BDNF对H2O2诱导人成纤维细胞凋亡的实验研究

目的研究脑源性神经营养因子(BDNF)对H2O2诱导人成纤维细胞(hFB)凋亡的作用.方法将含人Ⅰ型胶原a1链(COLIA1)基因启动子和增强子元件并在其3'端接BDNFcDNA的微基因pSVCEPBFCAT,经脂质体介导转染hFB并驱动BDNF异位表达,采用四唑盐(MTT)显色法检测细胞增殖,吖啶橙荧光染色显微镜观察细胞形态的改变,琼脂糖凝胶电泳检测染色质DNA断裂.结果经200μmol/L H2O2作用24 h后,pSVCEPBFCAT转染组和对照组包括未转染hFB、空载体pSVCEPCAT转染hFB的细胞生长抑制率分别为35%和≥84%,p＜0.001;对照组hFB普遍可见凋亡细胞特有的形态学及生物化学改变,如胞浆和核固缩、染色质断裂、DNA电泳呈阶梯状条带,而pSVCEPBFCAT转染hFB未发现上述凋亡特征.结论BDNF促进hFB增殖和拮抗H2O2诱导凋亡,明显抑制H2O2对hFB的细胞毒性.     

PLC-γ1信号通路在H2O2诱导的PC12细胞凋亡中的作用

目的 探讨磷酸脂酶C-γ1(PLC-γ1)信号通路对H2O2诱导的PC12细胞凋亡作用的影响.方法 利用PLC-γ1特异性抑制剂U73122(10 pμmol/L)预处理PC12细胞,阻断50 μmol/LH2O2诱导的PLC-γ1信号通路,Hoechst/P1双染观察细胞形态改变,MTT评估细胞活力,流式细胞仪分析凋亡和坏死细胞比例,DNA电泳验证细胞凋亡状态的改变.结果 H2O2对PC12细胞活力的影响呈时效和量效关系.PLC-γ1信号通路阻断后,PC12细胞出现了凋亡形态学改变,细胞活力明显降低.流式细胞仪检测出现典型的凋亡亚二倍体峰,凋亡细胞所占比例达35.7%,DNA电泳呈现明显的梯形条带.结论 PLC-γ1信号通路在50 μmol/L H2O2诱导的PC12细胞凋亡中发挥重要的保护作用.     

转染过氧化氢酶-过氧化物酶基因对H2O2诱导PC12细胞凋亡的保护作用

目的观察转染过氧化氢酶-过氧化物酶(CPX)基因对过氧化氢(H2O2)诱导细胞凋亡的保护作用.方法以CPX基因转染PC12细胞,用遗传霉素(G-418)筛选出含目的基因的单克隆细胞系.以RT-PCR法检测CPX基因mRNA的表达,用免疫细胞化学、酶活性测定技术检测目的蛋白的表达;用H2O2处理细胞,观察其抗凋亡的能力;通过电镜、DNA片段化的测定、MTT比色微量分析及流式细胞凋亡率分析观察转基因后对H2O2诱导细胞凋亡的保护作用.结果用H2O2处理细胞,未转染CPX基因的PC12细胞出现凋亡的特征性形态学改变,电泳可见断裂的DNA片段;流式细胞仪检测细胞凋亡率较转染组明显增加;MTT比色微量分析显示细胞活力下降(均P<0.01).而转染CPX基因的PC12细胞以上改变均不明显,形态学接近正常,细胞凋亡的各项指标均明显改善.结论转染CPX基因能保护H2O2所致的神经细胞凋亡.     

As2O3对HGC-27、HepG2细胞株增殖抑制作用及机制研究

目的探讨三氧化二砷（As2O3）抑制恶性肿瘤细胞生长及诱导凋亡的生物学效应。方法采用光学显微镜进行形态学观察。溴化二甲噻唑二苯四氮唑（MTT）还原法经浓度为1.25μmol/L、2.50μoml/L、5.00μoml/L、10.00μmol/L、20.00μmol/L As2O3处理后,分别培养48 h、72 h、96 h对胃癌细胞（HGC-27）、肝癌细胞（HepG2）生长的影响。用Hoeschst33258染色后在荧光显微镜下观察细胞凋亡形态。流式细胞仪检测不同浓度As2O3对胃癌细胞周期的影响。结果 HGC-27、HepG2细胞株经As2O3作用后,细胞增殖受到明显抑制;且随着药物浓度的升高及作用时间的延长,抑制率显著升高。经As2O3作用后,Hoechst33258染色可见凋亡细胞的核染色质凝聚且边缘化,并呈现DNA荧光碎片。流式细胞仪检测显示G1/G0细胞由正常对照组的68.55%上升到80.30%,而G2/M期细胞则从11.56%下降至2.53%,出现了明显的G1/G0期阻滞（P〈0.05）。结论 As2O3可以明显抑制胃癌细胞的增殖,对肝癌细胞的生长也有一定程度的抑制作用,并有明显的时-效关系和量-效关系,且能将细胞阻滞于G0/G1期;其抗肿瘤的作用机制可能与诱导肝癌细胞和胃癌细胞分化和凋亡、阻滞细胞周期等有关。     

二苯乙烯苷上调Bcl-2抑制内皮细胞凋亡

目的研究二苯乙烯苷（TSG）对过氧化氢（H2O2）诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的作用,以及对抗凋亡基因Bcl-2表达的影响。方法体外培养人脐静脉内皮细胞,筛选造模内皮细胞凋亡的H2O2浓度,以不同浓度二苯乙烯苷作用24 h。采用MTT法检测细胞生长活力,Hoechst33258染色观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western-blot检测Bcl-2蛋白的含量。结果过氧化氢能引起内皮细胞损伤,抑制细胞增殖,并且随着浓度增加,细胞生存率逐渐降低。其中300μmol/L H2O2作用后细胞增殖明显受到抑制,Hoechst33258染色可见大量凋亡细胞,流式细胞仪检测出明显的凋亡峰,Bcl-2蛋白的表达量显著减少;加入二苯乙烯苷作用后,随着TSG浓度增加,细胞生存率增加,凋亡率逐渐降低;与H2O2造模组比较,10μmol/L的二苯乙烯苷预处理能够显著提高细胞生存率,抑制细胞的凋亡,并且使Bcl-2表达增加（P〈0.05）。结论二苯乙烯苷能抑制过氧化氢诱导的内皮细胞凋亡,该作用与上调Bcl-2表达有关。     

三氧化二砷诱导子宫颈癌HeLa细胞凋亡的初步研究

目的:研究三氧化二砷(As2O3)诱导子宫颈癌细胞系HeLa细胞凋亡,探讨As2O3 对子宫颈癌的临床应用意义。方法:采用四甲基偶氮唑盐比色(MTT)法检测浓度分别为1.0、2.0、5.0、10.0μmol/L的As2O3 作用1、2、3、4 d后HeLa细胞的存活率,并进行形态学观察;采用细胞凋亡原位检测(TUNEL)法进行细胞凋亡的检测。结果:2.0μmol/L As2O3 处理HeLa细胞48 h后,可见细胞的存活率明显降低(P<0.05),处理96 h后,细胞的存活率进一步降低(P<0.01),经5.0μmol/L As2O3 处理的HeLa细胞24 h后就明显可见细胞的存活率降低;As2O3 作用后,HeLa细胞具有明显的凋亡特征性改变;TUNEL法检测可发现HeLa细胞有DNA的断裂。结论:As2O3 可以诱导子宫颈癌HeLa细胞凋亡,抑制细胞增殖,随着As2O3 浓度增加,作用时间延长,效果越明显,其作用具有浓度和时间依赖性。     

仙茅苷对H2O2氧化损伤心肌细胞的保护作用

目的探讨仙茅苷对H2O2氧化损伤心肌细胞的保护作用及机制。方法体外培养大鼠原代心肌细胞,将其分为空白对照组、DMSO溶剂对照组（0.1%）、H2O2氧化损伤组（200μmol/L）、槲皮素干预组（槲皮素30μmol/L＋H2O2200μmol/L）、低浓度仙茅苷干预组（仙茅苷0.5μmol/L＋H2O2200μmol/L）、中浓度仙茅苷干预组（仙茅苷5μmol/L＋H2O2μmol/L）、高浓度仙茅苷干预组（仙茅苷50μmol/L＋H2O2200μmol/L）。用H2O2氧化损伤经槲皮素及不同浓度仙茅苷预培养24 h的心肌细胞,18 h后测定细胞培养液中乳酸脱氢酶（LDH）释放量、心肌细胞内丙二醛（MDA）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-px）含量,并测定心肌细胞的凋亡率和生长抑制率。结果 H2O2氧化损伤后LDH、MDA含量明显升高,GSH-px活性明显下降,细胞抑制率和凋亡率均增加（P〈0.01）;而经槲皮素、不同浓度的仙茅苷预处理组的心肌细胞,LDH、M DA含量明显下降,GSH-px活性明显升高,细胞生长抑制率和凋亡率均降低（P〈0.01）;且仙茅苷对心肌细胞氧化损伤的保护作用呈浓度依赖性。结论仙茅苷预处理心肌细胞可保护H2O2所诱导的氧化损伤,其作用可能与抑制脂质过氧化、增加抗氧化酶活性、减少心肌细胞凋亡有关。     

三氧化二砷诱导骨髓增生异常综合征SKM-1细胞凋亡机制的研究

目的：探讨三氧化二砷（ AS2O3）诱导骨髓增生异常综合征（MDS）SKM-1细胞的凋亡机制。方法将AS2O3与SKM-1细胞共育,采用形态学观察细胞生长,流式细胞术检测细胞凋亡,RT-PCR技术检测Bcl-2、Bax、caspase-3 mRNA表达。结果0．25、0．50μmol/L AS2 O3对SKM-1细胞无明显促凋亡作用（P＞0．05）,2．00、8．00、32．00μmol/L AS2 O3对SKM-1细胞有明显促凋亡作用,随着AS2 O3浓度增加及作用时间延长,凋亡发生率增加（P＜0．01）,抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表达下降（Ρ＜0．01）,促凋亡基因Bax、caspase-3 mRNA表达增加（P＜0．01,P＜0．05）。结论2、8、32μmol/L AS2 O3对SKM-1细胞有促凋亡作用,可能通过下调Bcl-2、上调Bax及caspase-3基因表达参与其中。     

三氧化二砷诱导喉癌Hep-2细胞凋亡及其对细胞周期的影响

目的 观察三氧化二砷（AS2O3）对喉癌Hep-2细胞株诱导细胞凋亡的作用和对细胞周期的影响。方法 体外培养的Hep-2细胞与不同浓度的AS2O3作用24、48、72h，通过MTT还原法检测细胞的生长抑制率，用倒置相差显微镜、流式细胞仪、荧光显微镜研究细胞凋亡的形态学改变，检测细胞凋亡率并进行细胞周期分析。结果 As2O3可有效抑制Hep-2细胞的生长，呈时间和浓度依赖性特点。形态学观察发现，As2O3诱导Hep-2细胞凋亡。2μmol/L As2O3作用24h，S期细胞比例增高，72h后，S期细胞明显下降，细胞大量凋亡。AS2O3在低浓度时，阻滞细胞通过S期，高浓度时诱导S期细胞凋亡。结论 AS2O3可诱导Hep-2细胞的凋亡，与细胞周期阻滞有关。     

HO-1介导H2O2 预处理对PC12细胞氧化应激损伤的适应性细胞保护作用

目的探讨血红素氧合酶-1(HO-1)对H2O2预处理的适应性细胞保护效应的介导作用。方法PI染色流式细胞仪(Flowcytometer,FCM)检测PC12细胞凋亡,流式细胞仪检测PC12细胞HO-1蛋白的表达。结果PC12细胞经10μmol/L H2O2预处理90 min后,20、30、50、100μmol/L H2O2对PC12细胞凋亡的诱导作用明显下降;10μmol/L H2O2预处理90 min后,PC12细胞HO-1蛋白表达量明显增加;给予10μmol/L的HO-1蛋白特异性阻断剂ZnPP后,可显著阻断10μmol/L H2O2预处理90 min对50μmol/L H2O2损伤PC12细胞的保护作用。结论血红素氧合酶-1(HO-1)介导了H2O2预处理对PC12细胞氧化应激损伤的适应性细胞保护作用。     

As2O3对组织因子、纤溶酶原激活物抑制剂-1和-2表达的影响

目的探讨三氧化二砷(As2O3)在诱导NB4、HL-60和THP-1 白血病细胞凋亡过程中对细胞内组织因子(TF)、纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)-1和-2 表达的影响.方法使用不同浓度的As2O3处理NB4、HL-60和THP-1 细胞,以生长曲线观察As2O3对细胞体外增殖的影响,并以琼脂糖电泳及流式细胞术观察细胞凋亡情况;用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法检测经As2O3处理后细胞内TF、PA I-1 和-2抗原含量的变化.结果① 1 μmol/L和8 μmol/L的As2O3分别作用NB4和HL-60细胞24 h后,细胞均出现典型的凋亡;而THP-1细胞在8 μmol/L As2O 3作用24 h后未出现细胞凋亡.② 1 μmol/L As2O3下调NB4细胞内TF抗原含量,与对照组相比差异显著(P<0.01),且TF抗原水平的降低呈As2O3剂量依赖性;而2 μmol/L As2O3诱导NB4细胞凋亡过程中,细胞内PAI-1抗原含量增加(P<0.0 5).③ 8 μmol/L As2O3诱导HL-60细胞凋亡过程中,细胞内TF抗原含量增加(P <0.01),但细胞内PAI-2抗原含量降低(P<0.05).④ THP-1细胞在8 μmol/L As 2 O 3处理24 h后,细胞内TF和PAI-2抗原含量均增加(P<0.05和P<0.01). 结论 As2O3对NB4、HL-60和THP-1细胞内的TF、PAI-1和PAI-2的表达有不同的影响.     

Arsenic trioxide induces multiple myeloma cell apoptosis viadisruption of mitochondrial transmembrane potentials and activation of caspase-3

Objective　To investigate the response of multiple myeloma (MM) cells to arsenic trioxide (As2O3 ) and their possible mechanisms. Methods　Two MM-derived cell lines RPMI8226 and U266 cells were used as in vitro models. Cell apoptosis was assessed by morphology, flow cytometry, and DNA gel electrophoresis. Mitochondrial transmembrane potentials (△Ψm) were evaluated by measuring cellular Rhodamine 123 staining intensity. Protein expression was analyzed using Western blot. Results　Zero point one to 0.5μmol/L As2O3 inhibited cell proliferation and 2.0?μmol/L As2O3 induced cell apoptosis, while 1.0μmol/L As2O3 inhibited proliferation with a weak degree of apoptosis induction in RPMI8226 and U266 cell lines. As2O3-induced apoptosis was accompanied by mitochondrial transmembrane potentials (△Ψm) collapse and caspase-3 activation in the presence of intact membrane. Glutathione depleter buthionine sulfoximine enhanced, while disulfide bond-reducing agent dithiothreitol partially antagonized As2O3 -induced △Ψm collapse and apoptosis in MM cells. All-trans retinoic acid (ATRA) could also induce apoptosis in RPMI8226 cells, but it did not show any cooperative effects with As2O3. Conclusion　As2O3 exerts apoptosis-inducing and growth-inhibiting effects on MM cells, and mitochondrium is a pivotal and common target of As2O3 for apoptosis induction.     

HSP70抑制H2O2所致C2C12肌原细胞Smac从线粒体的释放及细胞凋亡

目的：阐明HSP70对H2O2所致C2C12肌原细胞凋亡的影响及其作用机制。方法：采用基因瞬间转染技术使细胞HSP70或/和Smac高表达，采用Hoechst 33258染色观察H2O2 (0.5mmol/L)处理转基因C2C12肌原细胞不同时间后细胞核形态学改变并计算凋亡核百分率。DNA抽提及琼脂糖电泳观察凋亡特征性梯带。采用caspase活性定量检测试剂盒及蛋白质印迹分析caspase-9和caspase-3的活化。利用免疫荧光分析HSP70对H2O2所致Smac从线粒体释放的影响。结果：HSP70对H2O2及Smac所致C2C12肌原细胞凋亡具有明显的抑制作用,凋亡核百分率明显降低, DNA电泳未出现明显“梯状”条带;caspase-9和caspase-3的活化明显受到抑制;并进一步发现HSP70可抑制H2O2所致C2C12肌原细胞Smac从线粒体释放。结论：HSP70可通过抑制Smac从线粒体释放来抑制H2O2所致C2C12肌原细胞凋亡。     

硫胺素和核黄素对H2O2诱导的DNA氧化损伤的影响

目的 探讨硫胺素和核黄素对H2O2诱导人脐静脉内皮细胞ECV304的DNA氧化损伤的影响.方法 于细胞培养液中分别加入硫胺素(终浓度为10、100、500、1000 mg/L)或核黄素(终浓度为20、100、300、500 nmol/L)预处理24 h,给予H2O2(终浓度为25 μmol/L)反应30 min,采用单细胞凝胶电泳技术(SCGE)分析DNA氧化损伤情况.以不加H2O2、硫胺素和核黄素者为阴性对照组;以加H2O2而不加硫胺素、核黄素者为阳性对照组.结果 H2O2诱导ECV304细胞DNA断裂损伤,SCGE分析显示,阳性对照组拖尾细胞率、彗星尾长、尾部DNA含量和Olive尾矩等指标均较阴性对照组升高;经10、100、500 mg/L硫胺素或20、100、300 nmol/L核黄素预处理后,各DNA损伤指标均较阳性对照组显著下降(P<0.05或P<0.01);经1000 mg/L硫胺素或500 nmol/L核黄素预处理后,各DNA损伤指标与阳性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 适宜浓度的硫胺素和核黄素能降低H2O2诱导的DNA氧化损伤,高浓度的硫胺素和核黄素不能保护H2O2诱导的DNA氧化损伤.     

不同浓度的维生素C对C2C12成肌细胞增殖和凋亡的影响

目的：观察不同浓度的维生素C（VitC）对体外培养的骨骼肌成肌细胞（C2C12）增殖、凋亡的影响。方法：取体外培养的C2C12细胞,胰酶消化后制成单细胞悬液,离心重悬,调整细胞密度,按200 μL/孔接种,常规培养,待细胞融合率达80%且未出现细胞分化时,将细胞分6组：阴性对照组（C2C12 细胞中加入单纯无血清培养基）、H2O2组（C2C12 细胞中加入含500 μmol/L H2O2的无血清培养基）和VitC 1,2,3,4组（C2C12 细胞中加入含500 μmol/L H2O2的无血清培养基的基础上,分别加入不同浓度的VitC：10,20,60,100 mg/L）。分别在干预0,6,24,36,48,72 h后采用四甲基偶氮唑盐法（MTT）检测各组C2C12细胞的增殖。在干预36 h后采用Annexin V-PI双染法检测各组C2C12细胞凋亡率。结果：在干预36和72 h时,各浓度的VitC组的吸光度（OD）值均较H2O2组显著升高（P＜0.001）,其中以VitC 4组升高最为显著,而且VitC 4组在干预36 h时的吸光度值高于阴性对照组（P＜0.05）;在干预36 h时,VitC 2,3和4组的C2C12成肌细胞凋亡率明显低于H2O2组;VitC 2和3组的C2C12成肌细胞凋亡率高于阴性对照组,而VitC 4组的C2C12成肌细胞凋亡率明显低于阴性对照组,差异有统计学意义（P＜0.01）。结论：VitC能够有效抑制H2O2诱导的C2C12成肌细胞的凋亡,高浓度的VitC可能在干预36 h时对C2C12成肌细胞有促增殖的作用。     

双歧杆菌粘附素对脂多糖和H2O2调节肠上皮细胞增殖和凋亡的影响

目的 研究双歧杆菌分泌型粘附素对脂多糖(LPS)和H2O2体外调节肠上皮细胞增殖和凋亡的影响。方法 用^3H-TdR掺入法、流式细胞仪和荧光染色等方法观察肠上皮细胞增殖和凋亡的情况。结果 100μg／L LPS对细胞增殖和凋亡均有促进作用，200μmol/L H2O2可抑制肠上皮细胞增殖，促进凋亡。丫啶橙荧光染色见细胞核染色质致密浓染或裂解成碎片。预先经双歧杆菌分泌型粘附素处理后，LPS组细胞增殖和凋亡率均显著下降，H2O2组细胞凋亡明显减少。结论 在体外，双歧杆菌分泌型粘附素能抑制LPS和H2O2对肠上皮细胞的损害作用，维持肠上皮细胞增殖与凋亡的平衡。     

HR24L基因过表达抑制细胞凋亡

目的:研究人类DNA 损伤修复基因HR24L与细胞凋亡的关系.方法:PCR方法扩增HR24L基因开放阅读框序列,克隆入逆转录病毒载体pDOR-neo,转染HeLa细胞,筛选阳性克隆;Southern印迹验证HR24L基因的整合状况.Northern印迹检查HR24LmRNA的细胞内表达水平.过氧化氢、丁酸钠及血清饥饿诱导凋亡,流式细胞计数仪检测凋亡比例,电泳观察DNA Ladder,Western印迹检测凋亡相关蛋白质的表达.结果:获得转染有HR24L基因的HeLa细胞.与HeLa细胞相比,HeLa-HR24L细胞HR24LmRNA表达明显上升.HR24L基因过表达导致Bcl-2的表达升高,抑制caspase-3和Bax的表达,而对p53却无明显的影响.HR24L基因过表达抑制过氧化氢和血清饥饿诱导的细胞凋亡,但对丁酸钠诱导的细胞凋亡却无抑制作用.结论:HR24L基因过表达抑制细胞凋亡.     

熊果酸诱导胃癌细胞BGC-823凋亡机制的研究

目的:探讨熊果酸(UA)对胃癌细胞BGC-823增殖抑制和诱导凋亡的作用机制。方法:采用MTT法检测UA对BGC-823细胞的增殖抑制效应;用琼脂糖凝胶电泳观察DNA凋亡片段;流式细胞仪检测UA作用后BGC-823细胞的周期分布和凋亡率;用Fas单克隆抗体检测BGC-823细胞表面Fas的表达;Western blot检测BGC-823细胞Bcl-2的表达及caspase-3和caspase-8的活性。结果:UA对BGC-823细胞具有增殖抑制效应,并呈浓度和时间依赖性。UA作用24 h时半数抑制浓度(IC50)为43.10μmol/L。当UA浓度为50和60μmol/L时,琼脂糖凝胶电泳可呈现DNA凋亡梯带。随着UA浓度从20μmol/L递增到60μmol/L,周期检测发现BGC-823细胞出现亚G1峰逐步增高,S期阻滞增加,G1期下降。细胞内Bcl-2表达下降,caspase-3和caspase-8活性增加。BGC-823细胞表面未发现Fas的表达。结论:UA对BGC-823细胞有较强的增殖抑制和诱导凋亡作用,下调Bcl-2的表达及激活caspase-3、caspase-8可能是其诱导凋亡的机制。     

和厚朴酚对人宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨和厚朴酚抑制人宫颈癌Hela细胞增殖及诱导其凋亡的作用。方法利用MTT检测和厚朴酚在不同浓度和时间下对Hela细胞增殖的影响;用流式细胞术、Hoechst 33258荧光染色和DNA ladder检测和厚朴酚作用下Hela细胞的凋亡。结果MTT结果显示和厚朴酚可明显抑制Hela细胞的增殖,且抑制率存在剂量和时间依赖性;流式结果表明10μg/mL和20μg/mL和厚朴酚作用细胞24h后,凋亡细胞的比例分别为22.5%和62.2%,而对照组为8.7%;和厚朴酚处理过的Hela细胞,经Hoechst33258染色后细胞、细胞核出现明显的凋亡形态学变化,在DNA琼脂糖凝胶上可见特征性的梯状条带。结论和厚朴酚具有抑制Hela细胞增殖和诱导凋亡的作用。