金黄色葡萄球菌体外感染侵入人成骨细胞的实验研究

目的：体外实验检测金黄色葡萄球菌（金葡菌）感染侵入人的成骨细胞情况以及观察不同细菌感染剂量、时间及侵入细胞内细菌数量变化。方法：采用透射电镜方法观察金葡菌感染人的成骨细胞,CFSE荧光标记细菌,流式细胞仪检测细菌感染剂量、时间与侵入细胞内的细菌数量关系。结果：体外金葡菌能够感染侵入到人的成骨细胞内,随着细菌感染剂量增加,侵入细胞内的平均细菌数量和侵入率同步增加（P〈0.01）;感染4 h时细菌的侵入率最大,侵入细胞内的平均细菌数量在1~2 h差异无统计学意义（P〉0.05）,其余各时间均呈现明显不同（P〈0.01）。结论：体外金葡菌能够感染侵入到人的成骨细胞内,侵入细菌的数量与不同感染剂量及时间相关。     

金黄色葡萄球菌对成年大鼠牙槽骨成骨细胞的侵入

目的：探讨金黄色葡萄球菌能否对体外培养的成年大鼠牙槽骨成骨细胞进行侵入,并分析其侵入能力.方法：对金黄色葡萄球菌株ATCC 25923进行培养,观察生长曲线,以感染复数（MOI）50∶1感染大鼠牙槽骨成骨细胞,分析金葡菌在培养15、30、45、60 min后侵入的菌落数及侵入率.结果：金葡菌感染后15 min未有细菌侵入成骨细胞,在30、45、60 min 时出现侵入现象,到60 min 时侵入最多.结论：金黄色葡萄球菌可以侵入体外培养的大鼠牙槽骨成骨细胞,其侵入数量随时间延长而增多.     

金黄色葡萄球菌诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的观察

目的观察人脐静脉内皮细胞株ECV．304对金黄色葡萄球菌（S．aureus）感染的反应。方法常规方法制备金黄色葡萄球菌悬液,以1：1、1：10和1：100的感染复数感染ECV．304细胞1、3、6、12h和24h后,估算细胞吞噬细菌数,采用Hoechst33258染色,DNAladder及细胞凋亡相关因子RT．PCR检测细菌感染后细胞凋亡情况。结果金黄色葡萄球菌感染复数越高,细胞内吞噬的活细菌数越多。金黄色葡萄球菌感染导致ECV-304细胞发生凋亡,凋亡具有时间依赖性,随着感染时间的延长,凋亡小体增多,DNA片段也随之增多。抗凋亡细胞因子Bcl2mRNA表达量随着感染时间的延长下降,而促凋亡细胞因子Bax和Caspase．3表达量增多。结论金黄色葡萄球菌感染ECV-304细胞后,通过下调抗凋亡细胞因子Bcl2、上调促凋亡细胞因子Bax和Caspase-3诱导细胞凋亡。金黄色葡萄球菌感染内皮细胞的可能致病机制为临床治疗提供了实验依据。     

金黄色葡萄球菌诱导小肠上皮细胞炎性反应及凋亡作用的观察

目的观察研究小肠上皮细胞Caco-2细胞对金黄色葡萄球菌感染的反应。方法采用细胞内菌落技术法推算Caco-2细胞内吞金黄色葡萄球菌的能力,采用Realtime-PCR法检测Caco-2细胞NOD2基因在金黄色葡萄球菌感染时的表达情况,采用ELISA、流式细胞术等方法观察Caco-2细胞在金黄色葡萄球菌感染时细胞因子分泌水平,核转录因子(nuclear factorκB,NF-κB)活化水平和细胞凋亡发生率。结果 Caco-2细胞能够内吞金黄色葡萄球菌,金黄色葡萄球菌感染可引起Caco-2细胞内NOD2表达增高,NF-κB活化水平增高,分泌细胞因子水平升高,Caco-2细胞发生凋亡,且凋亡率随感染后时间延长增高。结论金黄色葡萄球菌能够激活Caco-2细胞的免疫反应,细胞内模式识别受体NOD2在识别细胞内细菌、信号传导、核转录因子激活中发挥关键作用。     

流式细胞术检测大鼠肺泡巨噬细胞吞噬荧光标记细菌的方法学探讨

目的建立流式细胞术检测大鼠肺泡巨噬细胞(AM)吞噬AlexaFluor 488(AF488)荧光染料标记细菌的方法。方法用不同浓度的AF488标记金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌,流式细胞术检测AF488对上述细菌的标记率和平均荧光强度;AM与不同浓度比例的AF488标记的细菌于37℃共孵育2、4、6和8 h,洗涤后加台盼蓝淬灭未被吞噬的细菌荧光,流式细胞术检测AM平均荧光强度、吞噬率和吞噬指数;激光共聚焦荧光显微镜下观察AM吞噬细菌的情况及分布。结果 AF488的浓度大于50μg/mL时,金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的标记率均大于92%(P0.05),金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的标记率在荧光染料浓度大于50μg/mL便已迅速达到上限。随着孵育时间的延长,AM的吞噬率从孵育2 h的20.4%升高到8 h的76.5%。随着细菌比例的增加,AM的吞噬率从1∶10的7.7%升高到1∶300的85.1%。结论流式细胞术检测AM吞噬AF488荧光染料标记的细菌是测定AM吞噬活性的有效方法,但染料浓度、孵育时间和细菌比例均会对结果产生影响。     

低频电配合手法推拿治疗早期乳腺炎49例

急性乳腺炎主要指的是细菌感染导致乳腺组织化脓性急性感染,金黄色葡萄球菌为主要感染细菌,多发生于产后1月内的哺乳妇女,尤其是初产妇更为多见。病原菌或直接侵入乳腺管,或自乳头皲裂破损处侵入,沿淋巴管蔓延至乳腺小叶间的脂肪、纤维组织引起的感染,若未合理处理将会形成乳腺脓肿,增加母亲的痛苦,并对婴儿喂养带来一定影响。选取2015年10月至2016年3月我医院收治的49例哺乳期乳腺炎患者。     

金黄色葡萄球菌侵入人脐静脉内皮细胞初期细胞骨架的动态变化

目的探讨不同毒力的金黄色葡萄球菌（标准菌株ATCC25923,产肠毒素株FRS6B）感染人脐静脉内皮细胞（HUVEC）初期,细胞骨架动态变化情况。方法常规方法制备菌液,分别感染HUVEC,1、2、4h后流式细胞仪分析细胞凋亡,应用激光共聚焦荧光显微镜观察细胞骨架的动态变化。结果两种不同毒力的金黄色葡萄球菌与HUVEC共育1h后即有凋亡细胞发生,共聚焦显微镜观察可见两种细胞作用1h后细胞骨架微丝、微管均发生了改变,作用4h后细胞内聚集大量细菌,细胞骨架微丝、微管部分开始解离。结论两种金黄色葡萄球菌感染HUVEC初期,产肠毒素菌株FRS6B诱导细胞凋亡明显高于ATCC25923,细胞骨架的动态变化存在差异。     

胆脂瘤型中耳炎细菌检测及耐药性分析

目的探讨胆脂瘤型中耳炎患者细菌感染的菌种分布及耐药性发生情况,为临床合理使用抗生素对抗胆脂瘤型中耳炎感染提供参考。方法选择74例到该院就诊的胆脂瘤型中耳炎患者耳部流脓标本进行培养,获得患者致病菌组成分布。对获得的菌株进一步进行生物膜半定量检测和药敏试验检测,分析其耐药性。结果所有观察对象中所获得的胆脂瘤型中耳炎致病菌从高到低分布依次为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌,有生物膜的细菌普遍比无生物膜的细菌耐药率高。结论胆脂瘤型中耳炎致病菌发生率高低可因"三间"不同而有差异,并且有生物膜的细菌比无生物膜的细菌耐药率高,值得临床注意。     

不同致病菌体外对人精子运动参数的影响

目的：为了研究金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和结核杆菌体外对人精子的运动功能有无直接影响。方法：将从临床泌尿生殖系感染病人中分离培养出的金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌和结核杆菌制成活菌悬液，然后将其在体外与10例健康成年男性手淫获得并经上游优化处理的精子按菌／精比50：1一起孵化0、2和4小时后，采用计算机辅助的精子分析系统检测入精子活率，运动参数（前向性运动百分率、直线速度VCL、曲线速度VSL、平均均路径速度VAP）和精子形态及凝集情况。结果：金黄色葡萄球菌与精子比例为50：1体外孵化0、2和4小时后，人精子活率和运动参数明显降低（P＜0．05）。表皮葡萄球菌和结核杆菌体外对人精子的活率和运动功能则无明显影响。结论：金黄色葡萄球菌与精子的比例为50：1体外孵化4小时内，能显著降低人精子活率和抑制精子运动功能。表皮葡萄球菌和结核杆菌对精子运动功能无直接影响。     

金黄色葡萄球菌富丝氨酸重复蛋白SraPL⁃Lectin特异性抗体的制备及其功能分析

目的：制备金黄色葡萄球菌富丝氨酸重复蛋白SraPL?Lectin单克隆抗体,并分析其体外功能。方法：以USA300基因组为模板,PCR扩增SraPL?Lectin基因序列,克隆到pET28a表达载体中,0.1 mmol/L IPTG 25 ℃诱导6 h,镍柱亲和层析纯化SraPL?Lectin?His蛋白。以纯化的SraPL?Lectin?His重组蛋白为抗原免疫Balb/c小鼠,采用常规融合技术制备杂交瘤细胞,间接ELISA法、Western blot法筛选和鉴定阳性杂交瘤细胞株。扩大培养阳性细胞株后注射小鼠腹腔,收集腹水,经Protein G柱纯化anti?SraPL?Lectin单克隆抗体。以不同终浓度的单克隆抗体预先孵育A549细胞和注射小鼠腹腔,涂板计数单克隆抗体阻断细菌黏附、侵入和感染的能力。结果：成功构建了SraPL?Lectin?pET28a重组表达载体,经镍柱纯化后获得高纯度的重组蛋白,获得稳定分泌单克隆抗体的细胞株,小鼠腹水经Protein G柱纯化后获得纯度高达95%以上的特异性抗体,效价1∶32万。终浓度100 ng/mL单克隆抗体预先孵育A549细胞2 h,能够显著降低金黄色葡萄球菌对A549细胞的黏附和侵入。提前1 d向小鼠腹腔注射1 μg anti?SraPL?Lectin单克隆抗体,能够显著降低小鼠血液中的金黄色葡萄球菌数量。结论：本研究制备的anti?SraPL?Lectin单克隆抗体能够阻断金黄色葡萄球菌对宿主细胞的黏附和侵入,为将SraPL?Lectin作为防控金黄色葡萄球菌感染药物靶点的研发奠定了基础。     

板蓝根对试验性小鼠遗传毒性的影响

目的：研究板蓝根水煎液在实验性小鼠体内是否具有遗传毒性。方法：应用小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验和小鼠精了畸形实验,观察板蓝根水煎液在小鼠体内能否诱发体细胞和雄性生殖细胞遗传物质的损伤。结果：板蓝根水煎液能明显诱发小鼠骨髓嗜多染红细胞微核和小鼠精子畸形,具有致突变作用。结论：板蓝根水煎液作为一种临床常用的清热解毒和治疗肿瘤的中草药,在剂量较大时,具有致突变性,临床使用上应注意。     

Relationship between expression of chemokine receptors CCR3, CCR5 and CXCR3 on CD4+ T cells and spontaneous abortion in mice

Background Previous studies have shown that local immune cells in the feto-maternal interface are recruited from peripheral blood, and that chemokines and their receptors play an initial and key role in this recruitment process. In this study, we aimed to determine whether spontaneous abortion is associated with the expression of chemokine receptors CCR3, CCR5, and CXCR3 on CD4^＋ T cells.
Methods Peripheral blood, spleen, and thymus were collected from the spontaneous abortion mouse model CBA/JxDBA/2 （SA group, n=14）, the normal pregnant mouse model CBA/JxBALB/c （NP group, n=13）, and normal non-pregnant CBA/J mice （NNP group, n=11）. The number of chemokine receptors CCR3, CCR5, and CXCR3 expressed on CD4^＋ T cells was measured by double-label flow cytometry （FCM） method.
Results In peripheral blood, the SA group had significantly lower CCR3 expression （P 〈0.01） and higher CCR5 and CXCR3 expression （P 〈0.01） on CD4^＋ T cells than did the NP group. But comparing these chemokines between the SA and NNP groups, there was no significant difference （P 〉0.05）. In spleen, the SA group expressed significantly lower CCR3 expression （P 〈0.01） and higher CCR5 and CXCR3 expression （P 〈0.05） on CD4^＋ T cells than did the NP group. When compared with the NNP group, the SA group had significantly higher CCR3 expression （P 〈0.01）, but was not statistically different with regards to the other two chemokines （P 〉0.05）. In thymus, the SA group had significantly lower CCR3 expression （P 〈0.05） and higher CXCR3 expression （P 〈0.05） on CD4^＋ T cells than the NP group, with no significant difference in CCR5 expression （P 〉0.05）. Compared with the NNP group, the SA group had higher CCR3 expression （P 〈0.01）, but there was no statistical difference in CXCR3 and CCR5 expression （P 〉0.05） between the two groups.
Conclusion The abnormal expression of CCR3, CCR5 and CXCR3 on CD4^＋ T cells may play an important role in the pathogenesis of spontaneous abortion.     

纳米二氧化硅颗粒对血管内皮细胞的毒性及其凋亡诱导作用

目的:研究纳米二氧化硅(SiO₂)颗粒的血管内皮细胞毒性和可能的作用机制,为探讨纳米SiO₂颗粒毒性效应及安全性评价提供参考依据。方法:将体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)随机分为对照组和不同浓度纳米SiO₂颗粒暴露组,暴露浓度分别为12.5、25.0、50.0及100.0 mg·L^-1。采用透射电镜(TEM)观察纳米SiO₂颗粒粒径、形貌及分散性。细胞处理24 h后,电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)法测定细胞中硅水平;MTT法测定细胞活力;乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测细胞膜的完整性;DCFH-DA荧光探针标记激光共聚焦显微镜观察细胞中活性氧(ROS)水平;DAPI染色荧光显微镜下观察细胞核形态;Annexin Ⅴ/PI双染标记流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率;罗丹明123线粒体试剂盒检测细胞线粒体膜电位。结果:TEM观察,纳米SiO₂颗粒分布均匀,大小一致,颗粒呈球形,分散性好,未发生聚集。用Image J 软件计算得到颗粒平均粒径为(57.66 ± 7.30)nm。与对照组比较,纳米SiO₂颗粒作用于HUVECs后,细胞活力下降(P<0.05),细胞中硅水平和培养液中LDH活性增加(P<0.05),细胞中ROS水平升高,线粒体膜电位下降,甚至发生细胞凋亡。上述细胞效应均表现为随颗粒作用浓度的增加而逐渐明显,呈现一定的剂量依赖关系。结论:纳米SiO₂颗粒具有血管内皮细胞毒性,可诱导ROS生成和氧化应激,从而破坏细胞膜、损伤线粒体,最终引发细胞凋亡。     

纳米SiO2颗粒在HepG2细胞中的分布及其细胞毒性

目的:检测纳米SiO2颗粒作用于HepG2细胞后纳米颗粒的细胞摄取、分布情况及颗粒对细胞的毒性作用,初步探讨纳米颗粒的摄取、分布与细胞毒性的关系.方法:采用透射电镜(TEM)及动态光散射法检测纳米SiO2颗粒的表征;纳米SiO2颗粒作用HepG2细胞后,用荧光显微镜及TEM观察纳米SiO2颗粒的细胞摄取及细胞内分布情况...     

纳米二氧化硅颗粒对肝HL-7702细胞的毒性作用

目的:探讨纳米二氧化硅(SiO₂)颗粒对肝细胞HL-7702的毒性作用,阐明其作用机制。方法:体外培养的人正常HL-7702肝细胞随机分为阴性对照组和12.5、25.0、50.0、100.0 mg·L^-1 SiO₂组。采用透射电子显微镜(TEM)和动态光散射(DLS)法对纳米SiO₂颗粒进行表征和粒径检测。细胞处理 24 h 后,HE染色观察各组细胞形态学;MTT实验检测各组细胞存活率;乳酸脱氢酶(LDH)活力实验检测各组细胞培养液中LDH活力;流式细胞术(FCM)检测各组细胞中活性氧(ROS)水平。结果:TEM观察,纳米SiO₂呈球形,颗粒大小较均匀一致,分散性较好,颗粒平均粒径为(65.87±9.02)nm;DLS法检测,纳米SiO₂颗粒在高纯水和RPMI-1640培养液中的水合粒径明显增大,分别为(124.57±8.02)和(139.32±9.93)nm。HE染色,纳米SiO₂颗粒能够导致HL-7702细胞形态改变,25.0和50.0 mg·L^-1 SiO₂组细胞数目减少,排列紊乱;100.0 mg·L^-1 SiO₂组细胞质皱缩、细胞排列稀疏,部分细胞呈凋亡的形态学表现。与阴性对照组比较,各浓度纳米SiO₂组HL-7702细胞存活率均下降,50.0和100.00 mg·L^-1 SiO₂组细胞存活率明显下降(P<0.05);50.0和100.00 mg·L^-1 SiO₂组培养液中LDH 活力明显升高(P<0.05),细胞中ROS水平明显升高(P<0.05)。结论:纳米SiO₂颗粒能够对HL-7702细胞产生毒性作用,并呈一定的浓度依赖效应;其毒性作用机制可能与细胞中ROS的产生有关联。     

胸腔积液CD14~+细胞表达白介素-16的研究

目的:探讨胸腔积液中CD14~+细胞能否合成和分泌白介素-16(IL-16)。方法:采用流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测细胞内细胞因子,即在胸腔积液中单个细胞水平上进行细胞膜表面抗原的染色和细胞内IL-16的测定;磁珠分选(Magneticcell sorting,MACS)法从胸腔积液中分离出CD14~+细胞,然后进行细胞培养并收集培养上清液,采用酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定IL-16的浓度。结果:胸腔积液中CD14~+细胞内IL-16显阳性的细胞百分率为(16.28±13.63)%(n=35);磁珠分选出胸腔积液CD14~+细胞,其培养上清液中IL-16的浓度为(58.51±25.38)ng/L(n=5)。结论:在一定条件下,CD14~+细胞(单核/巨噬细胞)有部分能合成和分泌IL-16。     

大蒜素体外抗猴甲型轮状病毒的研究

目的  研究大蒜素体外抗猴甲型轮状病毒（SA11）的作用。方法  通过病毒滴度测定来确定大蒜素能否抗SA11以及最佳浓度。结果  大蒜素对MA104细胞的最大无毒浓度为100 mg/ml,病毒滴度测定可以得出,50 mg/ml的大蒜素可以抑制SA11感染的MA104细胞出现细胞病变效应（CPE）。结论  一定浓度的大蒜素在体外有抗SA11的作用。

     

培养前后垂体细胞唾液酸含量对其免疫原性的影响

已证实组织或细胞经过培养后抗原性减低，将培养组织或细胞移植到同种或异种受体均能成活。本研究从细胞表面糖链入手，通过测定ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠垂体细胞培养前后末端糖唾液酸含量，以及培养前后垂体细胞的免疫原性改变，观察细胞表面唾液酸含量对其免疫原性的影响。结果发现培养后的垂体细胞唾液酸含量显著高于未培养细胞；细胞唾液酸含量增高后，其刺激异基因大鼠脾细胞增殖的能力降低。用唾液酸酶去除培养细胞表面部分唾液酸后，可大大恢复其刺激异基因脾细胞增殖的能力。提示培养细胞唾液酸表达增加是导致其免疫原性降低的重要分子学基础     

Warthin-starry silver method showing particulate matter in macrophage

Objective To verify whether Warthin-Starry （WS） silver method could detect the air particulate matter （PM）/dust particles （Ps） located within the macrophages in situ. Methods There were 26 autopsy cases that resulted from cerebral hemorrhage （group A）, silicosis （group B）, and fetal death during pregnancy （group C）. Samples were collected separately and serial sections were prepared from the lungs and lymph nodes and stained with hematoxylin and eosin （HE）, WS silver, immunohistochemistry of CD68. Furthermore, ultrathin sections were taken from the WS positive serial sections of groups A and B. Ps were observed under a transmission electron microscope （TEM） and the elements of Ps were measured by X-ray spectrum analysis （X-RSA）. Results In both groups A and B, WS staining was positive for the larger and fine Ps, the so called ＂dust cells＂, but HE staining was almost negative for fine Ps. In group C, no larger or fine Ps were found. Immunohistochemical staining of CD68 certified that the ＂dust cells＂ containing Ps were macrophages. The results of TEM and X-RSA proved that the structure and elements of Ps belonged to PM indeed. Conclusion WS staining is a better than HE staining in showing the location of PM within macrophages.