实时荧光定量聚合酶链反应筛选重组人骨形态发生蛋白-2诱导比格犬骨髓基质干细胞成骨分化差异表达的miRNAs

目的 利用实时荧光定量聚合酶链反应(Q-PCR)方法筛选骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)诱导比格犬骨髓基质干细胞(BMSCs)成骨分化的miRNAs,探讨过表达miRNAs对成骨分化的影响.方法 选取4只比格犬分离BMSCs原代,取培养至第3代BMSCs分为2组:对照组(用基础培养基培养)和实验组(在基础培养基中加入rhBMP-2培养7d,诱导细胞成骨分化).采用碱性磷酸酶染色法验证细胞成骨分化情况,采用Q-PCR法筛选成骨分化细胞与对照组细胞差异表达的miRNAs;随机选择其中一种低表达miRNA(miR-125b),采用Lipofectamine2000进行转染,其中实验组1转染miR-125bmimics以过表达miR-125b,其阴性对照实验组2转染mimics-NC,验证过表达miR-125b 7 d后对rhBMP-2诱导的比格犬BMSCs成骨分化的影响. 结果 成功建立比格犬BMSCs培养方法;rhBMP-2诱导比格犬BMSCs成骨分化7d后,进行Q-PCR筛选,获得表达差异相对于对照组达到2倍以上的miRNAs 41个,其中表达上调的有13个,表达下调的有28个;实验组1相对于实验组2,细胞中miR-125b表达上调4.13倍(P＜0.05).转染7d后,ALP染色结果显示:实验组1细胞质中深蓝色粗大颗粒明显少于实验组2. 结论 采用Q-PCR方法筛选比格犬BMSCs成骨分化的miRNAs系统高效、准确.筛选获得的miRNAs中,miR-125b过表达能够显著抑制比格犬BMSCs的成骨分化.     

联合rhBMP-2与成骨细胞诱导骨髓基质细胞成骨分化的实验研究

目的探讨rhBMP-2和成骨细胞联合诱导骨髓基质细胞(BMSCs)的成骨分化能力。方法应用全骨髓贴壁法分离培养4周龄SD大鼠的BMSCs,通过改进酶消化法结合反复贴壁法培养1日龄SD乳鼠成骨细胞。实验分为4组:rhBMP-2诱导组、成骨细胞诱导组、rhBMP-2+成骨细胞诱导组、单纯培养液组。倒置相差显微镜及扫描电镜观察细胞生长情况;分别收集第3、6、9天细胞培养液上清液定性及定量测定碱性磷酸酶并进行统计学分析。结果 rhBMP-2诱导组、成骨细胞诱导组、rhBMP-2+成骨细胞诱导组均检测出成骨细胞生成,其中,rhBMP-2+成骨细胞诱导组碱性磷酸酶含量明显大于前两组,差异有统计学意义(P0.05)。结论rhBMP-2、成骨细胞、rhBMP-2联合成骨细胞均能提供成骨微环境,并在体外诱导BMSCs向成骨细胞分化,rhBMP-2联合成骨细胞对BMSCs的成骨分化具有更优的诱导能力。     

尼古丁对大鼠骨髓间充质干细胞软骨分化的干预作用研究

目的 从细胞水平证实尼古丁对大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)诱导分化为软骨细胞的干预作用.方法 大鼠BMSCs传代至第3代,以海藻酸钠微球生物支架进行BMSCs三维培养.加入转化生长因子β1(TGF-β1)进行诱导分化,在细胞分化过程中,分别给予0.1、1、10、100μmol/L尼古丁干预,设对照组.第28天收获细胞,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞代谢活力、阿利新蓝特殊染色检测细胞中氨基葡聚糖的含量、实时荧光定量PCR检测软骨分化标志基因(COL2A1、Aggrecan、COL1A1、COL10A1)的表达情况.结果 诱导培养28 d后,MTT法结果示不同浓度尼古丁干预后的各组细胞代谢活力与对照组细胞相比,没有明显改变;当尼古丁作用浓度分别为0、0.1、1、10和100μmol/L时,其BMSCs海藻酸钠微球的阳性染色区域占切片的百分比分别为90.1％、76.5％、64.8％、44.1％、4.5％;与对照组比较,尼古丁能显著抑制软骨诱导分化下的BMSCs细胞中Aggrecan、COL2A1的表达,同时促进COL1A1、COL10A1的表达(P均<0.05),并且存在浓度依赖性.结论 尼古丁能够明显抑制大鼠BMSCs的软骨分化,导致其软骨分化质量差.     

联合转染人VEGF165和ANG-1双基因对大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的影响

[目的]研究联合转染入血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和血管紧张素-1(ANG-1)双基因对大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)成骨分化潜能的影响.[方法]将本室构建的编码人VEGF165和ANG-1双基因腺病毒质粒pAd-VIA在QBI-293A细胞内进行包装和扩增,获得腺病毒载体pAd-VIA,将其体外转染大鼠BMSCs,应用诱导培养液定向诱导向成骨细胞分化.实验分为4组:A.腺病毒载体pAd-VIA转染BMSCs并诱导组;B.BMSCs诱导组;C.腺病毒载体pAd-VIA转染BMSCs组;D.单纯BMSCs组.通过碱性磷酸酶(ALP)染色和活性的测定、Ⅰ型胶原免疫荧光染色、茜素红染色来评价联合转染双基因对BMSCs成骨分化潜能的影响.[结果]重组腺病毒质粒pAdVIA在QBI-293A细胞内成功包装和扩增,有大量的绿色荧光蛋白表达,体外转染大鼠BMSCs后,A、B组的ALP染色、Ⅰ型胶原免疫荧光染色、茜素红染色为阳性,而C组和D组为阴性.ALP活性表达具有时间相关性,3 d开始表达,7 d到达高峰,在7、14 d,A、B组与C、D组之间ALP表达均具有统计学差异(P＜0.01),A组和B组之间,在各个时间点均无统计学差异(P＞0.05).[结论]腺病毒载体pAd-VIA转染大鼠BMSCs后,未明显影响其体外成骨分化潜能.     

大鼠骨髓间充质干细胞来源外泌体对退变髓核细胞的影响

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)来源外泌体对退变髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)的影响。方法:利用全骨髓法提取SD大鼠骨髓内贴壁细胞,通过成骨、成脂、成软骨三系分化及流式细胞技术鉴定所提取细胞是否为BMSCs,鉴定成功后,收取细胞培养液上清,对上清液进行差速离心,Western-blot(WB)法测定离心沉淀物质CD63、CD81、TSG101、Calnexin蛋白表达情况,并对沉淀物进行透射电镜观察鉴定是否为外泌体。取SD大鼠尾NPCs,传代培养,通过细胞衰老β-半乳糖苷酶染色法鉴定P6 NPCs是否较P2 NPCs产生退变;在激光共聚焦显微镜下观察BMSCs外泌体被P6 NPCs摄取情况;设置P6 NPCs为对照组,BMSCs和P6 NPCs一起培养为共培养组,直接加入BMSCs外泌体诱导P6 NPCs为实验组。培养3d、7d、10d、14d后用RT-PCR法检测3组NPCs中蛋白聚糖(ACAN)、Ⅱ型胶原(COL2)、性别决定区Y方框9(SOX-9)、金属蛋白酶组织抑制剂1 (TIMP1)、基质金属蛋白酶1 (MMP1)基因m RNA的相对表达量;WB法检测ACAN、COL2、SOX-9、TIMP1、MMP1对应蛋白的相对表达情况。结果:通过成骨、成脂、成软骨三系分化及流式细胞技术鉴定利用全骨髓法提取的贴壁细胞为BMSCs。BMSCs培养液上清利用差速离心法提取的沉淀物形态为直径30～100nm的圆形或椭圆形,与文献记载的经典外泌体大小吻合,沉淀物CD63、CD81、TSG101高表达,Calnexin未表达。通过细胞衰老β-半乳糖苷酶染色法鉴定P6 NPCs较P2 NPCs产生明显退变。在激光共聚焦显微镜下观察到外泌体能够被P6 NPCs所摄取。ACAN、COL2、SOX-9、TIMP1基因mRNA的相对表达量在3d、7d、10d、14d共培养组较对照组明显升高(P0.05),实验组较共培养组明显升高(P0.05),共培养组和实验组组内7d较3d明显升高(P0.05)、10d较7d明显升高(P0.05)、14d较10d明显升高(P0.05);MMP1基因mRNA的相对表达量在3d、7d、10d、14d共培养组较对照组明显降低(P0.05),实验组较共培养组明显降低(P0.05),共培养组和实验组组内7d较3d明显降低(P0.05)、10d较7d明显降低(P0.05)、14d较10d明显降低(P0.05);ACAN、COL2、SOX-9、TIMP1、MMP1基因相对应蛋白质表现出同样趋势。结论:在体外实验中,大鼠BMSCs能够分泌外泌体且外泌体能够被退变NPCs摄取,外泌体能够改善退变NPCs标志基因及基因对应蛋白质的表达,可为髓核细胞退变类疾病的治疗提供一种新的思路。     

hBMP-2基因转染兔骨髓间充质干细胞的表达及生物学效应的观察

目的:观察人骨形态发生蛋白-2(humanbonemorphogeneticprotein-2,hBMP-2)基因转染兔骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)后的表达及表达产物对BMSCs增殖和向成骨细胞分化的影响。方法:利用腺病毒表达载体Adeno-XTM将hBMP-2基因转染兔BMSCs,用免疫组化染色。检测细胞内BMP-2的表达。然后通过MTT法分析其对细胞增殖的影响,并分别通过体外检测Ⅰ型胶原合成和表达情况、碱性磷酸酶染色和钙结节VonKossa染色,观察腺病毒介导hBMP-2基因转染兔BMSCs的成骨分化能力。结果:转基因细胞6周时仍能表达外源性基因。基因表达产物hBMP-2能明显促进BMSCs的增殖以及I型胶原的合成,转染后第14天碱性磷酸酶染色多数细胞为阳性,第21天出现钙结节。结论:hBMP-2基因转染BMSCs后可获得稳定表达,且基因表达产物能促进BMSCs增殖,并诱导其向成骨细胞分化。     

Notch信号在骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞过程中的表达

目的 探讨Notch信号在骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为成骨细胞过程中的调控作用.方法 分离培养犬BMSCs,并用流式细胞仪鉴定,观察其增殖及传代情况.将BMSCs分为实验组与对照组,实验组将BMSCs诱导分化为成骨细胞,未诱导分化的BMSCs为对照组,用RT-PCR及Western-blot方法等检测BMSCs分化为成骨细胞的情况,以及Notch信号蛋白的表达情况.结果 流式细胞仪鉴定BMSCs表面标记CD29,茜素红染色及RT-PCR显示诱导分化为成骨细胞,Western-blot显示实验组有Notch信号蛋白的表达,随着分化时间的延长而增强,而对照组表达微弱.结论 BMSCs在分化为成骨细胞过程中Notch信号蛋白的表达增强.     

人BMSCs自噬水平和成骨分化能力比较

目的比较老年骨质疏松(osteoporosis,OP)和健康成年人椎体中骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)自噬水平和成骨分化能力。方法取从2组手术患者椎体中培养的BMSCs细胞,Western blot检测自噬相关基因LC3和P62蛋白表达。转染含LC3-GFP质粒的腺病毒后,激光共聚焦下观察代表自噬体的绿色荧光斑点数。细胞经成骨诱导分化培养基刺激后,碱性磷酸酶染色比较早期成骨指标,茜素红染色比较晚期成骨指标钙盐沉积的影响。荧光定量PCR(q-PCR)检测骨形成相关基因I(collagen type I,COL I)、骨钙素(osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)以及Runt相关转录因子2(RUNX2)。结果 Western blot结果显示OP组BMSCs的LC3-II/I表达明显降低,而P62表达明显增高(P0.05);激光共聚焦观察进一步证实OP组中绿色荧光斑点数目显著下降,说明细胞内自噬体数目减少(P0.05)。两组BMSCs经成骨诱导后,茜素红和碱性磷酸酶染色发现OP组阳性程度明显弱于正常对照组,而q-PCR结果显示成骨分化的一些关键指标COL I、OCN、OPN和RUNX2在OP组中均显著下降,差异具有统计学意义(P0.05)。结论骨质疏松的BMSCs中自噬水平较正常细胞低,且成骨分化能力更弱。     

双向诱导的骨髓基质干细胞体外成骨与成血管的实验研究

目的 探讨双向诱导的骨髓基质干细胞(BMSCs)形成内皮细胞、成骨细胞与BMSCs共存体系的体外成骨与成血管的能力.方法 采用密度梯度离心法分离培养兔BMSCs.贴壁细胞分为四组:A组(单纯的BMSCs组)、B组(成骨诱导的BMSCs组)、C绀(内皮诱导的BMSCs组)和D组(双向诱导的BMSCs组).通过倒置相差显微镜观察细胞形态学变化,并采用流式细胞仪检测诱导前后的细胞表面抗原,采用茜素红染色观察钙结节,基质胶成血管法观察四组细胞体外成血管的能力.结果 ①经流式细胞学检测,分离培养的BMSCs主要表达CD90、CD105和CD44;BMSCs向内皮细胞诱导1周后,细胞表面抗原CD34和CD133的表达升高,而CD90和CD105的表达减少,相比诱导前差异有统计学意义(P<0.05);BMSCs继续向成骨细胞诱导1周后,细胞表面抗原CD44和HLA-DR升高,相比诱导前差异有统计学意义(P<0.05).②茜素红染色结果显示D组的钙结节大于B组,而A组和C组未见钙结节形成.③体外血管新生试验中,C组的管道数目与面积大于D组,差异有统计学意义(P<0.05),而A组与B组未见管道形成.结论 BMSCs双向诱导形成内皮细胞、成骨细胞与BMSCs共存体系,在体外共培养过程中不仅可以形成钙结节,而且可以形成微血管,有利于骨组织和血管联合构建,是一种良好的构建组织工程骨的种子细胞.     

ASPN Synergizes with HAPLN1 to Inhibit the Osteogenic Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cells and Extracellular Matrix Mineralization of Osteoblasts

Objective

Bone marrow mesenchymal stromal cells (BMSCs) are major sources of osteogenic precursor cells in bone remodeling, which directly participate in osteoporosis (OP) progression. However, the involved specific mechanisms of BMSCs in OP warrant mass investigations. Initially, our bioinformatics analysis uncovered the prominent up-regulation of Asporin (ASPN) and proteoglycan link protein 1 (HAPLN1) in osteoblasts (OBs) of OP patients and their possible protein interaction. Hence, this study aimed to explore the effects of ASPN and HAPLN1 on osteogenic differentiation of BMSCs, extracellular matrix (ECM) mineralization of OBs, and osteoclastogenesis, hoping to offer research basis for OP treatment.

Methods

GSE156508 dataset was used for analysis and screening to acquire the differentially expressed genes in OBs of OP patients, followed by the predicative analysis via STRING. OP mouse models were induced by ovariectomy (OVX), and ASPN and HAPLN1 expression was determined. BMSCs and bone marrow macrophages (BMMs) were isolated from OVX mice and induced for osteogenic differentiation and osteoclastogenesis, respectively. After knockdown experiments, we assessed adipogenic differentiation and osteogenic differentiation in BMSCs. Osteogenic (OPN, OCN, and COL1A1) and osteoclast (Nfatc1 and c-Fos) marker protein expression was determined. The binding of ASPN to HAPLN1 was analyzed.

Results

High expression of ASPN and HAPLN1 and their protein interaction were observed in OBs of OP patients via bioinformatics and in bone tissues of OVX mice. ASPN interacted with HAPLN1 in BMSCs of OVX mice. ASPN/HAPLN1 knockdown increased ALP, OPN, OCN, and COL1A1 protein expression and ECM mineralization in BMSCs while decreasing Nfatc1 and c-Fos expression in BMMs. These effects were aggravated by the simultaneous knockdown of ASPN and HAPLN1.

Conclusion

Our results indicate that ASPN synergises with HAPLN1 to suppress the osteogenic differentiation of BMSCs and ECM mineralization of OBs and promote the osteoclastogenesis in OP.     

左归丸含药血清调节Runx2激活ALP、OPN蛋白促进BMSCs增殖和分化的研究

目的 探讨左归丸(Zuoguiwan, ZGW)的补肾填精、益髓壮骨的作用,促进骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)的增殖和向成骨细胞方向分化。方法 制备ZGW含药血清,设置10%FBS DMEM组、成骨诱导液组、2.5%空白大鼠血清-成骨诱导液组、2.5%ZGW含药血清-成骨诱导液组。采用MTT法观察各组对BMSCs的增殖,使用碱性磷酸酶钙钴染色法检测BMSCs向成骨细胞方向的分化能力,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)法检测细胞培养液中AKP的含量,Western blot检测BMSCs中Runt相关转录因子2(Runx2)、骨钙蛋白(osteocalcin, OPN)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)蛋白的表达。结果 2.5%ZGW含药血清-成骨诱导液组能够促进BMSCs的快速增殖,较早地进入平台期,促进BMSCs中AKP的分泌,提高ALP含量,上调BMSCs细胞中Runx2、ALP和OPN的蛋白表达水平。结论 ZGW抗骨质疏松的分子机制,可能与调节Ru...     

水蛭素通过上调VEGF/Notch1信号通路促进人骨髓间充质干细胞成骨分化

摘要：目的 观察水蛭素对人骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC）成骨分化的影响。方法 BMSCs细胞分为正常培养的对照组、成骨诱导的诱导组以及加入不同浓度（1、10、20 ATU/mL）处理的水蛭素组。MTT检测细胞增值并筛选水蛭素最适作用浓度。流式细胞仪检测细胞凋亡。RT-PCR和Western blot分别检测成骨基因Runx2、Osterix、COL1A1的mRNA和蛋白表达。BCIP/NBT染色法检测细胞中的碱性磷酸酶水平。茜素红染色检测矿化结节。检测VEGF、Notch1、Jagged1和CBF1的mRNA和蛋白表达。结果 骨髓间充质干细胞经成骨诱导细胞增殖显著增加,中高浓度的水蛭素可以不同程度促进成骨诱导的BMSCs细胞增殖（P＜0.05）,并筛选出20 ATU/mL作为水蛭素的使用浓度。水蛭素抑制成骨诱导的BMSCs细胞凋亡,上调Runx2、Osterix、COL1A1的mRNA和蛋白表达,增加碱性磷酸酶水平,促进细胞中矿化结节的生成,并提升BMSCs细胞中VEGF、Notch1、Jagged1和CBF1的表达（P＜0.05）。结论 水蛭素可能通过上调VEGF/Notch1信号通路促进人骨髓间充质干细胞成骨分化。     

miR-187-5p 对骨髓间充质干细胞成骨分化能力的调控作用

目的利用小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的成骨分化模型,探讨miR-187-5p在成骨分化中的表达趋势及调控作用。方法通过切除雌性小鼠双侧卵巢构建小鼠骨质疏松模型;应用qRT-PCR技术检测组织和细胞中miR-187-5p的表达;应用基因转染技术观察过表达或敲减miR-187-5p对BMSCs向成骨分化的影响;应用茜素红和碱性磷酸酶染色检测BMSCs中矿化结节的数量和矿化区域的染色面积。结果 qRT-PCR结果显示miR-187-5p在骨质疏松模型小鼠的骨组织及BMSCs中均表达下降。过表达miR-187-5p可提高ALP、Collagen-1、Runx2、BMP4、OCN和OPN等成骨分化相关基因mRNA的表达,促进BMSCs向成骨分化;而敲减miR-187-5p降低ALP等成骨分化相关基因mRNA的表达,抑制BMSCs向成骨分化。在体实验同样证实,过表达miR-187-5p可以显著促进骨质疏松小鼠BMSCs向成骨分化,改善小鼠的骨质疏松表型。结论过表达miR-187-5p促进BMSCs向成骨分化,敲减miR-187-5p抑制BMSCs向成骨分化。     

脂联素通过调节BMP信号通路促进骨髓干细胞成骨分化

目的 研究脂联素（adiponectin, ApN）对骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）成骨分化的作用,并探讨其可能的机制。方法 体外培养BMSCs,构建ApN过表达质粒及干扰质粒,转染至BMSCs中。将BMSCs随机分为5组：对照组、过表达组、过表达空载组、干扰组和干扰空载组。茜素红染色观察各组细胞钙化沉积。碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）染色观察各组细胞成骨分化能力。qRT-PCR检测ApN受体、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）信号通路及成骨相关基因表达情况。结果 与对照组相比,过表达组BMSCs中钙化沉积和ALP阳性表达增多,AdipoR1、AdipoR2、BMP2、RUNX2、Smad1和Smad5 mRNA表达量显著升高（P<0.05）;干扰组BMSCs中钙化沉积和ALP阳性表达减少,AdipoR1、AdipoR2、BMP2、RUNX2、Smad1和Smad5 mRNA表达量显著降低（P<0.05）。结论 ApN可能通过上调BMP信号通路促进BMSCs成骨分化。     

BMSCs来源成骨细胞和内皮细胞复合壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架构建血管化组织工程骨研究

目的探讨大鼠BMSCs来源的成骨细胞和内皮细胞复合壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架植入大鼠桡骨缺损处的成骨作用和成血管作用。方法取分离培养至第3代的SD大鼠BMSCs行成骨和成内皮细胞诱导并鉴定。分别将内皮细胞(A组)、成骨细胞(B组)、混合细胞(成骨细胞和内皮细胞比例为1∶1,C组)均匀滴加于壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架上制备3组细胞-支架复合物,MTT检测支架内细胞增殖活性。取2月龄雄性SD大鼠30只,制作大鼠桡骨5 mm长缺损模型并分别植入3组细胞-支架复合物(n=10)。术后4、8、12周分别取移植物行HE染色观察,CD34免疫组织化学染色计数微血管密度,RT-PCR法检测骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和骨保护素(osteoprotegrin,OPG)mRNA表达。结果 BMSCs成骨诱导7 d后ALP染色可见细胞质内蓝染颗粒,细胞核呈红染;内皮细胞诱导14 d后,CD34免疫细胞化学染色可见细胞内棕色颗粒。MTT检测示3组细胞活性随时间延长逐渐升高。HE染色示,术后12周A组未见明显类骨质形成,而有较密集的微血管结构及较多纤维组织形成;B、C组可见均质的类骨质,呈条索状和岛状分布,可见大量成骨样细胞存在。术后各时间点A、C组微血管密度均显著高于B组(P<0.05);A组术后12周微血管密度高于C组(P<0.05),其余2个时间点A、C组间差异无统计学意义(P>0.05)。A组3个时间点OPN和OPG mRNA表达水平均较低,与B、C组比较差异有统计学意义(P<0.05);B、C组分别于术后8、12周OPN mRNA表达达峰值,4周时OPG mRNA表达达峰值。结论 BMSCs来源的成骨细胞和内皮细胞按1∶1比例共培养于壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架作为组织工程骨移植物,可以促进大鼠桡骨缺损部位骨的形成和血管化,促进骨缺损愈合。     

补骨脂素诱导BMSCs成骨分化中的LncRNA表达谱分析

目的观察补骨脂诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化过程中长链非编码RNA(lncRNA)的表达谱及相关靶基因和信号通路。方法取P2代BMSCs分为三组:空白组(含10%FBS的L-DMEM)、成骨诱导组(含10%FBS及成骨诱导剂的L-DMEM)、补骨脂素组(含10%FBS的L-DMEM及10μmol/L补骨脂素),同一环境不同诱导条件干预21 d;利用Agilent lncRNA芯片筛选出成骨诱导分化过程中表达差异2倍以上的lncRNA,并通过荧光定量PCR对芯片结果进行验证。选取筛选结果中表达差异较大的lncRNA进行GO和KEGG分析。结果成骨诱导分化21 d后持续表达超过2倍的lncRNA共有446个差异表达的lncRNAs。在BMSCs成骨分化过程中,共筛选出5个lncRNA显著上调,4个lncRNA显著下调。其中XR009483上调最显著,而XR007366下调最显著,经PCR验证与芯片结果相符。经GO分析富集度较高的为骨及软骨发育、干细胞分化等生物进程,以及胶原合成、骨化和钙化等生物功能。KEGG分析主要富集于15个生物学通路,其中富集评分较高的是TGF-beta、Wnt、NF-kappa B及Calcium等生物学通路。结论补骨脂素诱导BMSCs成骨分化过程中lncRNA表达谱发生显著变化,提示差异表达的lncRNA可能与BMSCs成骨分化密切相关,为研究补骨脂素促BMSCs成骨分化机制奠定了一定基础。     

BMP-2联合低氧环境诱导BMSCs向软骨表型分化的研究

目的探讨BMP-2联合低氧环境诱导BMSCs向软骨表型分化的可行性,并进一步研究其生物学机制。方法取4周龄健康清洁级雌性SD大鼠骨髓采用贴壁法体外培养BMSCs,取第2代细胞根据培养条件不同分为4组:常氧对照组(A组)、常氧加BMP-2诱导液组(B组)、低氧(O2浓度3%)对照组(C组)和低氧加BMP-2诱导液组(D组)。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,培养7、14、21 d阿利新蓝染色检测各组软骨基质糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAG)分泌水平,21 d时Western blot检测细胞内Ⅱ型胶原和低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)蛋白表达水平,RT-PCR检测成软骨、成骨以及低氧相关基因表达水平。结果诱导培养21 d,D组细胞变为类圆形,细胞密度降低,细胞周边呈陷窝样,基质包裹细胞;A、B、C组均未见上述典型变化。D组阿利新蓝染色明显较其他组深,并随诱导时间延长蓝染加深,21 d时出现成片深染蓝色,其他组各时间点仅见散在少量的淡染蓝色。Western blot检测D组细胞内Ⅱ型胶原蛋白表达水平较其他组显著增高,C、D组HIF-1α蛋白表达水平较A、B组显著增高,差异均有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR检测D组成软骨分化相关指标Ⅱ型胶原α1(collagenⅡα1,COL2α1)、聚集蛋白聚糖表达最高,而B组成骨分化相关指标COL1α1、ALP、Runt相关转录因子2表达水平最高,C、D组低氧相关指标HIF-1α较A、B组显著增强,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 BMP-2联合低氧(O2浓度3%)环境可以诱导大鼠BMSCs向软骨分化,并抑制其成骨分化,HIF-1α可能是参与促软骨生成过程中的一个重要信号分子。