐药。     

RNA干涉抑制肺癌细胞DNA甲基转移酶1(DNMT1)的表达

目的：通过抑制肺癌细胞DNA甲基转移酶1(DNMT1)的表达，从而部分恢复抑癌基因的表达。方法：采用RNAi技术来抑制DNMT1的活性。应用体外转录的方法，共合成了5个针对DNMT1不同靶位的siRNA序列，并转染人肺癌细胞NCI-H157。采用MSP-PCR、COBRA等方法对抑癌基因RASSF1A进行甲基化分析，半定量RT-PCR检测DNMT1 mRNA的敲降与RASSF1A基因的表达。结果与结论：5个靶位的siRNA序列中有两个靶位能够有效地抑制DNMT1的表达，且呈剂量依赖效应。人肺癌细胞NCI-H157中抑癌基因RASSF1A发生了高度甲基化，在抑制DNMT1活性后，RASSF1A基因去甲基化而恢复表达。     

分子检测非小细胞肺癌外周血中MUC1表达的临床意义

 目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)患者外周血微转移的分子诊断的临床意义.方法应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,对31例肺癌患者和10例肺良性病变患者外周血中MUC1基因mRNA表达进行检测.结果术前10例NSCLC患者检测到外周血肺癌微转移,外周血微转移与肺癌组织学类型,细胞分化程度及P-TNM分期均存在密切关系(P＜0.05).10例肺良性病变患者的外周血中未检测到MUC1 mRNA表达.结论MUC1基因mRNA RT-PCR法检测肺癌患者外周血微转移具有较高的特异性和敏感性,可为制定治疗方案和评估预后提供重要参考依据.     

Downregulation of Rac1/PAK1/LIMK1/cofilin signaling pathway in colon cancer SW620 cells treated with Chlorin e6 photodynamic therapy

BackgroundColorectal cancer is one of the most common gastrointestinal malignancies. Photodynamic therapy (PDT) is a novel and non-invasive treatment for tumors as PDT features small trauma, good applicability, andaccurate targeting. PDT may also be a potential treatment for colon cancer as itmay may induce suppressive effects on metastatic potential.. However, the molecular mechanism of the Chlorin e6 Photodynamic therapy (Ce6-PDT) inhibiting the migration of human colon cancer SW620 cells remains unclear.MethodsScratch wound healing assay, scanning electron microscope, MTT, immunofluorescence and laser confocal technique were used to investigate the suppressive effects of Ce6-PDT on the SW620 cells migration, pseudopodia, viability and the actin cytoskeleton. The effect of Ce6-PDT on actin-Filaments and signaling molecules of the Rac1/PAK1/LIMK1/cofilin signaling pathway in SW620 cells were examined by western blot analysis. RNA interference (RNAi) technology was used to establish siRNA-Rac1/SW620 cells. The combined effects of Ce6-PDT and RNAi on colon cancer SW620 cells was investigated by the same technology and methods mentioned above to clarify the signal transduction effect of Rac1/PAK1/LIMK1/cofilin signaling pathway in Ce6-PDT caused inhibition of SW620 cell migration.ResultsThe healing and migration rate of the SW620 cells was significantly reduced and the cell pseudopodia were reduced or disappeared by Ce6-PDT. The Immunofluorescence and western blot analysis results showed that Ce6-PDT destroy microfilament’s original structure and significantly downregulated F-actin protein expression. The Rac1/PAK1/LIMK1/cofilin signaling pathway was downregulated by Ce6-PDT. Furthermore, the RNAi significantly strengthened the effect of Ce6-PDT on colon cancer SW620 cells migration.ConclusionsActin cytoskeleton and protrusions of SW620 cells correlate with its migration ability. Ce6-PDT suppresses SW620 cells migration by downregulating the Rac1/PAK1/LIMK1/cofilin signaling pathway, and its suppressive effect was enhanced by knocking down Rac1 gene expression.     

神经纤毛蛋白1在辐射诱导肺上皮细胞转化中的调控作用

目的 通过利用神经纤毛蛋白1（NRP1）不同表达水平的肺上皮细胞模型，检测电离辐射诱导上皮-间充质转化（EMT）标志物及相关转录因子表达变化，探讨NRP1对辐射诱导肺上皮细胞EMT发生中的作用。方法 对人肺Ⅱ型上皮细胞（A549）构建NRP1过表达（NRP1^high-A549）和NRP1敲低（NRP1^low-A549）细胞模型，同时对小鼠正常肺上皮细胞（MLE-12）构建siNRP1-MLE-12细胞模型并进行验证。对NRP1^high-A549、NRP1^low-A549和siNRP1-MLE-12细胞模型分别进行单次10 Gy X射线照射，于照射后0、12、24和48 h提取总蛋白和总RNA。利用Western blot法和q-PCR法检测各组细胞模型中EMT标志物（β-catenin、N-cadherin和Vimentin）及相关转录因子（Twist和ZEB1）的变化。结果 野生型A549和MLE-12细胞照射后NRP1 mRNA和蛋白表达显著升高，间充质标志物（Vimentin和N-cadherin）显著升高（A549：t=2.917、7.361，P<0.01；MLE-12：t=9.652、31.357，P<0.01），ZEB1和Twist转录因子表达显著升高（A549：t=4.852、9.278，P<0.01；MLE-12：t=30.985、17.266，P<0.01）。NRP1^low-A549和siNRP1-MLE-12组受照后Vimentin和N-cadherin表达显著下降（NRP1^low-A549：t=10.077、15.707，P<0.01；siNRP1-MLE-12：t=5.745，P<0.01），上皮标志物（β-catenin）蛋白表达显著升高；而NRP1^high-A549组照射后N-cadherin和Vimentin显著升高（t=16.055、5.560，P<0.01），而β-catenin显著下降。检测NRP1^low-A549组Twist转录因子在照射后显著下降（t=3.987，P<0.01），而NRP1^high-A549组ZEB1和Twist转录因子照射后呈时间依赖性升高（t=11.289、2.903，P<0.01）；siNRP1-MLE-12细胞模型照射后ZEB1转录因子显著下降（t=13.449，P<0.01），siNRP1-MLE-12组ZEB1和Twist蛋白表达均低于对照组，呈时间依赖性下降。结论 NRP1可促进辐射诱导人和小鼠上皮细胞的EMT发生，而这种促进作用可能通过上调转录因子ZEB1和Twist的表达。